Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Nasale Doekjes voor het influenza A-virus detectie en isolatie van Varkens

9.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53313

⸱

4 december 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary Preventive Medicine, The Ohio State University

In dit artikel

Samenvatting

De auteurs presenteren een protocol om varkens neusdoekjes te verzamelen voor het detecteren en isoleren van influenza A-virussen.

Samenvatting

Surveillance voor influenza A-virussen in varkens is van cruciaal belang voor de gezondheid van mens en dier, omdat influenza A-virus zich snel ontwikkelt in varkens bevolking en nieuwe stammen zijn voortdurend in opkomst. Varkens kunnen worden geïnfecteerd door diverse lineages van influenza A virus waardoor ze belangrijke systemen voor het ontstaan ​​en het onderhoud van nieuwe influenza A virusstammen. Sampling varkens in diverse instellingen zoals commerciële varkens landbouwbedrijven, beurzen en levende dieren markten van belang om een ​​volledig beeld van de momenteel circulerende stammen IAV verschaffen. De huidige gouden standaard ante mortem sampling techniek (dwz collectie neusuitstrijkjes) is arbeidsintensief, omdat het fysieke terughoudendheid van de varkens vereist. Nasale doekjes betrekken wrijven een stuk stof over de snuit van het varken met minimale tot geen terughoudendheid van het dier. De nasale veeg procedure is eenvoudig uit te voeren en geen personeel met professionele veterinaire of dierlijke handling training nodig. While iets minder gevoelig dan neusuitstrijkjes, virusdetectie en isolatie tarieven voldoende zijn om de neus veegt een levensvatbaar alternatief voor het bemonsteren van individuele varkens wanneer lage spanning bemonstering methoden nodig zijn. De procedure protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om een ​​levensvatbare nasale verzamelen veeg uit een individueel varken.

Inleiding

Influenza A virussen (IAV) veroorzaken respiratoire aandoeningen in vele soorten, waaronder gedomesticeerde vogels, varkens en mensen. Vanwege herschikking van de gesegmenteerde IAV genoom snelle virale evolutie kan optreden en nieuwe IAV stammen vaak ontstaan. Varkens zijn een soort die kan dienen als een mengvat voor de herschikking van IAVS van meerdere host-soorten. 1 Er zijn momenteel drie belangrijke subtypen van IAV vaak circuleren onder de Noord-Amerikaanse varkens (H1N1, H1N2, H3N2), maar meerdere IAV introducties van de mens leidde tot uitgebreide diversiteit IAV binnen deze subtypes. 2 Snelle ontwikkeling van IAVS infecteren varkens is evident sinds 1998 als een drievoudige reassortant IAV die gensegmenten van menselijke, vogels en varkensvirussen 3 werd bekend bij varkens in de Verenigde Staten. 4 De interne gen segmenten van die triple reassortant IAV blijven veel voorkomende onder IAVS momenteel infecteren varkens. 5

"> Wereldwijd IAV is een belangrijke oorzaak van ziekte van de luchtwegen bij varkens die typische klinische symptomen zijn koorts, anorexia, lusteloosheid, hoesten, bemoeilijkte ademhaling, niezen, loopneus en een slechte gewichtstoename. IAV kan bijzonder kostbaar zijn waar reproductieve boerderijen zaaien storing door IAV geïnduceerde koorts en zwak-geboren biggen gedocumenteerd. 6,7 In de Verenigde Staten wordt IAV gewoonlijk aangetroffen in commerciële varkenskuddes en uitgebreide antigene en genetische diversiteit en continue evolutie tussen IAV varkens infecteren de controle over deze belemmerd virus. 8-11

Volksgezondheid bezorgdheid over de opkomst van een pandemie IAV stam als gevolg van reassortment in varkens werden gerealiseerd in 2009, toen een Mexicaanse-lijn IAV met gensegmenten van de triple-reassortant Noord-Amerikaanse varkens geslacht en de Euraziatische aviaire-achtige varkens geslacht veroorzaakt een wereldwijde pandemie bij de mens. 12 De pandemische virus (A (H1N1) pdm09) heeft sindsdienreassorted endemische varkens IAV stammen 13,14 en sommige van deze nieuw reassorted stammen werden terug overgebracht naar de mens. 15 De frequentie van gebeurtenissen hergroepering en de opkomst van nieuwe IAV stammen met mogelijke pandemie maakt actieve bewaking van circulerende IAV virussen in varkens noodzakelijk, met name bij de varkens-human interface.

