Methodenartikel

Een eenvoudig alternatief voor stereotactische Injectie voor Brain Specifieke Knockdown van miRNA

DOI:

10.3791/53307

⸱

26 december 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology, New Delhi, India, 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), New Delhi, India

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNA's spelen een cruciale rol in de hersenen en zijn potentiële doelen voor het modelleren van neurodegeneratie. Het verstoren van miRNA-niveaus is echter een uitdaging vanwege de korte lengte van miRNA en de ontoegankelijkheid van hersenweefsel. Deze video presenteert een methode voor het ontwerpen van antagomir en specifieke levering aan de hersenen met behulp van een neuropeptide bij muizen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs (miRNAs) zijn belangrijke regulerende factoren van genexpressie. In de hersenen zijn essentiële processen zoals neuro-ontwikkeling en neuronale functies afhankelijk van de juiste expressie van microRNAs. Verstoring van microRNAs in de hersenen kan worden gebruikt om neurodegeneratieve ziekten te modelleren door neuronale celdood te moduleren. Momenteel wordt stereotactische injectie gebruikt om miRNA knockdown-agentia naar specifieke locaties in de hersenen te brengen. Hier bespreken we strategieën om antagomirs te ontwerpen tegen miRNA met locked nucleotide modificaties (LNA). Vervolgens beschrijven we een methode voor hersenspecifieke levering van antagomirs, gelijkmatig over verschillende hersengebieden. Deze methode is eenvoudig en breed toepasbaar omdat het de chirurgie, geassocieerde schade en beperkingen van lokale levering bij stereotactische injecties omzeilt. We bereidden een complex van neurotroop, cel-penetrerend peptide Rabies Virus Glycoproteïne (RVG) met antagomir tegen miRNA-29 en injecteerden het via de staartader, om specifiek in de hersenen te leveren. Het antagomir-ontwerp bevatte kenmerken die specifieke targeting van de miRNA en vorming van niet-covalente complexen met het peptide mogelijk maakten. Het knock-down van de miRNA in neuronale cellen resulteerde in apoptotische celdood en geassocieerde gedragsstoornissen. Dus, de methode kan worden gebruikt voor acute modellen van neuro-degeneratie door de verstoring van miRNAs.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs zijn ontstaan ​​als nieuwe therapeutische targets te wijten aan hun universele rol in de regulering van genexpressie en direct bewijs voor de betrokkenheid bij de ziekte. MiRNAs worden actief onderzocht voor hun potentieel als drug targets 1,2. Verder, veranderingen in miRNA expressie zijn geassocieerd met verschillende aandoeningen 3 en simulatie van deze veranderingen door kunstmatige verstoring van miRNA expressie kan worden gebruikt om de cellulaire routes betrokken bij de ziekte manifestatie bestuderen. Weefsel specifieke aflevering van miRNA targeting drugs is momenteel een grote uitdaging voor miRNA gebaseerde ontwikkeling van geneesmiddelen. Antagomirs en miRNA bootst zijn veelbelovend agenten voor verstoren miRNA niveaus 4-6. Echter, speciale functies die hun specificiteit en doeltreffendheid te verbeteren hebben in het ontwerp van antagomirs op te nemen voordat ze kunnen worden toegepast voor in vivo verstoring van miRNA expressie.

MicroRNAs zijn vooral relevant als doelen in momenteel ongeneeslijke neurodegeneratieve en neuro-ontwikkelingsstoornissen ziekten. De bloed-hersenbarrière vormt een beperking voor de levering van antagomirs de hersenen. Stereotactische injecties worden veel gebruikt in diermodellen om moleculen op specifieke locaties te leveren in de hersenen 7. Het vereist vaardigheid, omvangrijke investeringen in instrumentatie en tijd. Stereotactische injecties zijn invasief, betrekken chirurgie, veroorzaken ten minste lichte verwondingen en zijn beperkt tot lokale levering. Het gebruik van mobiele penetrerende peptiden met een voorkeur voor het richten neuronen kunnen deze beperkingen tegengaan aangezien zij door de trans-vasculaire route kan worden geleverd, maar schenden de bloed-hersenbarrière. Een dergelijk peptide afgeleid van het rabiësvirus glycoproteïne (RVG), is eerder gebruikt om siRNA leveren tegen Japanse encefalitis virus bij muizen 8. We vonden dat het gebruik van het peptide voor antagomir levering, miRNAs effectief kan worden neergehaald in muizenhersenen 9.

