Een eenvoudig alternatief voor stereotactische Injectie voor Brain Specifieke Knockdown van miRNA

Summary

MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.

Introduction

MicroRNAs zijn ontstaan ​​als nieuwe therapeutische targets te wijten aan hun universele rol in de regulering van genexpressie en direct bewijs voor de betrokkenheid bij de ziekte. MiRNAs worden actief onderzocht voor hun potentieel als drug targets ^1,2. Verder, veranderingen in miRNA expressie zijn geassocieerd met verschillende aandoeningen ³ en simulatie van deze veranderingen door kunstmatige verstoring van miRNA expressie kan worden gebruikt om de cellulaire routes betrokken bij de ziekte manifestatie bestuderen. Weefsel specifieke aflevering van miRNA targeting drugs is momenteel een grote uitdaging voor miRNA gebaseerde ontwikkeling van g....

Protocol

Let op: Al de procedure met inbegrip van dierlijke onderwerpen zijn door Institutional Dieren Ethische Commissie (IAEC) aan het Institute of Genomics en Integrative Biology, New Delhi goedgekeurd (IGIB / AEC / 10/2013). Dit protocol is specifiek aangepast voor gerichte afgifte van Antagomir-29 in de hersenen en knockdown van miR-29.

1. Antagomir Design Strategy

1. Haal de volwassen miRNA sequentie uit miRBase ¹¹ (http://www.mirbase.org/).
2. Haal de sequenties van verwante miRNA familieleden via de link "Gene familie" in de miRBase opnemen
   

Results

Met behulp van de hier gepresenteerde procedure, complexen van 50microgram fluorescent gelabelde oligonucleotide (FLO) en ~ 850microgram RVG peptide van 1:15 molaire lading ratio: waren (FLO peptide) bereid en geïnjecteerd slechts eenmaal door staartader. Complex van niet-neurotropic rabiësvirus Matrix (RVM) peptide en FLO werd gebruikt als een afgiftesysteem control. De volgende dag muizen hersenen en de lever werden geïsoleerd en enkele cel suspensies werden bereid. De cellen werden waargenomen onder microscoop groene.......

Discussion

Here we demonstrate a widely accessible methodology to study the effects of miRNA modulation. Currently, most attempts at in vivo characterization of miRNA functions involve the creation of knockout mice or a transgenic that expresses a miRNA sponge. Most miRNAs, even the cell type specific ones are expressed in more than one organ. For instance, miRNAs initially thought to be specific to the hematopoietic system are also expressed in the brain, due to the presence of microglia. Thus even a cell type specifi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vortex
Restrainer or Decapicone
Narrow runway			~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls.
Reagents
Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO)	GE Healthcare Dharmacon INC	D0016300120
10% sterile D-glucose
Antagomir-29	Exiqon	custom synthesis
Antagomir-control	Exiqon	custom synthesis
Neuropeptide RVG	G.L.Biochem (Shanghai) Ltd.	custom synthesis	>98% purity
Neuropeptide RVM	G.L.Biochem (Shanghai) Ltd.	custom synthesis	>98% purity
Other
Cotton
Warm water
Insulin syringes
Absorbent sheets
Ink
Brush
Antiseptic