De varkens-human interface is belangrijk voor bi-directionele interspecies transmissie van IAV. Mens op varkens transmissie optreedt in commerciële varkensproductie is verantwoordelijk voor een groot aantal diversiteit IAV momenteel in varkens populatie aanwezig. Landbouwbeurzen zijn de grootste instellingen voor de mingling van mensen en varkens in de Verenigde Staten en staan ​​bekend locaties voor de zoönotische overdracht van IAV. 15-21 In 2012, tijdens de uitbraak van een variant H3N2 IAV, 93% van de gevallen gemeld bijwonen een agrarische beurs in de dagen voorafgaand aan het begin van de ziekte. 15 Genomic analysevan virale isolaten van tentoonstelling varkens in vergelijking met menselijke isolaten bevestigd zoönotische transmissie. 21 Tentoonstelling varkens besmet met IAV vaak geen klinische symptomen van ziekte, 21-23 waaruit de behoefte aan directe diagnostische tests tonen.

Bemonstering van zichtbaar zieke varkens alleen zal niet succesvol IAV prevalentie identificeren varkens en kan niet worden ingeroepen om nieuwe stammen van IAV opkomende onder varkens te identificeren. Actieve bewaking is absoluut noodzakelijk voor de detectie van nieuwe stammen van IAV bij varkens en hun bedreiging voor zowel de varkens en de volksgezondheid te beoordelen. De meeste IAV bewakingsactiviteiten zijn vrijwillig en daarom minimaal ontwrichtend methoden nodig zijn. De drie belangrijkste ante mortem monstername procedures voor IAV infecteren varkens zijn: neusuitstrijkjes, orale vloeistoffen, en nasale doekjes. De huidige aanbevelingen voor het bemonsteren van individuele varkens te IAV lijst detecteren de insertie van synthetische vezel getipt doekjes in de neusgaten als de voorkeursmethodenasale secreties en epitheelcellen verzamelen. 24,25 Aangezien varkens kunnen proberen deze procedure een team van geschoold personeel moet handmatig of met een strik afhankelijk van de grootte van het dier te beperken varkens te voorkomen. 26 De beperking werkwijze is omslachtig voor personeel en belastend voor de varkens. Daarnaast zijn tentoonstelling varkens vaak betrokken bij meerdere wedstrijden op een beurs, zodat de waarneming van extra stress op een wedstrijd dierhouders bestand tegen de surveillance inspanningen kunnen maken.

Met waarschijnlijkheid van detectie IAV variërend 80-100% in iav besmette beslagen, orale vloeistoffen tot een populair alternatief voor nasale uitstrijkjes voor de moleculaire detectie van IAS op populaties van varkens. 27,28 Bovendien kan orale vloeistoffen een groter raam van verstrekken IAV detectie dan neusuitstrijkjes na eerste infectie. Echter IAV isolatie orale vloeistoffen problematisch slechts 50% van virusisolatie pogingen gevolg IAV-herstel. 29

Met behulp van nasale doekjes in plaats van neusuitstrijkjes tijdens IAV toezicht bij varkens overwint de hierboven beschreven beperkingen. Nasale doekjes niet het gebruik van een remmende strik en kan worden uitgevoerd zonder nadruk dieren of getuigen van de procedure. Minimale technische opleiding is nodig om de neus doekjes, die niet-veterinaire professionals, waaronder de Mexicaanse eigenaars toestaat te verzamelen, om het toezicht op de monsters te verzamelen. Nasale doekjes werden vroeger vergeleken neusswabs voor de detectie en isolatie van influenza A virus 30 en gedetailleerd protocol voor deze niet-invasieve bemonsteringsmethode wordt hieronder beschreven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle varkens die in de verzameling van de volgende gegevens zijn beschermd op grond van de Ohio State University Institutional Animal Care en gebruik Comite (dierlijk gebruik protocolnummer 2009A0134-R1).

