Methodenartikel

Aardmagneetveld (Gmf) en Plant Evolutie: Onderzoek naar de effecten van Gmf Reversal op

14.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53286

⸱

30 november 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences and Systems Biology, University of Turin, 2Radcliffe Department of Medicine, University of Oxford, John Radcliffe Hospital

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methode om de hypothese te testen dat de omkering van het effectieve geomagnetische veld (GMF) differentiële genexpressie induceert en de morfologie van Arabidopsis thaliana verandert. Een triaxial octagonaal systeem van Helmholtz spoelparen werd gebruikt om kunstmatig omgekeerde GMF-condities in de plantengroeikamerber te genereren.

Samenvatting

Een van de meest stimulerende waarnemingen in plantaardige evolutie een correlatie bestaat tussen het optreden van aardmagnetische veld (GMF) omkeringen (of excursies) en het moment van de straling van Angiospermen. Dit leidde tot de hypothese dat veranderingen in GMF polariteit een rol Plantenevolutie kunnen spelen. Hier beschrijven we een methode om deze hypothese te testen door blootstelling van Arabidopsis thaliana kunstmatig omgekeerde GMF omstandigheden. We gebruikten een drie-assige magnetometer en de verzamelde gegevens werden gebruikt om de omvang van de GMF berekenen. Drie DC voedingen zijn aangesloten op drie paren Helmholtz spoel en onder controle van een computer om de GMF omstandigheden veranderen. Planten in Petri-platen werden blootgesteld aan normale en omgekeerde GMF omstandigheden. Sham blootstelling experimenten werden ook uitgevoerd. Blootgesteld planten werden gefotografeerd tijdens het experiment en de beelden werden geanalyseerd om wortel lengte en blad gebieden berekenen. Arabidopsis totale RNA werd geëxtraheerd en kwantitatieveReal Time-PCR (qPCR) analyses werden uitgevoerd op genexpressie van CRUCIFERIN 3 (CRU3), koper transport protein1 (COTP1), Redox Responsive transcriptie factor1 (RRTF1), Fe Superoxide Dismutase 1, (FSD1), Catalase3 (CAT3), Thylakoidal Ascorbaat Peroxidase (TAPX), een cytosolisch ascorbaat Peroxidase1 (APX1) en NADPH / respiratoire burst oxidase eiwit D (RbohD). Vier verschillende referentie genen werden geanalyseerd om de resultaten van de qPCR normaliseren. De beste van de vier genen werd geselecteerd en de meest stabiele gen voor normalisatie werd gebruikt. Onze gegevens tonen voor de eerste keer dat het omkeren van de GMF polariteit met drieassige spoelen heeft significante effecten op de groei van planten en genexpressie. Dit ondersteunt de hypothese dat GMF omkering bijdraagt ​​tot het induceren van veranderingen in plantenontwikkeling een hogere selectieve druk kunnen rechtvaardigen, uiteindelijk leidend tot plant evolutie.

Inleiding

Magnetisch veld van de aarde (of equivalent het aardmagnetisch veld, GMF) is een onontkoombare omgevingsfactor voor alle organismen die op de planeet, met inbegrip van planten. De GMF is altijd al een natuurlijke eigenschap van de aarde, dus gedurende de evolutie, alle levende organismen ervaren haar optreden. Een toenemende hoeveelheid bewijsmateriaal blijkt dat de GMF is in staat om veel biologische processen 1 beïnvloeden. Het GMF is niet uniform en er aanzienlijke lokale verschillen in de grootte en richting aan het oppervlak van de aarde. De GMF aan het aardoppervlak toont een groot aantal grootheden, van minder dan 30 pT tot bijna 70 pT. De GMF beschermt de aarde en de biosfeer van de dodelijke gevolgen van de zonnewind door het afbuigen van de meeste van zijn geladen deeltjes door de magnetosfeer 2.

Planten reageren op prikkels uit de omgeving; en klassieke reacties op abiotische factoren zoals licht en zwaartekracht zijn t geweesthoroughly beschreven door het definiëren van de zogenaamde phototropic en gravitropic reacties. Zeer weinig of niets bekend is over de mechanismen van de waarneming en reacties van planten aan magnetische velden, ondanks de overvloed aan artikelen gepubliceerd over dit onderwerp en onlangs beoordeeld 1. In tegenstelling tot het gravitatieveld, de GMF veranderde voortdurend tijdens fabriek evolutie daarbij een belangrijke abiotische stressfactor die is onlangs beschouwd als een potentiële drijvende kracht uiteindelijk bijdragen aan diversificatie en soortvorming 2 planten vertegenwoordigen. Geomagnetische omkeringen (of excursies) zijn veranderingen in de polariteit van de GMF. Tijdens het leven-geschiedenis van de aarde, GMF omkeringen opgetreden meerdere malen. Deze blootgesteld de planeet om periodes van verminderde GMF kracht bij elke polariteit overgang. Sommige auteurs hebben de hypothese dat deze overgangen bij slecht GMF sterkte zou hebben toegestaan ​​ioniserende straling van de zon wind naar het aardoppervlak bereikt, waardoor een inducerendconsistente stress levende organismen die sterk genoeg is om gen uiteindelijk veranderingen induceren leidend tot ontwikkeling 2 planten kunnen zijn.