NHOUD "> De tweede grote uitdaging van miRNA neerhalen komt voort uit de geringe omvang van miRNAs en de aanwezigheid van nauw verwante sequentie isovormen. We nemen het voorbeeld van de MMU-miR-29 familie die bestaat uit drie nauw verwante isovormen, miR-29a , b en c. antagomirs zijn meestal ook gewijzigd langs de ruggengraat om hun stabiliteit te verhogen en ze bestand zijn tegen aantasting door nucleasen render. Locked Nucleic Acids (LNA) bieden een verder voordeel dat de thermische stabiliteit en zelfs leiden tot afbraak over en voorbij richten sterische hindering 10. Invoering wijzigingen langs de hoofdketen effectief maar duur kunnen zijn. Wij hebben eerder gezien dat modificaties voorbij een optimaal aantal niet verder verbeteren van de werkzaamheid. Het ontwerp van de antagomir gaat dus om optimale aanpassing van de antagomir.

Om de complexe antagomir niet-covalente wijze met de neurotrope peptide, een geladen hepta- tot nona-arginine extensie wordt gebruikt. D-Arginineresiduen worden gebruikt omdat daarmee een hogere stabiliteit zij niet gevoelig zijn voor splitsing door proteasen. Hepta- tot nona-arginine trajecten dienen als efficiënte cel penetrerende middelen, hoewel ze verleent celtype specificiteit. Door covalente koppeling van het peptide aan het RVG nona-arginine linker, een neurotrope celpenetrerende peptide werd gegenereerd. De positief geladen resten van het peptide interactie met de negatief geladen nucleïnezuur backbone, tot complexen. Deze complexen kunnen worden gebruikt om effectief te transfecteren DNA of RNA in gekweekte cellen en in vivo in weefsels.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Let op: Al de procedure met inbegrip van dierlijke onderwerpen zijn door Institutional Dieren Ethische Commissie (IAEC) aan het Institute of Genomics en Integrative Biology, New Delhi goedgekeurd (IGIB / AEC / 10/2013). Dit protocol is specifiek aangepast voor gerichte afgifte van Antagomir-29 in de hersenen en knockdown van miR-29.

1. Antagomir Design Strategy

  1. Haal de volwassen miRNA sequentie uit miRBase 11 (http://www.mirbase.org/).
  2. Haal de sequenties van verwante miRNA familieleden via de link "Gene familie" in de miRBase opnemen
    (Http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009).
  3. Omgekeerde complement van de sequentie: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html biedt een handig hulpmiddel omreverse complement sequenties.
  4. Markeren de posities door LNA worden aangepast met behulp van de volgende richtlijnen:
    1. Kies Thymine resten geplaatst 3-4 basen apart voor de LNA modificatie, omdat LNA pyrimidinen zijn stabieler dan 12 purines.
    2. Kies cytosineresten gescheiden door 3-4 resten als vorige stap produceert minder dan vijf wijzigingen.
    3. Prioriteren van de vijf wijzigingen einde van de antagomir de 5 ', aangezien dit voorkomt het zaad sequentie.

2. Antagomir-neuropeptide Complex Voorbereiding

Opmerking: Dit is de meest kritische fase in het protocol en standaardisatie nodig. Het protocol elke fluorescerend gemerkte oligonucleotide (FLO) kan worden gebruikt in plaats van de antagomir 9 standaardiseren. De peptiden moet zeer zuiver zijn (HPLC kwaliteit, 98% zuiver) .Sequences en belast peptide en antagomir zijn in tabel 1.

  1. Bepaal het aantal moles van antagomir te injecteren op basis van molaire lading op antagomir, de toxiciteit en het gewicht van de muis. Bereken het aantal mol peptide worden geïnjecteerd gebaseerd op molaire ladingsverhouding van antagomir tot: peptide.
    OPMERKING: Standaardiseren molaire lading verhouding van antagomir: peptide voor toxiciteit en effectieve levering in de hersenen van muizen. Gebruik verschillende molaire lading verhoudingen van fluorescent gelabelde oligonucleotide: peptide voor standaardisatie. We vonden dat Antagomir-29 en de controle waren allebei giftig bij 4microgram / gram lichaamsgewicht van de muis. Antagomir-29 en de controle werden gebruikt 2microgram / gram lichaamsgewicht, maar deze effectieve concentratie kan variëren voor elke microRNA.
  2. Verdun het peptide en antagomir in afzonderlijke microfugebuizen van voorraadoplossingen met steriele 10% D-glucose om de gewenste eindconcentratie zoals berekend in stap 1.
  3. Houd de microcentrifugebuis met het peptide-oplossing op een vortex bij matige snelheid vortexen.
  4. Voeg 1/3 van de antagomir oplossing voor de peptide oplossing buis, langzaam, druppelsgewijs, terwijl het grondig wordt gemengd op een vortex mixer.
  5. Zet mengen van oplossingen op de vortex gedurende 1 minuut volgende en laat vervolgens het mengsel gedurende 1 min staan.
  6. Herhaal stap 4 en 5 twee keer om de resterende antagomir oplossing met de peptide-oplossing in dezelfde microcentrifugebuis mengen. De langzame toevoeging is essentieel voor de vorming van mono-disperse complexen die effectief transfectie zijn. Snelle toevoeging kan leiden tot aggregatie van de complexen en de neerslag.
  7. Incubeer het complex 30 min bij kamertemperatuur zonder te vortexen. Gedurende deze incubatietijd, acclimatiseren de muizen naar het laboratorium waar de injectie zal worden uitgevoerd.