1. Voorbereiding van de Virale Transport Medium en Sample Collection Flesjes

  1. Voeg 37 g Brain Heart Infusion 900 ml gezuiverd water en meng met een roerstaaf en magnetische roerder onder verwarming tot 70 ° C om volledig op te lossen het poeder.
  2. Autoclaaf de bouillon bij 121 ° C gedurende 15 min. Koel op de bank boven totdat de bouillon bereikt kamertemperatuur. Koelkast bij 4 ° C gedurende de nacht indien nodig.
  3. Los, door mengen met een magnetische roerstaaf, 6,02 g Penicilline G natriumzout en 10 g streptomycine sulfaat in 50 ml gezuiverd water bij kamertemperatuur. Voeg extra gezuiverd water om het totale volume op 100 ml te brengen. Filtreer de oplossing door een 0,22 pm polyethersulfonmembraan in een steriele fles.
  4. Voeg aseptisch de gefilterde penicilline en streptomycine oplossing in de gekoelde Brain Heart Infusion bouillon en meng (roerstaafje of fles swirl met de hand) aan de virale transportmedium te maken.
  5. Aseptisch test de pH van het viraal transportmedium; indien nodig, de pH op 7,4 ± 0,2 met HCl of NaOH.
  6. Voer kwaliteitstest de virale transportmedium door het testen voor influenza A virus matrix eiwit door rRT-PCR, zoals beschreven door Zhang en Harmon. 22
  7. Verdeel 5 ml van de virale transportmedium in steriele HDPE flessen met een capaciteit 8 ml. Label de flesjes voor gebruik in het veld.
  8. Bewaar de ready-to-use flesjes in standaard cryo-boxen bij -20 ° C tot monstername.

2. Verzameling van nasale Wipes van Swine

  1. Ontdooi de juiste aantal flacons onmiddellijk voorafgaand aan de collectie te proeven; een flacon zal nodig zijn per varken bemonsterd. Het ontdooien bij kamertemperatuurtemperatuur duurt ongeveer 30-45 minuten. Houd de ontdooide flesjes afkoelen op ijs packs tot gebruik.
  2. Don geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen zoals gedicteerd door de situatie (bijvoorbeeld overall, laars covers, gasmasker, oordopjes, enz.).
  3. Voer het dier gebied. Indien nodig, beperkt het varken tot een klein gebied, maar zijn niet van weerhouden. Niet wakker rusten dieren.
  4. Op een paar wegwerp examen handschoenen. Zorg ervoor dat u de handschoenen besmetten door het aanraken van varkens, mensen of levenloze voorwerpen.
  5. Gebruik een gehandschoende hand van een steriele 5,08 cm x 5,08 cm verwijderen (2 in. × 2 in.), Katoen gaasje uit de verpakking. Steriele gaasjes moeten zoveel mogelijk worden gebruikt. Individueel verpakt gaasjes zijn handiger in gebruik dan die omwikkeld met twee gaasjes per verpakking.
  6. Houd het gaasje pad met de vingertoppen van enerzijds bloot zoveel van het kussen mogelijk bemonstering.
  7. Veeg het gaasje over de snuit van het varken, rekeningextra zorg aan de externe neusgaten, indien mogelijk in te voeren. Verzamel toegankelijk nasale afscheidingen (ca. 1 ml) met dezelfde gaasje.
  8. Met dezelfde hand, vouw het gaasje op zich om plaatsing in de flacon met virale transportmedium vergemakkelijken.
  9. Met behulp van de andere kant, verwijder de dop van de flacon en leg de gevouwen gaasje in de flacon. Recapituleren de flacon en schud het flesje om het mengen van het gaasje en virale transportmedium garanderen.
  10. Verwijder de handschoenen en plaats in een geschikte opvangbak. Veranderen handschoenen tussen elk varken.
  11. Controleer de flacon identifier. Record varken identificatienummer, leeftijd, geslacht, klinische symptomen, en andere opmerkingen door onderzoeker noodzakelijk wordt geacht.
  12. Chill de monsters direct na inzameling. Overwegen om hoeveelheden van het monster voor het invriezen om meerdere vries-dooi cycli te voorkomen. Zo spoedig mogelijk na afname, plaatst de monsters op droog ijs voor het transport naar het laboratorium. Bewaar de flesjes bij -80° C tot het testen wordt geïnitieerd.