Een gedetailleerde analyse van experimenten beschrijven de effecten van magnetische velden op planten toont een groot aantal tegenstrijdige rapporten, gekenmerkt door een gebrek aan aannemelijke biofysische interactie mechanismen. Veel experimenten zijn gewoon niet realistisch, terwijl anderen gebrek aan een toetsbare hypothese, en uiteindelijk zijn niet overtuigend 3. In de afgelopen jaren is de voortgang en status van het onderzoek naar het effect van magnetische velden op planten werd beoordeeld 2,4-11. Onlangs is het effect van zowel lage als hoge magnetische veld is grondig besproken 1, met bijzondere aandacht voor de betrokkenheid van de GMF omkering gebeurtenissen op plantaardige evolutie 2.

De meest directe manier om de hypothese onderbouwen dat GMF omkeringen invloed fabriek evolutie is om een ​​GMF synthetiserenomkering in het laboratorium door het testen van de respons van planten op normale en omgekeerde magnetisch veld condities. Om de hypothese te testen, dus bouwden we een drieassige achthoekige Helmholtz spoel-paren magnetisch veld compensatiesysteem (triaxiaal coils), die in staat is om nauwkeurig te keren de normale GMF omstandigheden.

We gebruikten Arabidopsis thaliana als modelplant en het effect van omgekeerde GMF op genexpressie van enkele belangrijke genen getest: CRUCIFERIN 3 (CRU3), dat een 12S zaadopslageiwit dat tyrosine-gefosforyleerd en fosforyleringstoestand gemoduleerd in reactie codeert ABA in Arabidopsis thaliana zaden 12,13; de Copper Transport Protein1 (COTP1), dat een zwaar metaal transport / ontgifting superfamilie eiwit met de overheersende functie in de bodem Cu acquisitie en pollen ontwikkeling 14 codeert; en Redox Responsive transcriptie factor1 (RRTF1),dat codeert voor een lid van het ERF (ethyleen responsfactor) subfamilie B-3 van ERF / AP2 transcriptiefactor familie die een AP2-domein dat de synergetische co-activatie van genexpressie pathways vergemakkelijken en verlenen kruis tolerantie voor abiotische en biotische benadrukt 15 bevat.

Bovendien hebben we ook geanalyseerd vijf genen betrokken bij oxidatieve stress responsen: Fe Superoxide Dismutase1, (FSD1), dat een cytoplasmatisch enzym dat enzymatisch en snel zet het superoxide anion codeert (O 2 -) en water (H2O) waterstofperoxide (H 2 O 2) en moleculaire zuurstof (O 2) 16; Catalase3 (CAT3), dat codeert en enzymen die de afbraak van H 2 O 2 katalyseert in water en zuurstof 17,18; Thylakoidal ascorbaatperoxidase (TAPX), dat codeert voor chloroplastische thylakoid peroxidase dat scavenges H 2 O2 19; Ascorbaat Peroxidase1 (APX1), die een cytosolisch peroxidase dat scavenges H 2 O 2 en is een van de mogelijke doelwitten van posttranslationele modificaties gemedieerd door NO-afgeleide moleculen 20 codeert; en NADPH- Respiratory burst oxidase-eiwit D (RbohD) die een enzym dat codeert genereert O 2 - en speelt een centrale rol in het reguleren van groei, ontwikkeling en stress responsen in Arabidopsis 21.

Onze field-reversal methodologie biedt het eerste bewijs dat GMF omkering van een significante verandering in de morfologie en genexpressie van A. kan induceren thaliana wortels en scheuten. Dit protocol verschaft een innovatieve manier om het effect van GMF omkering op plantenmorfologie en genexpressie evalueren en kan worden gebruikt om het potentiële effect van GMF omkering andere aspecten van plantaardige rijgedrag en daardoor leiden bespreking van de role van GMF omkering op plantaardige evolutie.

Protocol

1. Vaststelling van de Triaxial Coils

Opmerking: Figuur 1 toont de triaxiale spoelen gebruikt om de GMF keren.

  1. Zet de drie-assige magnetometer, waarvan de voeler in de triaxiale spoelen is geplaatst.
  2. Zet de computer en start de magnetometer software waarmee gegevens worden verzameld uit drie-assige magnetometer.
  3. Gebruik de componentwaarden die door de magnetometer om de omvang van de GMF berekenen. Bijvoorbeeld met magnetometer waarden: Bx = 6,39 pT, Door = 36,08 pT, Bz = 20,40 pT berekenen een veldsterkte van 41,94 pT met behulp van de volgende vergelijking: B = B GMF + B extra, waarbij meer B = (Bx 2 + Door 2 + Bz 2) ½ (dwz 41,9 pT in het voorbeeld).
  4. Zet de drie DC-voedingen (dual range: 0-8V / 5A en 0-20V / 2.5A, 50W) elk verbonden met drie couples Helmholtz spoelen en verbonden met een computer via een verbinding GPIB (Figuur 1B).
  5. Set spanningen van de voedingen op de gewenste magnetische veld met een omgekeerde magnetisch veld vector te genereren. Bijvoorbeeld met B GMF zoals in stap 1,3 en de omvang spoel van de hier beschreven instrumentatie, stellen de spanningen V x = 0,00 V, V y = 30,52 V, V z = 0,00 V om een nieuw resulterende B genereren = B + B GMF triaxiale spoelen = (6,38, -36,08, 20,39) pT. dwz een nieuw veld met dezelfde grootte als B GMF, maar wijst naar een andere richting.
  6. Controleer de nieuwe veld met de magnetometer software met behulp van de in 1.3 beschreven procedure.
  7. Expose planten om normale en omgekeerd GMF omstandigheden met behulp van Petri platen zoals beschreven in paragraaf 2.
  8. Voer sham blootstellingexperimenten door het houden van de omvang van het veld gelijk is aan | B GMF | en houdende verticale component van het veld gelijk is aan die van de GMF maar veranderen van de richting (dwz "noord, oost en west ') van de horizontale component van het veld met gelijke stromen in de spoelen triaxiale opzichte van het veld omkering toestand. Doe dit door het veranderen van de spanning van de spoelen zoals beschreven in 1.5.
    Opmerking: Deze schijnvertoning blootstelling regels van potentiële subtiele verwarmen of vibrerende effecten van zowel de spoelen zelf of van de elektronica gebruikt om de rollen te controleren.
  9. Run dubbelblinde experimenten door toepassing veldomstandigheden verblind het personeel dat de rest van de experimenten en / of interpretatie van de gegevens.