3. staartader Injectie van Antagomir-neuropeptide Complex

  1. Om het dier te beperken, plaatst u de muis in een restrainer of decapicone van de juiste grootte.
  2. Reinig het oppervlak van de staart met behulp van wattenstaafje pre-geweekt in warm water (ongeveer 40 ° C). Dit zal vaatverwijding bevorderen en de zichtbaarheid van de ader.
  3. Benader de staart met een klein volume (0,5-1,0 cc) insulinespuit in een 15-20 ° hoek. Wees voorzichtig eventuele lucht niet in te voeren in de spuit. Begin bij de distale deel van de staart. Injecteren van het complex. Verwijder de naald en een antiseptische wattenstaafje direct op de plaats van injectie (ongeveer 5-10 sec) om het bloeden te stoppen.
  4. Vervang de muis in een afzonderlijk geventileerde kooi in de groep 3-5, met maïskolf en tissuepapier als verrijking. Heeft geïnjecteerde en geïnjecteerde muizen niet te houden in dezelfde kooi.

4. Behavioural Testen

Opmerking: Bewaar het tijdsinterval van 3-4 uur tussen injectie en gedragsmatige testen om het herstel na de injectie toe te staan. Breng de muis om een ​​rustige kamer. Hebben de dieren niet storen tijdens deze periode van acclimatisatie.

  1. Acclimatiseren de muis om denieuwe kamer gedurende 30 minuten en dan beginnen de volgende gedrags-assays. Dient een ruimte van 10 minuten tussen elke gedrags assay.
  2. Achterbeen clasping:
    OPMERKING: Deze test geeft motorische stoornissen en neurologische stoornissen.
    1. Til de muis voorzichtig door het houden van de buurt basis van de staart in de heldere achtergrond.
    2. Controleer het achterbeen positie voor 10-15 sec. Wildtype muis splays achterpoten vanaf buik, terwijl een atactisch muis neiging om één of beide achterpoten trekken naar het abdomen meer dan 50% van de tijd gesuspendeerd 13.
    3. Breng de muis naar de kooi
  3. Ledge-test:
    1. Til de muis voorzichtig door het houden van de staart en houd het op de rand van een kooi.
    2. Let op de muis die specifiek op de hoek van de kooi. Wild-type muis kan de hoeken gemakkelijk zonder angst en verlies van de balans. Ataxic muis verliest zijn evenwicht, bevriezen of schudt tijdens een wandeling langs de kooi richel en op de hoeken.
  4. Mouse foot print-test:
    OPMERKING: Bij deze test houdt het absorberende laag klaar, op de vloer van een smalle baan (~ 70 cm lange, ~ 5-cm brede met ~ 5-cm hoge wanden.)
    1. Houd de muis voorzichtig met de ene hand en opbrengen van inkt op de achterpoten met een borstel.
    2. Plaats de absorberende laag op de vloer van een smalle baan.
    3. Laat de muis om te wandelen of lopen over een absorberende blad in een rechte lijn in een start-en landingsbaan van de ene naar de andere.
    4. Herhaal dit proces nog twee keer bij elke muis met verse absorberende laag.
    5. Meet de afstand tussen twee opeenvolgende stappen in de voorwaartse beweging. Do eerste en de laatste paar voetafdrukken omvatten niet waar het dier is gewoon het initiëren en afwerking zijn looppas, respectievelijk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van de hier gepresenteerde procedure, complexen van 50microgram fluorescent gelabelde oligonucleotide (FLO) en ~ 850microgram RVG peptide van 1:15 molaire lading ratio: waren (FLO peptide) bereid en geïnjecteerd slechts eenmaal door staartader. Complex van niet-neurotropic rabiësvirus Matrix (RVM) peptide en FLO werd gebruikt als een afgiftesysteem control. De volgende dag muizen hersenen en de lever werden geïsoleerd en enkele cel suspensies werden bereid. De cellen werden waargenomen onder microscoop groene...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier demonstreren we een wijd toegankelijke methodologie om de effecten van miRNA-modulatie te bestuderen. Momenteel omvatten de meeste pogingen tot in vivo karakterisering van miRNA-functies het creëren van knockout-muizen of een transgeen dat een miRNA-sprong tot expressie brengt. De meeste miRNA's, zelfs die welke specifiek zijn voor het celtype, worden in meer dan één orgaan tot expressie gebracht. miRNA's die aanvankelijk werden geacht specifiek te zijn voor het hematopoietische systeem, worden bijvoorbeeld...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bedanken Souvik Maiti voor de hulp bij het ontwerpen van de antagomirs. We danken ook Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey en Bijay Pattnaik voor hun hulp met experimentele methoden. Dit werk werd gefinancierd door de Raad voor Wetenschappelijk en Industrieel Onderzoek (BSC0123). HS, MV en RR danken een beurs van de Raad voor Wetenschappelijk en Industrieel Onderzoek, India. MAS bedankt een beurs van de University Grants Commission, India.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Vortex
Restrainer of Decapicone
Smal luchtvaartbaan~70 cm lang, ~5 cm breed met ~5 cm hoge muren.
Reagentia
Fluorescent gelabelde oligonucleotiden (siGLO)GE Healthcare Dharmacon INCD0016300120
10% steriele D-glucose
Antagomir-29Exiqonop maat gemaakte synthese
Antagomir-controleExiqonop maat gemaakte synthese
Neuropeptide RVGG.L.Biochem (Shanghai) Ltd.op maat gemaakte synthese>98% zuiverheid
Neuropeptide RVMG.L.Biochem (Shanghai) Ltd.op maat gemaakte synthese>98% zuiverheid
Anders
Katoen
Warm water
Insulinspuitjes
Absorptieve lakens
Inkt
Borstel
Antisepticum