3. Detectie van influenza A-virus nucleïnezuur

  1. Ontdooi de monsters in een 37 ° C droge bead bad gedurende 5 minuten en dan eindigen ontdooien van de monsters op de werktafel bij kamertemperatuur gedurende 20-30 min. Het gelijktijdig toevoegen van meerdere flacons aan de korrels veroorzaakt het bad te verwarmen; moet voorzichtigheid worden betracht om niet de flesjes oververhitten.
  2. Verwijder 100 ul virale transportmedium voor RNA-extractie.
    1. Gebruik een high-throughput (96 well plaat formaat) magnetische bead platform voor het extraheren van RNA uit een groot aantal monsters. 31
  3. Met real-time reverse transcriptase-PCR testen voor de snelle detectie influenza A virus. 31

4. Isolatie van influenza A-virus uit nasale Wipes

  1. Ontdooi de zoals hierboven beschreven in paragraaf 3.1
  2. Behandel ontdooide monsters met gentamicinesulfaat (1000gg / ml), amfotericine B (22,5 ug / ml) en kanamycine sulfaat (325 ug / ml).
  3. Inoculeren in Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epitheelcellen zoals eerder beschreven. 32

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Succesvol gebruik van deze werkwijze levert rRT-PCR resultaten die, samen met het gebruik van een interne controle tijdens de RNA-extractie en PCR-rRT, toon monsters geen PCR-inhibitoren bevatten milieuvoordelen vuil opgehaald tijdens de bemonstering. Na monster inenting moet virusisolatie putten vrij van zichtbare milieu puin van het monster. Er is redelijke overeenstemming tussen rRT-PCR resultaten en virusisolatie resultaten met het begrip dat PCR levert vaak een hoger IAV positief tarief dan virusisolatie omdat PCR ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Verzamelen van monsters van varkens met behulp van polyester getipt neusuitstrijkjes is nuttig gebleken bij het uitvoeren van IAV surveillance; Het gebruik van de neuswat procedure belemmert surveillance inspanningen vanwege het vereiste gebruik van een strik beperking. Nasale doekjes vertegenwoordigen een verfijning van de huidige varkens bemonstering technieken om stress op mensen en varkens te minimaliseren tijdens de monstername. Hoewel de methode ontwikkeld en gevalideerd voor tentoonstelling varkens instellingen, ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk is gedeeltelijk gefinancierd met federale fondsen van de Centers of Excellence for Influenza Research and Surveillance (CEIRS), National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, in het kader van Contract Nr. HHSN272201400006C.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BBL Brain Heart InfusionBecton, Dickinson and Company211059
Penicillin G Sodium SaltMP Biomedicals, LLC0211945371500 u/mg
Streptomycin SulfateAMRESCO LLC0382
Gentamicin SolutionMediatech, Inc.30-005-CR50 mg/ml
Amphotericin B SolutionFisherS 24 25250 ug/ml
Kanamycin SulfateTeknovaK21055000 ug/ml
TPP Rapid Filtermax SystemTPP Techno Plastic Products AG 99150
Nalgen Diagnostic BottlesThermo Scientific342002-9025HDPE met wit PP-sluiting
Dermacea Gaasje, 8 lagenCovidien4412115,08 cm × 5,08 cm (2 in. × 2 in) 
Nitrile OnderzoekshandschoenenSaftey Choice19-170-010 (A-D)