2. bereiding van plantaardige materialen en omstandigheden voor plantengroei

  1. Gebruik zaden van Arabidopsis thaliana ecotype Columbia 0 (Col 0) en plaats in een 1,5 ml buis oppervlak steriliseren door behandeling met een 5% (w / v) calciumhypochloriet oplossing en 0,02% (v / v) Triton X-100 in 80% ethanol (EtOH), gedurende 10-12 min bij 25-28 ° C, onder voortdurend schudden. Spoel vervolgens tweemaal met 80% EtOH, wassen met 100% EtOH en tenslotte spoelen met steriel gedestilleerd water.
  2. Bereid 1 liter Murashige en Skoog 22 (MS) gemodificeerd medium door toevoeging van: 2,297 g MS (0,5 x MS Basale Salt Mixture), 10 g sucrose, gedemineraliseerd water tot 1 l, pH 5,8-6,0 bijgesteld met KOH. Voeg 16 g agar en autoclaaf gedurende 20 min, 120 ° C.
  3. Voordat stollen, giet 80 ml ​​medium in elk (120 x 120 mm 2) vierkante Petri platen. Zaai dertig steriele zaden op de plaat, en dan verzegelen platen met een wasachtige film.
  4. Vernalize de platen horizontaal in het donker bij 4 ° C gedurende 2 dagen te potentiëren en synchroniseren van kieming en vervolgens Petri platen bloot aan normale of omgekeerde GMF.
  5. Expose zaden in een klimaat gecontroleerde omgeving bij 22 ° C verticaal parallel experimenten zowel binnen de triaxiale spoelen en buiten de triaxiale coilsonder een fotoperiode schema van 8 uur duisternis en 16 uur licht, met behulp van natrium damp lampen (220 x 10 -6 E m -2 s -1). Gebruik een blauwe gelatine film voor spotlight naar de rode component van de lampen te verminderen.
  6. Expose planten gedurende 10 dagen voor de RNA-extractie van zowel normale (controle) en omkering (behandeling) GMF voorwaarden.
  7. Na blootstelling, foto's van petrischaaltjes nemen.
  8. Gebruik de ImageJ software om wortel lengte en blad gebieden berekenen.
    1. In het kort, het meten van de kant van de Petri plaat, open dan het beeld van de Petri plaat en met behulp van de "straight" lijn optie om een ​​lijn die precies kruist de plaat kant te trekken.
    2. In het menu "analyseren" kies je 'scale "en steek de werkelijke afstand in het vak" bekende afstand "(bv 120 mm), steek dan de eenheid van lengte (mm); eindelijk klik op de "wereldwijde" optie om de instellingen voor alle metingen te verrichten.
    3. Voor Root lengte, volg de vorm van de wortel met behulp van de vrije hand tool. Meet de lengte met behulp van de "maatregel" optie in het "analyseren" menu. Blijven alle wortels in het beeld te meten en sla het bestand voor verdere statistische analyses.
    4. Voor blad gebied, in het menu "image" gebruik maken van de optie aan te passen en vervolgens op "kleur drempel". Selecteer de individuele blad en in het menu "analyseren" selecteren "te analyseren deeltjes". Sla de afzonderlijke metingen voor statistische analyses.

3. Arabidopsis Total RNA Extraction, kwantitatieve Real Time-PCR (qPCR) Reactie Voorwaarden en primers voor het Arabidopsis

