Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Beeldvorming van neutrofielen en monocyten in Mesenteriale Veins door Intravitale Microscopie op verdoofd muizen in Real Time

10.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53314

⸱

16 november 2015

 ,  , 
1Department of Pathology and Immunology, University of Geneva

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een protocol om het gedrag van neutrofielen en monocyten in mesenteriale aderen onder stabiele en inflammatoire omstandigheden te monitoren met behulp van intravitale confocale microscopie op geanesthetiseerde muizen.

Samenvatting

Efficiënte immuunrespons afhangt van snelle mobilisatie bloed leukocyten naar de plaats van infectie of letsel. Onderzoeken leukocytenmigratie in vivo is cruciaal voor het begrijpen van de moleculaire basis van de migratie van leukocyten en interactie met vasculaire endothelium. Een krachtige aanpak omvat opklaren op transgene muizen die fluorescerende eiwitten in de cellen van belang.

Hier presenteren we een protocol voor imaging monocyten en neutrofielen in de CX 3 CR1 GFP / wt muis iv geïnjecteerd met oranje kleurstof gelabelde neutrofielen met een omgekeerde confocale microscoop. Time-lapse films verzameld van 30 min tot enkele uren beeldvorming kan de analyse van leukocyten gedrag mesenterische aderen onder zowel statische en ontstekingsaandoeningen. We beschrijven ook de stappen om lokaal opwekken bloedvat ontsteking met TLR2 / TLR1 agonist Pam3SK4 en bewaken van de subsequent rekrutering van neutrofielen en monocyten.

De gepresenteerde techniek kan ook worden gebruikt om andere populaties van leukocyten controleren en onderzoeken moleculen betrokken bij leukocyt rekrutering handel of op andere stimuli of transgene muizen.

Inleiding

Neutrofielen en monocyten zijn cellen van het aangeboren immuunsysteem die continu circuleren in het bloed. Bij verwonding of infectie, inflammatoire signalen veroorzaken leukocyten diapedesis in beschadigde en geïnfecteerde weefsels, hierin het initiëren van een cellulaire immuunrespons 1-3. De snelheid van leukocyten mobilisatie bepaalt de positieve uitkomst van de immuunrespons. Deze ingewikkelde processen zich op specifieke moleculen (bv selectines, endotheel-gebonden chemokinen) aanwezig op het ontstoken endotheel waarmee de instelling van hechtmiddel contacten tussen circulerende leukocyten en het endotheel 1-3 .Om inzichten over de moleculen betrokken bij het ​​leukocyt krijgen recruitment cascade, is het belangrijk om de kinetiek van celrecrutering visualiseren en het gedrag van elke cel / populatie volgen. Een effectieve methode houdt intravitale microscopie op transgene muizen die fluorescerende eiwitten in cellen van belang.

content "> Tot op heden verschillende manieren gebruikt intravitale microscopie ontwikkeld om beeld het vaatstelsel 4,5. Bijvoorbeeld, beeldvorming van het oor dermis vasculatuur of mesenterische aderen door intravitale confocale microscopie werd gebruikt om het gedrag van muizen patrouilleren Ly6C lage monocyten en menselijke identificeren CD14 dim CD16 + monocyten aan de luminale zijde van bloedvaten onder stabiele omstandigheden 6-8. De muis cremaster vasculatuur model wordt vaak gebruikt om het gedrag van neutrofielen of inflammatoire Ly6C hoge monocyten onder ontstekings- of ischemische aandoeningen in transgene muizen te volgen. In dat geval wordt cremaster gestimuleerd via scrotum injectie van IL1β, CCL2, TNFP of fMLP. Na 2-4 uur, weefsels worden vervolgens chirurgisch exteriorized en intravitale confocale microscopie 11/09 geanalyseerd.

