In vitro test te meten Fosfatidylethanolamine methyltransferase activiteit

Samenvatting

Het huidige rapport beschrijft een in vitro enzymatische test om fosfatidylethaanolaminmethyltransferase-activiteit te meten met behulp van Leishmania-celextracten. Deze test is gebaseerd op de overdracht van een radioactieve methylgroep van S-[Methyl-³H]adenosyl-L-methionine naar endogeen fosfatidylethaanolamine.

Samenvatting

Fosfatidylethanolamine-methyltransferases zijn biosynthetische enzymen die de overdracht katalyseren van een of meer methylgroep(en) vanaf S-adenosyl-L-methionine naar fosfatidylethanolamine, monomethyl-fosfatidylethanolamine of dimethyl-fosfatidylethanolamine om monomethyl-fosfatidylethanolamine, dimethyl-fosfatidylethanolamine of fosfatidylcholine te geven. Deze enzymen zijn alomtegenwoordig in dierlijke cellen, schimmels en worden ook gevonden in ongeveer 10% van de bacteriën. Ze vervullen verschillende belangrijke functies in de celfysiologie buiten hun directe rol in lipidemetabolisme zoals bij insulineresistentie, diabetes, atherosclerose, celgroei of virulentie. Het huidige manuscript rapporteert over een eenvoudige enzymatisch celvrij assay die de overdracht van getritieerd methylgroep(en) vanaf S-[Methyl-³H]adenosyl-L-methionine naar fosfatidylethanolamine meet, met gebruik van hele celextracten als enzymbron. De resulterende gemethyleerde vormen van fosfatidylethanolamine zijn hydrofoob en kunnen dus worden gescheiden van wateroplosbaar S-[Methyl-³H]adenosyl-L-methionine door organische extractie. Deze assay kan potentieel worden toegepast op elk ander celtype en worden gebruikt om remmers/medicijnen specifiek voor een fosfatidylethanolamine-methyltransferase van belang te testen zonder de noodzaak om het enzym te zuiveren.

Inleiding

Fosfatidylethanolamine methyltransferase (PEMT) enzymen katalyseren de covalente aanhechting van één of meer methylgroepen met S -adenosylmethionine (SAM) als methylgroepdonor op PE, monomethyl-dimethyl-PE of PE naar monomethyl-PE, dimethyl-PE en / of geeft fosfatidylcholine (PC). Deze enzymen zijn vrijwel overal in dierlijke cellen en schimmels. Ze kunnen ook in sommige planten ¹ en ongeveer 10% van de bacteriën, met name die interageren met eukaryoten ^2.

PEMTs de biologie van de cel betrokken zijn niet alleen bijdragen aan de productie van PC, die de belangrijkste lipideklasse in dierlijke cellen, maar ook door te voldoen aan andere belangrijke cellulaire functies. In zoogdieren worden PEMTs voornamelijk tot expressie in de lever, waar zij nodig zijn voor normale afscheiding van zeer lage dichtheid lipoproteïne en ze dragen ook bij aan dieet-geïnduceerde obesitas ^3, atherosclerose ⁴ en insuline weerstandkomstig ^5. Daarnaast zijn zoogdieren PEMT eveneens uitgedrukt in adipocyten, hoewel lagere niveaus, en deelnemen vetafzetting ^{6, 7.} PEMT rol in kanker ontwikkeling ^{8, 9} apoptose en celgroei ¹⁰ zijn ook aangetoond. In bacteriën zijn PEMT enzymen getoond belangrijk voor normale celgroei ^2, virulentie ² en symbiose met de gastplant ¹¹ zijn.

Het doel en de reden van het huidige protocol is het PEMT activiteit van volledige celextracten te meten zonder de noodzaak om het enzym te zuiveren. Twee verschillende protocollen ontwikkeld om PEMT te meten. De eerste en meest voorkomende meet de overdracht van getritieerd methylgroep van radioactieve SAM op PE, dat is het onderwerp van dit artikel. Dit protocol werd oorspronkelijk ontwikkeld om PEMT activiteit meet van gist ¹² en zoogdiercellen (lever) ¹³ om een underst winnenanding PC biosynthese in deze cellen en de specificiteit van deze enzymen te bepalen. Later is deze techniek toegepast op andere celtypen zoals bacteriën ² (met een basische pH-waarde voor de test hoewel ¹⁵⁾ en protozoa parasieten ^14. Deze techniek kan worden gebruikt met gehele celextracten en gezuiverd enzym, en kan mogelijk worden toegepast op elk celextract systeem. Een niet radioactieve assay is ook ontworpen dat steunt op de enzymatische kwantificering van S -adenosylhomocysteine ​​het transmethylatie product van SAM ^16. Laatstgenoemde bepaling kan handiger omdat het geen betrekking radioactiviteit maar het is alleen geschikt voor gezuiverde enzymen.