  1. Verzamel afzonderlijk 30 scheuten en 30 wortels en onmiddellijk te bevriezen in vloeibare stikstof. Vervolgens vermalen in vloeibare stikstof met een vijzel en stamper.
  2. Isoleer totaal RNA met behulp van een zuivering kit en RNase-Free DNase behandeling kit met behulp van fabrikanteninstructies er's.
  3. Controleer monster kwaliteit en kwantiteit door een RNA nano kit en capillaire gelelektroforese volgens de instructies van de fabrikant. Bevestig de kwantificering van RNA spectrofotometrisch.
  4. Gebruik 2 ug totaal RNA en willekeurige primers met behulp van een cDNA Reverse Transcription Kit voor eerste streng cDNA te verkrijgen volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
  5. Voer alle experimenten op een real-time systeem met behulp van SYBR green I met ROX als een interne belasting standaard.
  6. Voer de reactie met 25 ul van het mengsel bestaande uit 12,5 ul 2x SYBR Green qPCR Master Mix, 0,5 pi cDNA en 100 nM primers. Met de in tabel 1 vermelde primers. Include controles non-RT controles (zonder gebruik van totaal RNA reverse transcriptie controleren op genomisch DNA contaminatie) en non-template controles (water in plaats van template).
  7. Bereken primer efficiëntie voor alle primers paren met behulp van de standaardcurve methode 23.
  8. Gebruik de volgende PCR voorwaarden: CRU3, COTP1, RRTF1. 10 min bij 95 ° C, 40 cycli van 15 s bij 95 ° C, 30 sec bij 58 ° C en 30 sec bij 72 ° C; UBP6, eEF1Balpha2, ACT1, GAPC2, CAT3, TAPX, APX1, RbohD, FeSOD1 10 min bij 95 ° C, 40 cycli van 15 s bij 95 ° C, 20 sec bij 57 ° C en 30 sec bij 72 ° C.
  9. Lees fluorescentie na elke gloeien en extensie fase. Voor alle runs, uitvoeren van een smeltcurve analyse 55-95 ° C door op de dissociatie segment in het thermisch profiel. Gebruik dissociatiecurve scherm, toegankelijk via de tab resultaten aan de dissociatie profiel (grafiek van de fluorescentie als een functie van de temperatuur) te bekijken. Zorg ervoor dat de tijdens de dissociatie segment van het experiment verzamelde dataset is geselecteerd voor analyse met behulp van het scherm Analyse / Setup.
  10. Bepaal de linear reeks template concentratie drempelcyclus waarde (Ct-waarde) door het uitvoeren van een tienvoudige verdunningsserie (1- tot 10-voudige 3) via drie onafhankelijke cDNA uit RNA extracties in drie technische replicaten 24,25 geanalyseerd.
  11. Analyseren van alle versterking percelen met de real-time PCR-instrument software om Ct-waarden te verkrijgen. Kalibreren en normaliseren relatieve RNA levels met het niveau van de beste housekeeping genen als volgt: 3.11.1) Toegang tot de Amplification Plots scherm via de tab Resultaten, selecteer het platform of plateau waarvoor gegevens moeten worden geanalyseerd met behulp van het scherm Analysis Selectie / Setup, en selecteer vervolgens de DRN (basislijn-gecorrigeerde genormaliseerde fluorescentie) van de Fluorescentie menu op het commando paneel. Toegang tot de Sample Waarden scherm Plate via het tabblad Resultaten om Ct-waarden voor de bemonsterde putten weer te geven.
  12. Met vier referentie-genen [bv cytoplasmatische glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPC2), ubiquitine specific protease 6 (UBP6), Actin1 (ACT1) en de verlengingsfactor 1B alfa-subeenheid 2 (eEF1Balpha2)] om de resultaten van de real time PCR normaliseren. Selecteer de top gerangschikt gen met behulp van een analyse software 26; en gebruik de meest stabiele gen voor normalisatie.
    1. Kortom, het organiseren van de input gegevens op een Excel-sheet met de eerste kolom dat het gen bevat namen en de eerste rij met de monster namen. Selecteer vervolgens de analyse software van het menu-balk. Gebruik het dialoogvenster om de invoergegevens te selecteren.
    2. Controleer vervolgens de velden Sample namen, gen namen en eenvoudige uitgang alleen. Klik op de toets Go om de analyse uit te voeren. Selecteer de top gerangschikt gen als kandidaat-gen meest stabiel tot expressie (die de kleinste stabiliteit waarde heeft).
  13. Plot gegevens door te laten zien het differentieel voudige verandering meningsuiting in zowel scheuten en wortels.

4. Statistische analyses

  1. Versneld gegevens als gemiddelde waarden ± standaard fout. Vergelijk de control en de behandeling groepen door het uitvoeren van analyse van de variantie (ANOVA) en Tukey's test met Bonferroni en Dunn-Sidak Adjusted Probability-test (0,95% vertrouwen).