Het volgende protocol beschrijft een werkwijze voor monocyten en neutrofielen tegelijk met elke monitoromgekeerde fluorescentie confocale microscoop. Verder Home onze methode hoe het hetzelfde schip vóór (steady state conditie) en na ontsteking en hoe de kinetiek van leukocyten werving volgen. Hiervoor maken we gebruik van de CX 3 CR1 GFP / wt muis, wiens monocyten uiten eGFP, iv geïnjecteerd met een oranje kleurstof gelabelde muizen neutrofielen. Met behulp van een omgekeerde confocale microscoop, is het mogelijk (1) op te sporen en te analyseren het patrouilleren Ly6C laag monocyten onder stabiele omstandigheden en (2) voor de aanwerving van zowel monocyten en neutrofielen in hetzelfde vat na lokale ontsteking te volgen. Hier maken we de inflammatoire aandoeningen met behulp van de TLR2 / TLR1 agonist Pam3CSK4 12. Bovendien kunnen dergelijke beeldvorming bijdragen tot de rol van specifieke moleculen van interesse in de verschillende stappen van de rekrutering van leukocyten cascade bepalen of uitgevoerd op bepaalde knock-out muizen of in aanwezigheid van blokkerende antilichamen 6,9,13.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Animal procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele Ethische Commissie van de Animal Care in Genève, Zwitserland en de kantonrechter Veterinair Bureau. Toelatingsnummer GE / 63/14.

1. Voorbereiding van een enkele celsuspensie van Bone Marrow

  1. Offer muis (8-12 weken oud) door cervicale dislocatie. Steriliseren achterpoten met 70% ethanol. Verwijder het vel van de achterpoten.
  2. Ontleden muis scheen- en dij- en verwijder weefsel van benen met een scalpel. Spoel de benen met 90% ethanol en plaats in een cultuur schotel gevuld met PBS.
  3. Onder de cultuur kap, schone tissue van dijbenen en scheenbeen met een scalpel en apart op kniegewricht. Snijd de uiteinden van de botten.
  4. Flush beenmerg van elk been met behulp van een 23G naald en een 1 ml injectiespuit gevuld met opstelling medium (fenolrood-vrij DMEM / F12, 1% serum rat) in een 50 ml buis schroef. Verstoren celaggregaten door subtiel passage door de 23G needle en een spuit 1 ml. Breng totale volume op 25 ml met de voorbereiding medium.
  5. Centrifuge 250 xg, 5 min, 4 ° C. Teruggooi supernatant. Resuspendeer pellet in 1 ml Red Blood Cell Lysis RBLC buffer (8,3 g NH4Cl, 1 g NaHCO 3, 1 ml EDTA (100 mM), compleet 1 L met gedestilleerd water, filtreren 0,22 pm) in een 15 ml schroef buis. Incubeer 30 sec op ijs.
  6. Voeg 10 ml van de voorbereiding middelgrote en centrifuge 250 xg, 5 min, 4 ° C. Gooi supernatant en resuspendeer in 2 ml voorbereiding medium.

2. neutrofielen Verrijking door negatieve selectie

  1. Voeg 150 ul van Mouse neutrofielen verrijking cocktail (celisolatie platform kit zoals EasySep). Meng en incubeer op ijs gedurende 10 minuten.
  2. Voeg 10 ml van fenolrood vrij DMEM. Inverteer eens en centrifugeer 250 xg, 3 min, 4 ° C.
  3. Teruggooi supernatant. Resuspendeer pellet in 1,75 ml voorbereiding medium in 5 ml polystyreen ronde bodem buizen. Voeg 250 ul BiotIn de selectie van de cocktail. Meng en incubeer op ijs gedurende 10 minuten.
  4. Vortex de magnetische deeltjes (van het celisolatie platform kit) gedurende 30 sec deeltjes mengen. Voeg 500 ul van magnetische deeltjes celsuspensie. Meng en incubeer op ijs gedurende 10 minuten.
  5. Plaats de buis in de magneet. Wacht 3 min.
  6. Inverteer de magneet op een nieuwe 5 ml polystyreen rondbodem pijpen naar de gewenste ongelabelde cellen te verzamelen. Heeft de laatste druppel opknoping in de buis niet te nemen. Ongewenste cellen in de buis in de magneet blijven. Gooi deze buis in een biologisch gevaarlijk afval.
  7. Plaats de nieuwe buis in de magneet. Wacht 3 min.
  8. Inverteer de magneet op een nieuwe 15 ml schroef buis naar de gewenste ongelabelde cellen te verzamelen. Heeft de laatste druppel opknoping in de buis niet te nemen.
  9. Volledige volume op 5 ml met fenolrood vrij DMEM.