Protocol

1. Cell Extract Voorbereiding

1. Groeien de Leishmania cellen in een steriele plastic fles afgesloten met luchtdichte deksel bij 26 ° C in een medium van 1x M199 aangevuld met 20 mM HEPES pH 7,4, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 5 ug / ml heem , 0,35 g / L NACO ₂ H, 0,1 mM adenine en 2 ug / ml biopterine zonder schudden. Oogst de cellen door centrifugeren bij 1500 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C wanneer zij een celdichtheid van 1-2 x 10 ⁷ / ml bereikt.
2. Verwijder het supernatant met een pipet en was de cellen door resuspenderen de celpellet met een serologische pipet in de helft van het volume van de cultuur van koude fosfaatgebufferde zoutoplossing (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na ₂ HPO _4, 1,8 mM KH ₂ PO _4, pH 7,4). Gooi celsupernatanten volgens BL2 veiligheidsrichtlijnen.
3. Centrifugeer de cellen opnieuw bij 1500 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant met een pipet. Overgaan to de volgende stap of snap bevriezen de celpellet in vloeibare stikstof voor langdurige opslag bij -80 ° C (tot drie maanden).
4. Bereid 2x lysisbuffer (0,5 M sucrose, 0,1 M TrisHCl, pH 7,5, 2 mM EDTA, en 2x proteaseremmer cocktail) en houd het bij 4 ° C op ijs.
5. Resuspendeer de celpellet (vers of bevroren) in gelijk volume 2 x lysisbuffer. Voeg 1x volume van glazen kralen. Vortex krachtig bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
6. Voeg 2 volumes 1x lysis buffer en meng. Centrifuge cel extracten bij 1500 xg bij 4 ° C gedurende 10 minuten om ongebroken cellen en kernen pellet.
7. Breng de supernatant met een pipet in een verse centrifugebuis en koel houden celextracten op ijs totdat de proef.

2. Bepaal de eiwitconcentratie van het celextract gebruiken Protein Estimation Kit Zoals bicinchoninezuur Assay

1. Bereid de bicinchoninezuur (BCA) oplossing (1 ml / buis) door mengen van de BCA en koper (II) sulfate in een verhouding van 49: 1 (v / v).
2. Bereid de eiwitstandaarden van 0, 10, 20, 30, 40, 50, en 60 ug / ml door verdunning van een 10 mg / ml runderserumalbumine (BSA) voorraadoplossing in 1 ml porties van de BCA-oplossing.
3. Voeg 2 pi cellen uittreksels 1 ml BCA oplossing in duplo. Incubeer standaarden en eiwit monsters 10 minuten in een voorverwarmde 60 ° C waterbad.
4. Doorvoermonsters om ijs 3 min. Meet de absorptie van de standaarden en de eiwitmonsters met een spectrofotometer bij een golflengte van 562 nm.
5. Bereken de eiwitconcentratie van de celextracten met de BSA norm als referentie zoals in protocol van de fabrikant beschreven. Verdun celextracten een eiwitconcentratie van 10 mg / met 1x lysisbuffer ml.

3. Enzymatische Assay in 200 pi per buis

LET OP: Draag de volgende stappen in een chemische kap.

1. Test elk monster in tweevoud in een 15 mlconische buis. Bereid 20 pi 1 M TrisHCl pH 7,5 per buis en te houden op het ijs. Bereid 2 ml chloroform / methanol (1: 1 (v / v); stopoplossing) bij KT elke buis.
2. Pipetteer 20 ul van 1 M TrisHCl pH 7,5 per 15 ml conische buis op ijs.
3. Volg de straling veiligheid richtlijnen vanaf hier op. Voeg het equivalent van 0,06 pM (0,2 uCi) S - [Methyl ³ H] adenosyl-L-methionine en 50 uM koud SAM per buis voor een totaal van 50,06 uM SAM. Voeg x pi koud water waar x = 200 (20 (voor buffer) + 20 (voor mobiele extracten) + volume van koude en radioactieve SAM) per buis.
4. Overdracht elke conische buis met een voorverwarmde 30 ° C waterbad. Aan elke buis 20 gl celextracten (equivalent van 200 ug eiwit) om de reactie te starten. Incubeer de gewenste tijd (0-45 min).
5. Stop de reactie door toevoeging van 2 ml chloroform / methanol (1: 1, v / v; stopoplossing) aan elke buis. Breng de conische buis tot kamertemperatuur (20-256, C).