Resultaten

Het doel van dit protocol is een werkwijze om te beoordelen of omkering van het aardmagnetisch veld (GMF) plantenontwikkeling en genexpressie van Arabidopsis thaliana ecotype Col 0. Triaxial spoelen kunnen beïnvloeden zoals getoond in figuur 1A wordt gebruikt om de GMF bij set reverse met de geschikte aanstuurspanningen (Figuur 1B), verkregen zoals beschreven in stap 1.5 in het protocol. De afmetingen van de triaxiale spoelen ~ 2 x 2 x 2 m 3, die voldoende ruimte met omgekeerde GMF voorwaarden meerdere petrischalen systeem toegestaan. Controles werden gekweekt in dezelfde omgevingsomstandigheden en bij normale GMF waarden. Na 10 dagen blootstelling aan normale en omgekeerde GMF omstandigheden, het fenotype van de planten vertoonden duidelijke morfologische veranderingen. Zoals getoond in figuur 2, controleplanten (bijv gekweekt onder normale omstandigheden GMF) vertoonde wortel lengtes met significant (Dunn-Sidak en Bonferroni aangepast Prob <0,001;Student's t = 10,68, df = 31) hogere waarden (29,41 mm; SEM = 1,04; N = 32) ten opzichte van planten blootgesteld aan omgekeerde GMF (17,53 mm; SEM = 0,58; N = 36). In GMF-omgekeerd planten, werd de morfologie van scheuten ook veranderd door het tonen van een verminderde ontwikkeling van de bijsluiter expansie. Planten blootgesteld aan normale omstandigheden toonde een gemiddelde bladoppervlak van 4,95 mm 2 (SEM 0,025, N = 54), terwijl planten blootgesteld aan teruggedraaid GMF omstandigheden aanzienlijk toonden (Dunn-Sidak en Bonferroni Gecorrigeerd Vraagstuk = <0,001; student t = 31,32, df = 53) lager bladoppervlak-waarden (3,71 mm 2; SEM = 0,032; N = 54). Daarom is de blootstelling van Arabidopsis om teruggedraaid GMF omstandigheden leidden tot een daling van zowel de wortel lengte en bladoppervlak.

Bladexpansie en wortelgroei zijn afhankelijk van zowel de divisie en de rek van de cellen 27. Daarom is de ontwikkeling van planten, de productiviteit en de algehele conditie zijn afhankelijk van een optimale shoot-en wortel-systeemarchitectuur 28. De gereduceerde wortellengte en bladgrootte van planten blootgesteld aan omgekeerde GMF omstandigheden de aanwezigheid van een aftastsysteem kunnen niet alleen variaties in magnetische veldsterkte waarnemen, maar ook te reageren op veranderingen in het magnetisch veld "richting" in vergelijking met de zwaartekracht. De hypothese dat GMF omkering plantengroei kan beïnvloeden vindt overtuigend bewijs in onze experimenten, die aantonen dat GMF omkering voorwaarden aanzienlijk kunnen invloed hebben op de ontwikkeling van planten.

De morfologische veranderingen werden ook gepaard met veranderingen in genexpressie. Onder huishouding genen, de meest stabiele gen was verlengingsfactor 1B alfa-subeenheid 2. De eerste groep genen (CRU3, COTP1, RRTF1) vertoonden een dramatische verandering in de genexpressie (figuur 3). Schieten expressie van drie genen aanzienlijk hoger (P <0,05) met ongeveer 2,5-voudig in planten blootgesteld aan reserved GMF omstandigheden. Root expressie van CRU3 werd opgereguleerd in de wortels van planten blootgesteld aan normale GMF omstandigheden, maar was significant (P <0,05) downregulated in omgekeerde GMF omstandigheden. Het tegenovergestelde gevonden voor COTP1 en RRTF1, die zijn downgereguleerd in normale omstandigheden en opgereguleerd in aanwezigheid van GMF omkering (figuur 3).

Cruciferin (a 12 S globuline) is de meest voorkomende opslageiwit in de zaden van A. thaliana en andere kruisbloemigen en wordt gesynthetiseerd als een voorloper in de ruwe endoplasmatisch reticulum. Vervolgens wordt het eiwit opslag vacuolen 13 getransporteerd. Seedling kieming moet de afbraak van cruciferin, die wordt gebruikt als een initiële stikstofbron. Down-regulatie van cruciferin degradatie vermindert embryo ontwikkeling door afbreuk celstructuren of mobiele componenten ontwikkeling 29,30. Onze resultaten tonen aan dat opregulatie van CRU3 correleert meteen lagere bladexpansie en een verminderde lengte wortel, daarmee aangevend dat dit gen gevoelig voor GMF omkering en dat de overexpressie kan bijdragen tot de vermindering van de plantontwikkeling. Bovendien GMF omkering leidt tot een significante downregulatie van CRU3 in wortels, die correleert met een verminderde lengte wortel. Koper is een essentiële cofactor voor belangrijke processen in planten, maar het oefent schadelijke effecten toen hoger; dus overexpressie koper transport compromissen plantengroei. Het effect van GMF omkering was een significante overexpressie van COTP1 zowel scheuten en wortels, hetgeen de verminderde plantengroei leggen. Ion spanning belemmert chloroplast metabolisme, die strak verbonden is met de redox status van de cel. In Arabidopsis de transcriptiefactor RRTF1 is belangrijk voor de expressie van genen geassocieerd met het vermogen aan te passen aan veranderingen redox 31. Daarom, wanneer planten worden blootgesteld aan externe stimuli kunnen de fysiologische en ontwikkeling veranderenal s een overexpressie van deze belangrijke transcriptiefactor verwacht. Omkering van de GMF veroorzaakte een significante overexpressie van RRTF1 zowel scheuten en wortels, hetgeen wijst op een hogere oxidatieve stress respons van planten om omgekeerd GMF voorwaarden.

Interessante resultaten worden verkregen door analyse van de vijf genen betrokken bij oxidatieve stress. Algemeen heeft alle genen geëxtraheerd en geanalyseerd scheuten geen significante verschillen (P> 0,05) als de planten werden gekweekt in normale of omgekeerde GMF omstandigheden (figuur 4 en figuur 5) vertonen. Er werd echter een aanzienlijke neerwaartse regulatie altijd waargenomen in wortels van planten blootgesteld aan omgekeerde GMF omstandigheden. Vooral CAT3 toonde de hoogste neerwaartse regulatie (figuur 5), in volgorde van neerregulatie van APX1, FSD1, RBOHD en TAPX (figuur 4).