3. Etikettering van neutrofielen

  1. Voeg 0,5 gl van een oranje kleurstof zoals Cell Tracker Orange (werkconcentratie1 uM, CMRA - chloormethyl-RODOL-acetaat, voorraad 10 mM in DMSO). Incubeer 2 min bij 37 ° C.
  2. Voeg 2,5 ml preparaat medium. Centrifuge 250 xg, 5 min, 4 ° C.
  3. Teruggooi supernatant. Resuspendeer pellet in 1 ml voorbereiding medium in een 1,5 ml buis.
  4. Neem een ​​monster te tellen met hematocytometer.
  5. Incubeer 5 minuten bij 37 ° C. Centrifuge 250 xg, 5 min, 4 ° C.
  6. Teruggooi supernatant. Resuspendeer pellet in 1 ml PBS. Centrifuge 250 xg, 5 min, 4 ° C te wassen.
  7. Teruggooi supernatant. Resuspendeer pellet als 10x10 6 cellen per 100 ul PBS. Houd op ijs tot iv injectie. Opmerking cellen worden iv geïnjecteerd zo snel mogelijk. 6-12x10 6 neutrofielen / muis worden gewoonlijk verkregen.

4. Muis Voorbereiding voor intravitale Microscopie

OPMERKING:.. Stap 4,1) en 4,2) dienen aan het begin van de proef worden uitgevoerd om langere wachttijd van gemerkte neutrofielen aan ic voorkomene.

  1. Weeg de CX 3 CR1 GFP muis (8-12 weken oud).
  2. Bereid 800 pi anesthesie (ketamine 60 mg / kg xylazine 4,5 mg / kg, acepromazone 1,75 mg / kg in PBS).
  3. Verdoven muis. Ip injectie met 200 gl / 20 g muis. Controle verdoving door teen knijpen en door het controleren van de ademhaling.
  4. Injecteren neutrofielen (10x10 6 cellen in 100 ul PBS) intraveneus gebruik van de laterale staart aderen of de retro-orbitale sinus, op het gemak van de experimentator.
  5. Zet de muis op verwarming pad en de bescherming van de ogen met oculaire gel.
  6. Een glas dekglaasje (35 mm diameter) wordt in een 10 cm weefselkweek schotel, die een diameter van 30 mm gat. Gebruik olie is de weefselkweekplaat in contact met het dekglaasje te handhaven.
  7. Incise buikhuid met een schaar om het buikvlies bloot. Incise buikvlies met een schaar om darm bloot.
  8. Voeg 200 gl PBS (voorverwarmd bij 37 ° C) in de peritoneal holte. Neem de muis in je hand en zet het gezicht naar beneden, zodat de darm komt uit de buikholte met een zachte druk. Plaats de muis in de weefselkweekplaat.
  9. Zachtjes deroll de darm met gesteriliseerd wattenstaafjes op de dekglaasje om de mesenteriale vaten bloot.
  10. Snijd papieren zakdoekjes in bands en bevochtig ze met 37 ° C verwarmd PBS. Immobiliseer de darm met stukjes papier weefsels naar de mutaties als gevolg van peristaltiek verminderen.
  11. Zet de weefselkweek schotel en de muis in de 37 ° C thermostaat is ruimte op de op maat gemaakte tray stadium van het omgekeerde microscoop. Invoering van een spuit met anesthetica sc in de achterpoot. OPMERKING: Bovendien kan de muis zuurstof (0,5 l / min) met een masker te ontvangen.
  12. Controle muis voor anesthesie door teen knijpen en het controleren van de ademhaling elke 30 min. Indien nodig, zorgen voor een boost van anesthetica (20 ul) om verdoving goed te onderhouden. NIETE: Het drogen van het vaatstelsel moet worden vermeden. Derhalve wordt de vochtigheid gehandhaafd door regelmatig bevochtigen van het papier gebruikte weefsels naar de darm immobiliseren bij 37 ° C verwarmde PBS.

