Hier stellen we een strategie voor om het effect van een transcriptiefactor van belang op het microRNA-transcriptoom te bestuderen met behulp van openbaar beschikbare gegevens, computationele bronnen en high-throughput gegevens van microRNA-arrays na het transfecteren van cellen met kleine hairpin (sh)RNA die zich richten op een transcriptiefactor van belang.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het beschrijven van een transcriptiefactor Afhankelijk verordening van het MicroRNA Transcriptome
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Terwijl de transcriptieregulatie van eiwitcoderende genen uitgebreid bestudeerd weinig bekend over hoe transcriptiefactoren betrokken zijn bij transcriptie van niet-coderende RNA's specifiek van miRNA. Hier stellen we een strategie om de mogelijke rol van transcriptiefactor studeren in het reguleren van transcriptie van microRNA's met behulp van publiekelijk beschikbare gegevens, computational resources en high throughput data. We gebruiken de H3K4me3 epigenetische handtekening aan microRNA promotors en chromatine immunoprecipitatie (ChIP) -sequencing data identificeren van de ENCODE project om microRNA promotors die zijn verrijkt met transcriptiefactor bindingsplaatsen te identificeren. Door het transfecteren van cellen plaats met shRNA gericht op een transcriptiefactor van interesse en het onderwerpen van de cellen aan microRNA array, onderzoeken we het effect van deze transcriptiefactor op de microRNA transcriptoom. Als illustratief voorbeeld gebruiken we ons onderzoek naar het effect van STAT3 op microRNA transcriptoom van chronische lymphocytic leukemie (CLL) cellen.
Inleiding
MicroRNAs zijn endogene kleine niet coderende RNA's regelgeving die typisch functioneren als negatieve regulatoren van mRNA expressie in het post-transcriptionele niveau. Ongeveer 1000 niet coderende 20-25 nucleotiden lang microRNA worden in het menselijk genoom 1,2. MicroRNAs genexpressie tot canonieke basenparing tussen het zaad sequentie van microRNA en zijn complementaire sequentie seed match, die gewoonlijk is gelegen aan het 3 'onvertaalde gebied (UTR) van het doelwit mRNA. Gezamenlijk microRNAs reguleren van meer dan 30% van de proteïne-coderende genen 3, maar is slechts weinig bekend over de transcriptie van DNA van microRNAs. Er is gesuggereerd dat de regulering van microRNA transcriptie vergelijkbaar met die van mRNA 4,5. Vooral vergelijkbaar met de activiteit bevorderen transcriptie van eiwitcoderende genen, transcriptie factoren zijn die de transcriptie van miRNA 6 activeert. Transcriptiefactor-microRNA samenspel is gemeld als een modulator factor van genexpressie 7, en kunnen vormen ook feed-back en feed-forward loops. Bijvoorbeeld Yamakuchi et al. Rapporteerde een terugkoppellus waarin p53 induceert de expressie van microRNA34a, waardoor remt translatie van het p53 repressor SIRT en daardoor p53 activiteit 8 toe.
Dat specifieke voorbeelden van transcriptie factor afhankelijke expressie van miRNA gemeld wordt geaccepteerd als die informatie geeft over hoe een transcriptiefactor van interesse reguleert de expressie van microRNA-transcriptoom ontbreekt. Het doel van het protocol hierin voorgesteld is om een diepgaande beschrijving van transcriptiefactor-afhankelijke regulatie van het microRNA-transcriptoom bieden. Door het combineren van publiekelijk beschikbare gegevens, bio-informatica hulpmiddelen en het gebruik van microarray technologie, zou onderzoekers die dit algoritme volgen in staat om op een genomische schaal om vast te leggen hoe eentranscriptiefactor in elk celtype van belang reguleert de expressie van microRNA-transcriptoom en een vermeende bijdrage van de transcriptiefactor mRNA verkennen in microRNA expressie reguleren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Identificeer transcriptiefactorbindingsplaatsen in de promotor van MicroRNA genen Met behulp van Data Mining Approach
- Gebruik de Universiteit van Californië in Santa Cruz (UCSC) genoom browser naar chromatine immunoprecipitatie (ChIP) sequencing gegevens die in het kader van de Encyclopedia of DNA-element (ENCODE) project te halen.
- Open de tabel browser in de UCSC genoom browser.
- Gebruik de volgende specificaties om de tafel te pakken: Clade: (Zoogdieren), genoom: (Human), Montage: (Feb2009 (GRch37 / hg18)), de groep: (verordening), track (TxnFactorChIP), tabel: (weEncoderesTFbsCo7steredv3), regio : (Genome), output formaat (alle genen van geselecteerde tabel).
- Sla de output van 1.1.2 als een txt-bestand en in een spreadsheet.
- Sorteren en filteren voor de transcriptiefactor van belang (bijvoorbeeld, STAT2).
- Gebruik de lijst van microRNA promotors gebaseerd op H3K4me3 epigenetica handtekening verkrijgbaar bij Baeer et al. 9 . Kopieer deze lijst in een .txt bestand.