Referenties

  1. Ma, W., Kahn, R. E., Richt, J. A. The pig as a mixing vessel for influenza viruses: Human and veterinary implications. J. Mol. Genet. Med. 3 (1), 158-166 (2008).
  2. Nelson, M. I., Vincent, A. L. Reverse zoonosis of influenza to swine: new perspectives on the human-animal interface. Trends Microbiol. 23, (2015).
  3. Zhou, N. N., et al. Genetic reassortment of avian, swine, and human influenza A viruses in American pigs. J. Virol. 73 (10), 8851-8856 (1999).
  4. Webby, R. J., et al. Evolution of swine H3N2 influenza viruses in the United States. J. Virol. 74 (18), 8243-8251 (2000).
  5. Vincent, A., et al. Review of influenza A virus in swine worldwide: a call for increased surveillance and research. Zoonoses Public Health. 61 (1), 4-17 (2014).
  6. Karasin, A. I., Olsen, C. W., Anderson, G. A. Genetic characterization of an H1N2 influenza virus isolated from a pig in Indiana. J. Clin. Microbiol. 38 (6), 2453-2456 (2000).
  7. Zhou, N. N., et al. Emergence of H3N2 reassortant influenza A viruses in North American pigs. Vet. Microbiol. 74 (1-2), 47-58 (2000).
  8. Corzo, C. A., et al. Active Surveillance for Influenza A Virus among Swine, Midwestern United States, 2009-2011. Emerg. Infect. Dis. 19 (6), 954-960 (2013).
  9. Lorusso, A., et al. Genetic and antigenic characterization of H1 influenza viruses from United States swine from 2008. J. Gen. Virol. 92 (Pt 4), 919-930 (2011).
  10. Loving, C. L., et al. Efficacy in pigs of inactivated and live attenuated influenza virus vaccines against infection and transmission of an emerging H3N2 similar to the 2011-2012 H3N2v. J. Virol. 87 (17), 9895-9903 (2013).
  11. Vincent, A. L., et al. Efficacy of inactivated swine influenza virus vaccines against the 2009 A/H1N1 influenza virus in pigs. Vaccine. 28 (15), 2782-2787 (2010).
  12. Smith, G. J., et al. Origins and evolutionary genomics of the 2009 swine-origin H1N1 influenza A epidemic. Nature. 459 (7250), 1122-1125 (2009).
  13. Vijaykrishna, D., et al. Reassortment of Pandemic H1N1/2009 Influenza A Virus in Swine. Science. 328 (5985), 1529(2010).
  14. Ducatez, M. F., et al. Multiple Reassortment between Pandemic (H1N1) 2009 and Endemic Influenza Viruses in Pigs, United States. Emerg. Infect. Dis. 17 (9), 1624-1629 (2011).
  15. Jhung, M. A., et al. Outbreak of variant influenza A(H3N2) virus in the United States. Clin. Infect. Dis. 57 (12), 1703-1712 (2013).
  16. Vincent, A. L., et al. Characterization of an influenza A virus isolated from pigs during an outbreak of respiratory disease in swine and people during a county fair in the United States. Vet. Microbiol. 137 (1-2), 51-59 (2009).
  17. Killian, M. L., et al. Simultaneous Infection of Pigs and People with Triple-Reassortant Swine Influenza Virus H1N1 at a U.S. County Fair. Zoonoses Public Health. 60 (3), 196-201 (2013).
  18. Wong, K. K., et al. Outbreak of influenza A (H3N2) variant virus infection among attendees of an agricultural fair, Pennsylvania, USA, 2011. Emerg. Infect. Dis. 18 (12), 1937-1944 (2011).
  19. Bowman, A. S., et al. Molecular evidence for interspecies transmission of H3N2pM/H3N2v influenza A viruses at an Ohio agricultural fair, July 2012. Emerg. Microbes. Infect. 1 (10), e33(2012).
  20. Wells, D. L., et al. Swine influenza virus infections. Transmission from ill pigs to humans at a Wisconsin agricultural fair and subsequent probable person-to-person transmission. JAMA. 265 (4), 478-481 (1991).