5. Het meten van neutrofielen en monocyten Gedrag in Ontstoken Schepen In Vivo met Intravitale Microscopie

  1. Set lasers om 488- en 561- op het laagste nodige macht om laser-geïnduceerde fototoxiciteit voorkomen. In onze experimenten, het lager is dan 0,5%. Intensiteit van GFP in monocyten en oranje kleurstof in neutrofielen is zo helder dat meestal 0,3% is genoeg. NB: Dit is een laservermogen van 0,15-0,25 mW met ons systeem.
  2. Acquire beelden van 512 x 512 pixels (dwz 635 micrometer) in 2,2 sec met een open pinhole met de 20X droge doelstelling van de omgekeerde microscoop. Gebruik een z-diepte van 10 tot 20 urn, die voldoende signaal met het laservermogen laag zorgt.
    OPMERKING: We meestal experimenten uit te voeren met een z-diepte tussen de 12 tot 1656, m. Bij gepresenteerde figuren en films, de z-diepte 20 urn. Fasecontrast maakt de identificatie van endotheliale wanden en de beeldvorming wordt uitgevoerd op mesenterische aderen. Sinds patrouilleren cellen bewegen heel langzaam met een snelheid van 5-10 um / min 6, het opnemen van een veld van belang om de 20 sec is bevredigend. Met de beschreven instellingen, de gemotoriseerde fase maakt de opname van maximaal 7 interessegebieden tegelijk.
  3. Plaats de muis en de mesenteriale vaten in de thermostaat kamer van de microscoop zijn hen in staat stellen om te herstellen van de voorbereiding voor de 30 minuten vóór de overname van de eerste film. Gedurende deze tijd kiest verschillende interessegebieden. Focus op het luminale oppervlak van het vat dichtst bij het doel. Indien nodig, gebruik maken van de lichte auto-fluorescentie van endotheel om scherp te stellen.
    OPMERKING: Chirurgie tijdens muis voorbereiding iets benadrukt het endotheel. Bijgevolg rollen van neutrofielen en/ of monocyten kan worden waargenomen in de eerste 15 min na bereiding muis.
  4. Het opnemen van een film voor het ene beeld elke 20 seconden 30 min onder stabiele omstandigheden.
    OPMERKING: De software krijgt elk veld van interesse in 2,2 seconden en de gemotoriseerde podium beweegt automatisch van het ene gebied naar het andere. Het gaat terug naar de eerste positie binnen 20 seconden gedurende de 30 min van de opname film.
  5. Om bloed ontsteking initiëren vat, voeg een druppel van 20 ui PBS dat 100 ug TLR2 / TLR1 agonist Pam3CSK4 12 direct op de afgebeelde vaten.
  6. Controle van de focus voor elk veld van belang.
    OPMERKING: Bij wording, er altijd kleine veranderingen van focus op z-as. Ondanks de 10-20 urn Z-diepte kan dit resulteren in een afname van de fluorescentie-intensiteit. Daarom handmatig elk aandachtsgebied heroriënteren aan het einde van elke film, indien nodig. Record Films voor 30 minuten periodes tot 3 uur aanTal na aanvang van de ontsteking.
  7. Aan het einde van het experiment, offeren verdoofde muizen door cervicale dislocatie.

6. Generatie van filmbestanden en Tracking leukocyten

LET OP: De Nikon acquisitie software genereert .nd2 bestanden, maar de volgende procedure zou vergelijkbaar met andere software en merken zijn.