- Aan de hand van coördinaten op het menselijk genoom overeenkomen, breng de gegevens van 1.1 en 1.2 (bv STAT3 bindend vermeende microRNA promotors) en het bepalen van de mediane affiniteit met behulp van de code geschreven in C scherp als omschreven in aanvullende codering bestand 1.
2. Gebruik shRNA naar Down-reguleren van de expressie van een transcriptiefactor of Interest
- Plaat 1,5 x 10 6 cellen van 293 humane embryonale niercellijn in 10 cm plaat bij ongeveer 50% confluentie (DMEM met 10% FBS).
- Transfecteren van cellen 293 humane embryonale niercellijn met 5 ug groene fluorescentie eiwit (GFP) lentivirus die shRNA gericht naar de transcriptiefactor van interesse en met 5 ug verpakkingsvectoren middels transfectie reagens voor hechtende cellen volgens het protocol van de fabrikant.
- Als controle transfecteren van de cellen van 293 humane embryonale niercellijn metscrambled shRNA en de verpakking vectoren volgens het protocol van de fabrikant.
- Blijf transfectiemengsel op cellen gedurende 16 uur (bij 37 ° C, CO2 incubator) en media veranderen in 10 ml vers 10% DMEM medium met 10% FBS.
- Wacht 48 uur na transfectie, centrifuge de celkweek (300 x g, 5 min) en het verzamelen van besmettelijke supernatant. Filtreer de bovenstaande vloeistof door een 0,45 pm spuitfilter (25-mm oppervlakteactieve gratis celluloseacetaatmembraan) tot een drijvend cellen te verwijderen.
- Concentreer de supernatant en het verzamelen van de lentivirus met behulp van een ultracentrifugale filter apparaat met een drempel van 100 kDa. Spin bij 950 g gedurende 30 - 60 min, totdat het volume concentraat geweest tot minder dan 250 pl. Bewaar de geconcentreerde virus bij -80 ° C.
- Transfecteren de cellen met de lentivirus. Verwijderen lentivirus bevroren van -80 ° C vriezer en ontdooien bij kamertemperatuur. Transfer 100 ul virale supernatant naar een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Bring het volume in de buis 1 ml met verminderde serum medium. Voeg hexadimethrinebromide aan 1 ml virussuspensie voor eindconcentratie van 10 ng / ml, meng voorzichtig en laat het mengsel staan gedurende 5 min.
- Centrifugeer 5 x 10 6 cellen per transductie en voorzichtig resuspendeer de celpellet in 0,5 ml medium bevattende virus. Laat de cellen blijven in de incubator voor 4-24 uur, voeg 0,5 ml medium met 20% FBS tot een uiteindelijke concentratie van 10% FBS.
- Wacht 48 tot 72 uur en vlekken op de cellen met propidiumjodide (PI) en groene fluorescerende eiwit (GFP) volgens de instructies van de fabrikant. Bescherm de cellen tegen licht en gebruik een FACS sorter om de tarieven van GFP + / PI te meten - cellen. Aangezien PI vlekken alleen dode cel, dit percentage is een schatting van transfectie-efficiëntie in levende cellen.
- Sorteren positieve celpopulatie GFP expressie (GFP +) van FACS sorter zoals eerder beschreven 10.
- gebruik Western immunologische blotting zoals eerder beschreven 10 om de niveaus van een transcriptiefactor van interesse te bepalen voor en na het infecteren van de cellen van belang (bijvoorbeeld CLL cellen) met aangewezen shRNA.
3. Bepaal de expressie van MicroRNA Transcriptome in cellen die met Transcription Factor-shRNA
- Isoleer RNA met een commerciële kit volgens het protocol van de fabrikant.
- Label de RNA en hybridiseren aan microRNA microarray 11.
- Bepaal de verschillend tot expressie microRNA in cellen die met transcriptiefactor-shRNA of met lege vector controls 5.
- Valideren van de microarray resultaten voor het grootste differentieel tot expressie microRNA's met behulp van real-time PCR 5.
4. Bepaal de overlap tussen de Bio-informatica en de shRNA aanpak bij het beschrijven van de transcriptiefactor Dependent Transcriptome
- detHermelijn het verwachte en waargenomen verhoudingen van microRNA genen die transcriptiefactor bindingsplaatsen in hun promoters haven en werden neerwaarts gereguleerd in transcriptiefactor-shRNA getransfecteerde cellen, het volgende doen:
- Het verkrijgen van de verhouding van genen die de transcriptiefactor van belang de haven in hun promotor / totaal microRNA in de lijst gegenereerd in 1.3. Deze lijst is de verwachte verhouding (bijv microRNA genen met STAT3 binding sites / totaal microRNA genen getest = 0,25).
- Bepaal het aantal genen die in transcriptiefactor-shRNA getransfecteerde cellen werden neerwaarts gereguleerd in de lijst gegenereerd in 3.3 en heeft transcriptiefactor van belang bindende plaatsen in de lijst gegenereerd in 1.3. Dit nummer / Totaal aantal genen neerwaarts gereguleerd is de waargenomen ratio (bijv microRNA genen met STAT3 binding sites / totaal aantal neerwaarts gereguleerd microRNAs = 0,6).
