Hier stellen we een strategie voor om het effect van een transcriptiefactor van belang op het microRNA-transcriptoom te bestuderen met behulp van openbaar beschikbare gegevens, computationele bronnen en high-throughput gegevens van microRNA-arrays na het transfecteren van cellen met kleine hairpin (sh)RNA die zich richten op een transcriptiefactor van belang.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het beschrijven van een transcriptiefactor Afhankelijk verordening van het MicroRNA Transcriptome
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Terwijl de transcriptieregulatie van eiwitcoderende genen uitgebreid bestudeerd weinig bekend over hoe transcriptiefactoren betrokken zijn bij transcriptie van niet-coderende RNA's specifiek van miRNA. Hier stellen we een strategie om de mogelijke rol van transcriptiefactor studeren in het reguleren van transcriptie van microRNA's met behulp van publiekelijk beschikbare gegevens, computational resources en high throughput data. We gebruiken de H3K4me3 epigenetische handtekening aan microRNA promotors en chromatine immunoprecipitatie (ChIP) -sequencing data identificeren van de ENCODE project om microRNA promotors die zijn verrijkt met transcriptiefactor bindingsplaatsen te identificeren. Door het transfecteren van cellen plaats met shRNA gericht op een transcriptiefactor van interesse en het onderwerpen van de cellen aan microRNA array, onderzoeken we het effect van deze transcriptiefactor op de microRNA transcriptoom. Als illustratief voorbeeld gebruiken we ons onderzoek naar het effect van STAT3 op microRNA transcriptoom van chronische lymphocytic leukemie (CLL) cellen.
Inleiding
MicroRNAs zijn endogene kleine niet coderende RNA's regelgeving die typisch functioneren als negatieve regulatoren van mRNA expressie in het post-transcriptionele niveau. Ongeveer 1000 niet coderende 20-25 nucleotiden lang microRNA worden in het menselijk genoom 1,2. MicroRNAs genexpressie tot canonieke basenparing tussen het zaad sequentie van microRNA en zijn complementaire sequentie seed match, die gewoonlijk is gelegen aan het 3 'onvertaalde gebied (UTR) van het doelwit mRNA. Gezamenlijk microRNAs reguleren van meer dan 30% van de proteïne-coderende genen 3, maar is slechts weinig bekend over de transcriptie van DNA van microRNAs. Er....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Identificeer transcriptiefactorbindingsplaatsen in de promotor van MicroRNA genen Met behulp van Data Mining Approach
- Gebruik de Universiteit van Californië in Santa Cruz (UCSC) genoom browser naar chromatine immunoprecipitatie (ChIP) sequencing gegevens die in het kader van de Encyclopedia of DNA-element (ENCODE) project te halen.
- Open de tabel browser in de UCSC genoom browser.
- Gebruik de volgende specificaties om de tafel te pakken: Clade: (Zoogdieren), genoom: (Human), Montage: (Feb2009 (GRch37 / hg18)), de groep: (verordening), track (TxnFactorChIP), tabel: (weEncoderesTFbsCo7steredv3), regio : (Genome), output formaat (alle gene....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
STAT3 is een transcriptiefactor die gewoonlijk induceert de transcriptie van genen die anti- apoptotische en proliferatieve effecten 12 hebben. Of STAT3 beïnvloeden ook de niet-coderende RNA transcriptoom is momenteel niet bekend. In alle CLL cellen STAT3 constitutief gefosforyleerd op serine residuen 707 10,13. Fosfoserine STAT3 shuttles naar de kern, bindt aan DNA en activeert genen bekend zijn geactiveerd door tyrosine pSTAT3 in andere celtypen tot 10........
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het mechanisme dat het RNA polymerase II de transcriptie afhankelijke eiwit-coderende genen is uitgebreid bestudeerd. Hoewel deze elementen maken slechts 1% - 2% van het menselijk genoom, bewijsmateriaal van de ENCODE project suggereren dat meer dan 80% van het menselijk genoom transcriptie 17 kan ondergaan en wat reguleert de transcriptie van de niet-coderende DNA-elementen nog zwaar 6 .
Verschillende studies waaruit bleek dat Pol II is ook verantwoordelijk voor de tra.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door een subsidie van de CLL Global Research Foundation. De Universiteit van Texas MD Anderson Cancer Center wordt gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health door middel van een Cancer Center Ondersteuning Grant (P30CA16672).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Lipofectamin 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| 0.45 µm spuitfilter | Thermo Scientific (Nalgene) | 190-2545 | |
| Amicon ultracentrifugaal filterapparaat met een drempel van 100 kDa | Merck Millipore | ||
| Polybren | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| TRIzol reagens | Life Tachnologies (Invitrogen) | 15596-026 | |
| 293 Cellijn mens | Sigma-Aldrich | 85120602 |
Referenties
- Bentwich, I., et al. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs. Nat Genet. 37, 766-770 (2005).
- Hata, A. Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease. Annu Rev Physiol. 75, 69-93 (2013).
- Bar....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