Cross tolerantie voor eenbiotische en abiotische stress door de activering van verschillende genen betrokken bij verschillende biochemische routes. RRTF1 transcriptiefactor vergemakkelijkt de synergetische co-activatie van genexpressie van deze trajecten 15,31 en kan mogelijk worden betrokken bij oxidatieve stress 32. Derhalve is opregulatie van RRTF1 verwacht indien zuurstofwegvangende wordt verminderd. Downregulatie wortel wegvangende enzymen correleert de opregulatie van RRTF1, die werkt bij toenemende oxidatieve stress. De dramatische wortel downregulatie van CAT3, APX1 en TAPX geeft het verminderd vermogen van wortelcellen H 2 O 2, wat gepaard gaat met het verminderde vermogen tot het superoxide anion dismutate door downregulatie van FSD1 vangen. De oxidatieve stress respons is hoger in wortels, die lijken op de belangrijkste plaats van omgekeerd GMF waarneming.

figure-results-1
Figuur 1. aardmagneetveld Compensatie systeem. (A) triaxiale spoelen (omvattende een paar achthoekige spoelen voor elk van de drie loodrechte assen) om het aardmagneetveld vector keren. (B) een computergestuurde voeding is verbonden met elk paar Helmholtz-spoelen. (Spanningen in deze cijfers zijn willekeurig) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. Effecten van geomagnetische veld omkering op Arabidopsis morfologie. Na tien dagen blootstelling, controleplanten (dat wil zeggen, degenen die met normale omstandigheden GMF) een significant grotere wortellengte en expanded folders vergeleken met planten die waren blootgesteld aan omgekeerde GMF omstandigheden. Metric bar = 18 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3. Effecten van geomagnetische veld omkering op Arabidopsis genexpressie. Na tien dagen blootstelling werd totaal RNA van controle en behandelde planten geëxtraheerd en door Real-Time PCR geanalyseerd op expressie analyse. Het effect van de omkering van de GMF was om een drastische verandering in de genexpressie van genen die CRU3, Cruciferin 3 werden getest veroorzaken;. COTP1, Copper Transport Protein1; RRTF1, Redox Responsive transcriptie factor1. Balken geven standaardfout; sterretjes geeft significant (p <0,05) verschillen tussen de plmieren blootgesteld aan omgekeerde en normale GMF voorwaarden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4. Effecten van geomagnetische veld omkering op Arabidopsis-antioxidant-gerelateerde genexpressie. Na tien dagen blootstelling wordt totaal RNA van controle en behandelde planten geïsoleerd en gebruikt voor genexpressie analyse met Real-Time PCR. Het effect van omkering van de GMF was geen significante veranderingen in shoot genexpressie induceren; werd echter een drastische downregulatie waargenomen in de root genexpressie van planten onder omgekeerde GMF omstandigheden gegroeid TAPX, Thylakoidal Ascorbate Peroxidase;. APX1, Ascorbate Peroxidase1; FSD1, Fe Superoxide Dismutase1; RbohD, NA. DPH / Respiratory burst oxidase eiwit D Bars geven standaardafwijking; sterretjes geeft significant (p <0,05) verschillen tussen de planten blootgesteld aan teruggedraaid en de normale GMF voorwaarden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5. Effecten van het aardmagnetisch veld omkering op Arabidopsis Catalase 3 (CAT3) genexpressie. Na tien dagen blootstelling wordt totaal RNA van controle en behandelde planten geïsoleerd en gebruikt voor genexpressie analyse met Real-Time PCR. Het effect van omkering van de GMF was geen significante veranderingen in shoot genexpressie induceren; werd echter een drastische downregulatie waargenomen in de root genexpressie van planten onder omgekeerde GMF omstandigheden geteeld. Balken geven standaard error; sterretjes geeft significant (p <0,05) verschillen tussen de planten blootgesteld aan teruggedraaid en de normale GMF voorwaarden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

We hebben onlangs bleek dat een verbazingwekkende correlatie bestaat tussen GMF omkeringen en het tijdstip waarop omleiding van de meeste van de familiale Angiosperm lijnen plaatsgevonden 2. Ondanks de stimulerende hypothesen en de overvloed van studies naar het effect van uiteenlopende intensiteiten GMF, de aanname dat GMF reversal kunnen zich aanzienlijke veranderingen in genexpressie in planten en morfologie te induceren is nooit aangetoond. Hier tonen wij voor het eerst een methode die een triaxiale achthoekige Helmholtz spoel gebruikt om GMF keren in ons laboratorium, en dat de omkering van de omgevingslucht magnetisch veld fenotypische veranderingen en modulatie van genexpressie in planten kan leiden.

Om GMF omkering (of modificatie) over een toereikend voor plantengroei experimenten (2 x 2 x 2 m 3) te verkrijgen, bouwden we een achthoekige Helmholtz spoelsysteem. Dit systeem is niet in de handel verkrijgbaar (meestal Helmholtz spoelen ringvormige en kleiner)en de kosten voor de bouw waren aanzienlijk. Belangrijker nog, dit systeem levert robuuste veld wijziging, met een uitzonderlijke tijd-stabiliteit en homogeniteit in de gemodificeerde magnetische velden.