- Gebruik χ2 statistieken de waargenomen en verwachte verhoudingen die hierboven zijn gegenereerd vergelijken en bepalen of de lijst van genen die neerwaarts gereguleerd werden in transcriptiefactor-shRNA getransfecteerde cellen zijn verrijkt met transcriptiefactor bindingsplaatsen in hun promotor.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
STAT3 is een transcriptiefactor die gewoonlijk induceert de transcriptie van genen die anti- apoptotische en proliferatieve effecten 12 hebben. Of STAT3 beïnvloeden ook de niet-coderende RNA transcriptoom is momenteel niet bekend. In alle CLL cellen STAT3 constitutief gefosforyleerd op serine residuen 707 10,13. Fosfoserine STAT3 shuttles naar de kern, bindt aan DNA en activeert genen bekend zijn geactiveerd door tyrosine pSTAT3 in andere celtypen tot 10....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het mechanisme dat het RNA polymerase II de transcriptie afhankelijke eiwit-coderende genen is uitgebreid bestudeerd. Hoewel deze elementen maken slechts 1% - 2% van het menselijk genoom, bewijsmateriaal van de ENCODE project suggereren dat meer dan 80% van het menselijk genoom transcriptie 17 kan ondergaan en wat reguleert de transcriptie van de niet-coderende DNA-elementen nog zwaar 6 .
Verschillende studies waaruit bleek dat Pol II is ook verantwoordelijk voor de tra...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door een subsidie van de CLL Global Research Foundation. De Universiteit van Texas MD Anderson Cancer Center wordt gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health door middel van een Cancer Center Ondersteuning Grant (P30CA16672).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Lipofectamin 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| 0.45 µm spuitfilter | Thermo Scientific (Nalgene) | 190-2545 | |
| Amicon ultracentrifugaal filterapparaat met een drempel van 100 kDa | Merck Millipore | ||
| Polybren | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| TRIzol reagens | Life Tachnologies (Invitrogen) | 15596-026 | |
| 293 Cellijn mens | Sigma-Aldrich | 85120602 |
Referenties
- Bentwich, I., et al. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs. Nat Genet. 37, 766-770 (2005).
- Hata, A. Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease. Annu Rev Physiol. 75, 69-93 (2013).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Piriyapongsa, J., Jordan, I. K., Conley, A. B., Ronan, T., Smalheiser, N. R. Transcription factor binding sites are highly enriched within microRNA precursor sequences. Biol Direct. 6, 61(2011).
- Rozovski, U., et al. Signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 regulates microRNA gene expression in chronic lymphocytic leukemia cells. Mol Cancer. 12, 50(2013).
- Turner, M. J., Slack, F. J. Transcriptional control of microRNA expression in C. elegans: promoting better understanding. RNA Biol. 6, 49-53 (2009).
- Cui, Q., Yu, Z., Pan, Y., Purisima, E. O., Wang, E. MicroRNAs preferentially target the genes with high transcriptional regulation complexity. Biochem Biophys Res Commun. 352, 733-738 (2007).
- Yamakuchi, M., Lowenstein, C. J. MiR-34, SIRT1 and p53: the feedback loop. Cell Cycle. 8, 712-715 (2009).
- Baer, C., et al. Extensive promoter DNA hypermethylation and hypomethylation is associated with aberrant microRNA expression in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Res. 72, 3775-3785 (2012).
- Hazan-Halevy, I., et al. STAT3 is constitutively phosphorylated on serine 727 residues, binds DNA, and activates transcription in CLL cells. Blood. 115, 2852-2863 (2010).
- Melo, S. A., et al. A TARBP2 mutation in human cancer impairs microRNA processing and DICER1 function. Nat Genet. 41, 365-370 (2009).
- Akira, S. Functional roles of STAT family proteins: lessons from knockout mice. Stem Cells. 17, 138-146 (1999).
- Frank, D. A., Mahajan, S., Ritz, J. B lymphocytes from patients with chronic lymphocytic leukemia contain signal transducer and activator of transcription (STAT) 1 and STAT3 constitutively phosphorylated on serine residues. J Clin Invest. 100, 3140-3148 (1997).
- Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 11755-11760 (2004).
- Consortium, E. P. A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE). PLoS biology. 9, e1001046(2011).
- Miranda, K. C., et al. A pattern-based method for the identification of MicroRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes. Cell. 126, 1203-1217 (2006).
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489, 57-74 (2012).
- Lau, J. C., Hanel, M. L., Wevrick, R. Tissue-specific and imprinted epigenetic modifications of the human NDN gene. Nucl Acids Res. 32, 3376-3382 (2004).
- Corcoran, D. L., et al. Features of mammalian microRNA promoters emerge from polymerase II chromatin immunoprecipitation data. PLoS One. 4, e5279(2009).
- Bhattacharyya, M., Feuerbach, L., Bhadra, T., Lengauer, T., Bandyopadhyay, S. MicroRNA transcription start site prediction with multi-objective feature selection. Stat Appl Genet Mol Biol. 11, Article 6 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