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roshan, R., Ghosh, T., Scaria, V., Pillai, B. MicroRNAs: novel therapeutic targets in neurodegenerative diseases. Drug discovery today. 14, 1123-1129 (2009).
  2. Maes, O. C., Chertkow, H. M., Wang, E., Schipper, H. M. MicroRNA: Implications for Alzheimer Disease and other Human CNS Disorders. Current Genomics. 10, 154-168 (2009).
  3. Soifer, H. S., Rossi, J. J., Saetrom, P. MicroRNAs in Disease and Potential Therapeutic Applications. Mol Ther. 15, 2070-2079 (2007).
  4. Bader, A. G., Brown, D., Winkler, M. The Promise of MicroRNA Replacement Therapy. Cancer research. 70, 7027-7030 (2010).
  5. Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3, 1-17 (2012).
  6. Trang, P., et al. Systemic Delivery of Tumor Suppressor microRNA Mimics Using a Neutral Lipid Emulsion Inhibits Lung Tumors in Mice. Molecular Therapy. 19, 1116-1122 (2011).
  7. Barbash, S., Hanin, G., Soreq, H. Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome. J Vis Exp. (76), e50170(2013).
  8. Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
  9. Roshan, R., et al. Brain-specific knockdown of miR-29 results in neuronal cell death and ataxia in mice. RNA. 20, 1287-1297 (2014).
  10. Kaur, H., Wengel, J., Maiti, S. Thermodynamics of DNA−RNA Heteroduplex Formation: Effects of Locked Nucleic Acid Nucleotides Incorporated into the DNA Strand. Biochemistry. 47, 1218-1227 (2008).
  11. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, D140-D144 (2006).
  12. Kaur, H., Babu, B. R., Maiti, S. Perspectives on Chemistry and Therapeutic Applications of Locked Nucleic Acid (LNA). Chemical Reviews. 107, 4672-4697 (2007).
  13. Guyenet, S. J., et al. A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia. J. Vis. Exp. (39), (2010).
  14. Bergen, J. M., Park, I. -K., Horner, P. J., Pun, S. H. Nonviral Approaches for Neuronal Delivery of Nucleic Acids. Pharmaceutical Research. 25, 983-998 (2008).
  15. Zou, L. -L., Ma, J. -L., Wang, T., Yang, T. -B., Liu, C. -B. Cell-Penetrating Peptide-Mediated Therapeutic Molecule Delivery into the Central Nervous System. Current Neuropharmacology. 11, 197-208 (2013).
  16. Hwang, D. W., et al. A brain-targeted rabies virus glycoprotein-disulfide linked PEI nanocarrier for delivery of neurogenic microRNA. Biomaterials. 32, 4968-4975 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

MicroRNA knockdownantagomir ontwerplocked nucleic acidcelpenetrerend peptiderabi svirus glycoprote nestaartveninjectiehersenspecifieke afleveringgedragstestenkwantitatieve PCRneurodegeneratiemodel

Gerelateerde artikelen