  21. Bowman, A. S., et al. Swine-to-human transmission of influenza A(H3N2) virus at agricultural fairs, Ohio, USA, 2012. Emerg. Infect. Dis. 20 (9), 1472-1480 (2012).
  22. Bowman, A. S., Nolting, J. M., Nelson, S. W., Slemons, R. D. Subclinical influenza virus A infections in pigs exhibited at agricultural fairs, Ohio, USA, 2009-2011. Emerg. Infect. Dis. 18 (12), 1945-1950 (2012).
  23. Gray, G. C., et al. Influenza A(H1N1)pdm09 Virus among Healthy Show Pigs, United States. Emerg. Infect. Dis. 18 (9), 1519-1521 (2012).
  24. Van Reeth, K., Brown, I. H., Olsen, C. W. Ch. 40, Influenza virus. Diseases of Swine. Zimmerman, J. J. , Wiley-Blackwell. 557-571 (2012).
  25. Culhane, M. R., Detmer, S. E. Ch. 21, Sample types, collection, and transport for influenza A viruses of swine. Methods in Molecular Biology. Spackman, E. Animal Influenza Virus, Methods in Molecular Biology; 1161. 259-263 (2014).
  26. Sheldon, C. C., Sonsthagen, T., Topel, J. A. Animal Restraint for Veterinary Professionals. , Mosby. (2006).
  27. Detmer, S. E., Patnayak, D. P., Jiang, Y., Gramer, M. R., Goyal, S. M. Detection of Influenza A virus in porcine oral fluid samples. J. Vet. Diagn. Invest. 23 (2), 241-247 (2011).
  28. Goodell, C. K., et al. Probability of detecting influenza A virus subtypes H1N1 and H3N2 in individual pig nasal swabs and pen-based oral fluid specimens over time. Vet. Microbiol. 166 (3-4), 3-4 (2013).
  29. Romagosa, A., Gramer, M., Joo, H. S., Torremorell, M. Sensitivity of oral fluids for detecting influenza A virus in populations of vaccinated and non-vaccinated pigs. Influenza Other Respir. Viruses. 6 (2), 110-118 (2012).
  30. Edwards, J. L., et al. Utility of snout wipe samples for influenza A virus surveillance in exhibition swine populations. Influenza Other Respir. Viruses. 8 (5), 574-579 (2014).
  31. Zhang, J., Harmon, K. M. Ch. 23, RNA extraction from swine samples and detection of influenza A virus in swine by real-time RT-PCR. Animal Influenza Virus. Spackman, E. , Methods in Molecular Biology; 1161. 277-293 (2014).
  32. Zhang, J., Gauger, P. C. Ch. 22, Isolation of swine influenza virus in cell cultures and embryonated chicken eggs. Animal Influenza Virus. Spackman, E. , Methods in Molecular Biology; 1161. 265-276 (2014).
  33. Bowman, A. S., et al. The Inability to Screen Exhibition Swine for Influenza A Virus Using Body Temperature. Zoonoses Public Health. , (2015).
  34. Prickett, J. R., Kim, W., Simer, R., Yoon, K. J., Zimmerman, J. Oral-fluid samples for surveillance of commercial growing pigs for porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus type 2 infections. J. Swine Health Prod. 16 (2), 86-91 (2008).
  35. Prickett, J., et al. Detection of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in porcine oral fluid samples: a longitudinal study under experimental conditions. J. Vet. Diagn. Invest. 20 (2), 156-163 (2008).
  36. Pepin, B., Liu, F. F., Main, R., Ramirez, A., Zimmerman, J. Collection of oral fluid from individually housed sows. J. Swine Health Prod. 23 (1), 35-37 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Surveillance bij varkensmonsternameBHI-bouillonantibioticumoplossingviraal transportgaaskatoenlage stress
Nasale Doekjes voor het influenza A-virus detectie en isolatie van Varkens
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.