Het systeem is ontworpen en gebouwd om de waarde van de GMF tot een duizendste van de normale of voor één van de drie dimensies van het magneetveld omgekeerd. Echter, het ontwerp van de spoelen niet mogelijk om een ​​hoge magnetische veldsterkte opwekken. Daarom is dit instrument de huidige vorm is niet geschikt voor experimenten ontworpen om het effect van hoge magnetische veldsterkte op planten of andere organismen.

In het laboratorium, is verandering van de GMF vergelijkbaar met die beschreven in deze methode verkregen door verschillende methoden, zoals door afscherming rond de experimentele zone van ferromagnetische metalen platen met een hoge magnetische permeabiliteit, die een magnetisch veld afwijken concentreren deze binnen het metaal zelf. The voordeel van Helmholtz spoelen is dat het systeem waarmee planten worden blootgesteld aan meer natuurlijke omstandigheden (licht, luchtcirculatie, etc.), waardoor het niet alleen ideaal in vitro studies (zoals bij gebruik van petrischalen), maar ook in vivo plantengroei en ontwikkeling experimenten. De afmetingen van ons systeem te creëren een ruimte die een onderdrukking tot <1/1000 van de natuurlijke GMF maakt gedurende een 25 x 25 x 25 cm 3 bolvormige volume (zie figuur 1A), waardoor een aantal Petri platen of enkele kleine hosten potten voor plantengroei.

De hier gepresenteerde methode is toegepast op planten biologisch onderzoek; echter, het systeem kan een groot aantal experimenten, waaronder virologie en microbiologie, alsmede studies over nematoden (bijvoorbeeld Caenorhabditis elegans), geleedpotigen en kleine dieren (zoals muizen en ratten). Daarom is het testen van de hypothese dat de omkering van de GMF staatinduceren morfologische en transcriptionele veranderingen kunnen ook worden uitgebreid tot veel andere levende systemen, misschien uiteindelijk zelfs menselijke cellen.

De GMF verandert voortdurend en schommelt. Daarom, in onze experimenten een grote uitdaging om een ​​constante beloning van de GMF verstrekken om de gewenste nieuwe GMF waarden te verkrijgen. Dit kan alleen worden bereikt door een continue controle van magnetische velden waarden door het lezen van magnetometer waarden spanningscompensatie. Daarom kan het systeem de langzaam variërende gedeelte van de GMF compenseren maar het doet niets voor hogere frequentie fluctuaties.

Concluderend, het gebruik van triaxiale spoelen de GMF vector keren was instrumenteel aantonen dat deze omkering van de GMF vector kan planten morfologische veranderingen en differentiële genexpressie induceren. De verkregen met de gepresenteerde methode resultaten geven een overtuigend bewijs ter ondersteuning van de hypothese dat de GMF reversals zou kunnen zijn een van de drijvende krachten voor de plantaardige evolutie geologische tijdschalen 2.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door een subsidie aan MEM van de Afdeling Levenswetenschappen en Systeembiologie van de Universiteit van Turijn, Italië. De auteurs danken G. Gnavi voor de technische assistentie tijdens enkele experimenten. CTR wordt gefinancierd door de Wellcome Trust en de Royal Society (subsidienummer 098436/Z/12/Z).