4. Lipid Extraction

LET OP: Draag de volgende stappen in een chemische kap.

1. Voeg 700 ul van water aan elke buis die het monster enzymatische reactie. Vortex krachtig gedurende 30 sec. Centrifugeer bij 1500 g gedurende 5 min bij RT om het organische scheiden van de waterfase.
2. Breng de onderste organische fase in een nieuwe 15 ml conische buis met een pipet. Voeg 1 ml water voor elke "onderste fase" met buis en vortex krachtig gedurende 30 sec. Centrifugeer opnieuw bij 1500 xg gedurende 5 min aan de organische scheiden van de waterfase.
3. Breng de onderste organische fase in een scintillatie-buisje met een pipet. Droge monsters onder een _stroom N2. Gooi het water fasen met de niet-opgenomen radioactieve SAM en de radioactieve conische buizen per straling richtlijnen.
4. Voeg 2 ml / tube scintillatievloeistof. Meet de opgenomen radioactiviteit met een scintillatie counter volgens het protocol van de fabrikant en het gebruik instrument.
5. Bereken de enzymatische activiteit in nmol / mg eiwit met de volgende algemene formule:
   cpm waarde x 10 ³ x [totale (radioactief en koud) concentratie van SAM (mm)] x 5 specifieke activiteit van radioactieve SAM (Ci / mmol) x [concentratie radioactieve SAM (mm)]
   OPMERKING: de bovenstaande protocol kan worden aangepast voor een SAM-concentratie-afhankelijke of een eiwit afhankelijk PEMT assay. Voor SAM concentratie afhankelijke enzymatische test wordt de tijd constant gehouden (15 min, die in het lineaire gebied) en verschillende hoeveelheden koude SAM wordt toegevoegd aan de test, terwijl voor eiwit afhankelijke PEMT assay SAM concentratie (we kozen 0,05 mM) en tijd worden constant gehouden (15 min). Ook de pH van de buffer kan zo nodig als sommige PEMT enzymen een verschillende optimale pH waarde veranderen.

Resultaten

Figuur 1 toont een tijdsafhankelijke PEMT test, die met Leishmania gehele celextract werd uitgevoerd als een enzym bron met endogene PE als substraat. De hoeveelheid radioactiviteit in de organische fase werd gekwantificeerd door scintillatietelling. De verkregen getallen werden gebruikt om de hoeveelheid getritieerd methylgroepen overgebracht naar PE te berekenen. De PEMT activiteit was lineair gedurende ongeveer 20 min. Vervolgens bereikte een plateau bij onge...

Discussie

Deze eenvoudige, snelle PEMT test maakt de kwantificering van gemethyleerde vormen van PE als gevolg van de overdracht van radioactieve methylgroepen van SAM op PE middels gehele celextract als eiwitbron. Het is snel, gevoelig en reproduceerbaar, en ook geschikt voor gezuiverde enzymen ^17. Monomethyl- of dimethyl-PE kan worden toegevoegd aan de test indien het methyltransferase van belang is specifiek voor deze substraten plaats van PE ^12,13,18,19. Als PEMT gezuiverde enzym wordt gebruikt, kan PE w...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine (specific activity of 5-15 Ci/mMole)	Perkin Elmer	NET155050UC	Deel het reagens in aliquoten en bevries het bij -20 °C; volg de richtlijnen voor stralingsveiligheid tijdens het gebruik van dit reagens
Protease inhibitor cocktail	Roche Life Sciences	11836170001	verdun het vers
Glaskralen, zuur gewassen, 425-600 mm	Sigma Aldrich	G8772
Bicinchonidinezuur oplossing	Sigma Aldrich	B9643
Koper (II) sulfaat	Sigma Aldrich	C2284
Scintillatieteller MicroBeta2 met 1-detector	Perkin Elmer	2450-0010
Spectrofotometer Biomate 3	Thermo Scientific	840208300
BSA stock oplossing (10 mg/ml)	New England Biolabs	B9001S
Scintillatievloeistof	Research Product International Corp	111198
S-(5'-Adenosyl)-L-methionine chloride (hydrochloride)	Cayman Chemicals	13956	verdun het reagens in 20 mM HCl en bevries aliquots bij -80 °C