  1. Bestanden te exporteren als tiff-serie.
  2. Ga naar ImageJ software (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Importeer de tiff-serie. Elk kanaal als een ander bestand.
  3. Breng een mediaan filter met een straal van 2,0 pixel voor de groene en rode kanalen om ruis te verminderen (Proces> Filters> Median ...).
  4. Bestanden converteren naar binaire (Proces> Binary> Maak Binary). De software in staat stellen de drempelwaarde voor elk beeld berekenen.
  5. Kanalen in een reeks beelden (Afbeelding> Kleur> Kanalen samenvoegen ...) samen te voegen. Selecteer de monocyten in de green-kanaal, de neutrofielen in het rode kanaal en het uitgezonden licht in de grijze kanaal.
  6. Omzetten gestapelde beelden in RGB kleuren (Afbeelding> Kleur> stapel RGB).
  7. Bestand opslaan als .avi
  8. De gegevens worden ingevoerd en gebundeld in Imaris software (Bitplane). Bewegingen van monocyten en neutrofielen worden dan gevolgd met behulp van de Tracking Wizard Spot.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het manuscript beschrijft een geoptimaliseerd protocol om het gedrag van monocyten en neutrofielen in het mesenterische aderen van verdoofde muizen in real time gemakkelijk volgen. Het gebruik van een 37 ° C-thermostaatregeling kamer is verplicht om de temperatuur van de muis te behouden en ook door temperatuursafhankelijke beweging van leukocyten. Bereiding van de muis is weergegeven in figuur 1. Figuur 2 toont de stippellijn gezien onder de microscoop. Doorgelaten licht maakt de ident...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De in dit manuscript beschreven methoden zorgen voor een consistente aanpak om efficiënt studeren monocyten en neutrofielen gedrag in mesenteriale aderen onder stabiele en inflammatoire aandoeningen.

De cruciale stap van het preparaat is de immobilisatie van de darm met PBS bevochtigde weefsels. Als dit goed wordt uitgevoerd, worden mesenteriale vaten mooi bloot op het dekglaasje voor het overname. Dit maakt de selectie van verscheidene gebieden van belang leukocyten gedrag mesenterische ade...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door EMBO (voor Y.E.), Foundation Machaon (voor Y.E.) en SNSF (voor B.A.I.). We danken de Bioimaging Core Facility voor de beschikbaarheid van de Nikon A1r microscoop en de technische assistentie. We danken mevrouw Clarissa Bartley voor de Engelse correctie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
5 ml polystyreen ronde bodembuizen Beckton Dickinson352058
10x CFI Plan Apochromat 0.45   DT:4mm Nikon
20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm Nikon
Cell Tracker Orange CMRA KleurstofLife TechnologiesC34551
EasySep MagneetStem Cell Technologies18000
EasySep Muis Neutrofiel VerrijkingskitStem Cell Technologies19762
EDTASigma AldrichE6758
FCSPAAA15-042
Immersiesmeer Type ANikonelke viskeuze olie 
Life Box Temperatuur Controle SysteemLife Imaging
NaHCO3Sigma AldrichS5761
NH4ClSigma AldrichA9434
Nikon A1R confocale microscoopNikonA1Rgeïnverteerde microscoop, gemotoriseerde x/y/z-standaard, NIS elementen software
PBSLife TechnologiesD8537
fenolroodvrij DMEM/F12Life Technologies21041-025elke phenolroodvrije medium is geschikt
PAM3CSK4Invivogentlrl-pmsreconstitueer in PBS
RattenserumStem Cell Technologiesinbegrepen in EasySep Muis Neutrofiel Verrijkingskit
Weefselkweekschotel 100TPP93100

Referenties

  1. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
  2. Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).
  3. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41, 694-707 (2014).
  4. Ley, K., et al. Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall. Methods Enzymol. 445, 255-279 (2008).
  5. Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).
  6. Auffray, C., et al. Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior. Science. 317, 666-670 (2007).
  7. Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33, 375-386 (2010).
  8. Hanna, R. N., et al. The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes. Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).
  9. Woodfin, A., et al. The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo. Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).
  10. Proebstl, D., et al. Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo. J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).
  11. Wantha, S., et al. Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes. Circ Res. 112, 792-801 (2013).
  12. Ozinsky, A., et al. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).
  13. Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498, 371-375 (2013).
  14. Carlin, L. M., et al. Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal. Cell. 153, 362-375 (2013).
  15. Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. , (2015).
  16. Iqbal, A. J., et al. Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo. Blood. 124, e33-e44 (2014).
  17. Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PloS One. 6, e25109(2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

NeutrofielbeeldvormingMonocyten trackingConfocale microscopieLeukocytenmigratieTLR2 TLR1 agonistCX3CR1 GFP muizenBeenmergisolatieCelmarkering
Beeldvorming van neutrofielen en monocyten in Mesenteriale Veins door Intravitale Microscopie op verdoofd muizen in Real Time
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.