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Three-axis magnetometerBartington Mag-03MCtriaxial fluxgate magnetometer
Magnetometer power supplyBartington Mag-03PSUtriaxial fluxgate magnetometer
Magnetometer softwareBartington Mag03DAMtriaxial fluxgate magnetometer
DC power supply Agilent TechnologiesE3642A
Calcium hypochlorite Sigma211389
Triton X-100 SigmaX100 
Ethanol Sigma2860
GroLux Sodium vapor lamps OSRAM Sylvania600W
RNeasy Plant RNA kit Qiagen74903
RNase-Free DNase Qiagen79254
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2938B
NanoDrop ND-1000 Thermo Fisher Scientificniet beschikbaar
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems4368813
Mx3000PAgilent Technologies401512
2x MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix Fermentas International, IncK0221
ParafilmSigmaP7793-1EA
Murashige and Skoog Basal MediumSigmaM5519 
Petri dish square (120 x120 mm2)SigmaZ692344 
```

Referenties

  1. Maffei, M. E. Magnetic field effects on plant growth, development, and evolution. Front. Plant Sci. 5, (2014).
  2. Occhipinti, A., De Santis, A., Maffei, M. E. Magnetoreception: an unavoidable step for plant evolution. Trends Plant Sci. 19 (1), 1-4 (2014).
  3. Harris, S. R., et al. Effect of magnetic fields on cryptochrome-dependent responses in Arabidopsis thaliana. J. Royal Soc. Interf. 6 (41), 1193-1205 (2009).
  4. Phirke, P. S., Kubde, A. B., Umbarkar, S. P. The influence of magnetic field on plant growth. Seed Sci. Technol. 24 (2), 375-392 (1996).
  5. Abe, K., Fujii, N., Mogi, I., Motokawa, M., Takahashi, H. Effect of a high magnetic field on plant. Biol. Sci. Space. 11, 240-247 (1997).
  6. Volpe, P. Interactions of zero-frequency and oscillating magnetic fields with biostructures and biosystems. Photochem. Photobiol. Sci. 2 (6), 637-648 (2003).
  7. Belyavskaya, N. A. Biological effects due to weak magnetic field on plants. Adv. Space. Res. 34 (7), 1566-1574 (2004).
  8. Weber Bittl, R., S, Transient radical pairs studied by time-resolved EPR. Biochim. Biophys. Acta- Bioenerg. 1707 (1), 117-126 (2005).
  9. Pazur Galland, P., A, Magnetoreception in plants. J. Plant Res. 118 (6), 371-389 (2005).
  10. Minorsky, P. V. Do geomagnetic variations affect plant function. J. Atm. Solar-Terrestr. Phys. 69 (14), 1770-1774 (2007).
  11. Burda Vanderstraeten, J., H, Does magnetoreception mediate biological effects of power-frequency magnetic fields. Sci. Tot. Environ. 417, 299-304 (2012).
  12. Job, C., Rajjou, L., Lovigny, Y., Belghazi, M., Job, D. Patterns of protein oxidation in Arabidopsis seeds and during germination. Plant Physiol. 138 (2), 790-802 (2005).
  13. Wan, L. L., Ross, A. R. S., Yang, J. Y., Hegedus, D. D., Kermode, A. R. Phosphorylation of the 12 S globulin cruciferin in wild-type and abi1-1 mutant Arabidopsis thaliana (thalecress) seeds.. Biochem J. 404, 247-256 (2007).
  14. Sancenon, V., Puig, S., Mira, H., Thiele, D. J., Penarrubia, L. Identification of a copper transporter family in Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 51 (4), 577-587 (2003).
  15. Foyer, C. H., Karpinska, B., Krupinska, K. The functions of Whirly1 and Redox-Responsive Transcription Factor 1 in cross tolerance responses in plants: A hypothesis. Philos.Trans.Royal Soc.B-Biol.Sci. 369 (1640), 20130226(2014).
  16. Myouga, F., et al. A heterocomplex of iron superoxide dismutases defends chloroplast nucleoids against oxidative stress and is essential for chloroplast development in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (11), 3148-3162 (2008).
  17. Mhamdi, A., Queval, G., Chaouch, S., Vanderauwera, S., Van Breusegem, F., Noctor, G. Catalase function in plants: a focus on Arabidopsis mutants as stress-mimic models. J. Exper. Bot. 61 (15), 4197-4220 (2010).
  18. Bassham Contento, A. L., C, D. Increase in catalase-3 activity as a response to use of alternative catabolic substrates during sucrose starvation. Plant Physiol. Biochem. 48 (4), 232-238 (2010).
  19. Kangasjarvi, S., et al. Diverse roles for chloroplast stromal and thylakoid-bound ascorbate peroxidases in plant stress responses. Biochem. J. 412, 275-285 (2008).
  20. Begara-Morales, J. C., et al. Dual regulation of cytosolic ascorbate peroxidase (APX) by tyrosine nitration and S-nitrosylation. J. Exper. Bot. 65 (2), 527-538 (2014).
  21. Li, N., et al. AtrbohD and AtrbohF negatively regulate lateral root development by changing the localized accumulation of superoxide in primary roots of Arabidopsis. Planta. 241 (3), 591-602 (2014).
  22. Skoog Murashige, T., F, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962).
  23. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nuc. Acids Res. 29 (9), (2001).
  24. Bustin, S. A., et al. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clin. Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  25. Phillips, M. A., D'Auria, J. C., Luck, K., Gershenzon, J. Evaluation of candidate reference genes for real-time quantitative PCR of plant samples using purified cDNA as template. Plant Mol. Biol. Rep. 27 (3), 407-416 (2009).
  26. Andersen, C. L., Jensen, J. L., Orntoft, T. F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: A model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Cancer Res. 64 (15), 5245-5250 (2004).
  27. Tsukaya, H. Developmental genetics of leaf morphogenesis in dicotyledonous plants. J. Plant Res. 108 (1092), 407-416 (1995).
  28. Szymanowska-Pulka, J. Form matters: morphological aspects of lateral root development. Ann. Bot. 112 (9), 1643-1654 (2013).
  29. Black Bewley, J. D., Seeds, M. Physiology of development and germination. , Plenum Press. New York. (1994).
  30. Kato-Noguchi, H., Ota, K., Kujime, H., Ogawa, M. Effects of momilactone on the protein expression in Arabidopsis germination. Weed Biol. Manage. 13 (1), (2013).
  31. Khandelwal, A., Elvitigala, T., Ghosh, B., Quatrano, R. S. Arabidopsis transcriptome reveals control circuits regulating redox homeostasis and the role of an AP2 transcription factor. Plant Physiol. 148 (4), 2050-2058 (2008).
  32. Haddad, J. J. Oxygen-sensing mechanisms and the regulation of redox-responsive transcription factors in development and pathophysiology. Respirat. Res. 3 (1), (2002).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Omkering van het geomagnetisch veldHelmholtz spoelenanalyse van genexpressiemeting van plantengroeikwantitatieve real time PCRanalyse van wortellengtemeting van bladoppervlakteblootstelling aan magnetische veldennormalisatie van referentiegenen

Gerelateerde artikelen