Kwantificering van Intra-peritoneale eierstokkanker Metastase

Samenvatting

Eierstokkankermetastase wordt gekenmerkt door talrijke diffuse intra-peritoneale laesies, waardoor nauwkeurige visuele kwantificering van de tumorbelasting een uitdaging is. Hierin beschrijven we een methode voor in situ en ex vivo kwantificering van de metastatische tumorbelasting met behulp van rood fluorescerend proteïne (RFP)-gelabelde tumorcellen en optische beeldvorming.

Samenvatting

Epitheeliaal ovariumkanker (EOC) is de belangrijkste doodsoorzaak door gynaecologische maligniteit in de Verenigde Staten. Mortaliteit is te wijten aan de diagnose van 75% van de vrouwen met late stadia van de ziekte, wanneer metastasen al aanwezig zijn. EOC wordt gekenmerkt door diffuse en wijdverbreide intra-peritoneale metastasen. Cellen die van de primaire tumor losraken, verankeren zich in het mesotheel dat de buikholte bekleedt, evenals in het omentum, wat resulteert in multi-focale metastasen, vaak in aanwezigheid van peritoneale ascites. In ons laboratorium zijn we gericht op een meer gedetailleerd begrip van factoren die het metastatische succes van EOC reguleren. Echter, het kwantificeren van de metastatische tumorbelasting vertegenwoordigt een significante technische uitdaging vanwege het grote aantal, kleine omvang en brede verdeling van laesies door het hele peritoneum. Hierin beschrijven we een methode voor analyse van EOC-metastasen met behulp van cellen gelabeld met rood fluorescerend proteïne (RFP) gekoppeld aan in vivo multispectrale beeldvorming. Na intra-peritoneale injectie van RFP-gelabelde tumorcellen, worden muizen wekelijks geïmagerd tot het tijdstip van opoffering. Op dit moment wordt de peritoneale holte chirurgisch blootgelegd en worden organen in situ geïmagerd. Gedissecteerde organen worden vervolgens op een gelabelde transparante sjabloon geplaatst en ex vivo geïmagerd. Verwijdering van weefselautofluorescentie tijdens beeldverwerking met behulp van multispectrale ontmenging maakt nauwkeurige kwantificering van de relatieve tumorbelasting mogelijk. Deze methode is nuttig in een verscheidenheid van toepassingen, inclusief therapeutische studies om verbindingen te evalueren die metastase kunnen remmen en daardoor de algehele overleving kunnen verbeteren.

Inleiding

Epitheliale eierstokkanker (EOC) is de meest voorkomende doodsoorzaak van gynaecologische maligniteit, met een geschatte 21.290 nieuwe diagnoses in de VS in 2015 en naar schatting 14.180 doden ^1. De overgrote meerderheid (> 75%) van de vrouwen gediagnosticeerd met late stadia van de ziekte (stadium III of IV) gekenmerkt door diffuse intraperitoneale metastase en slechte prognose. Terugkeer van de ziekte in de buikholte na eerstelijns chemotherapie is ook gebruikelijk en vormt een belangrijke oorzaak van sterfte ^2,3. EOC uitzaaiing door een uniek mechanisme waarbij zowel rechtstreeks in het verlengde van de primaire tumor naburige peritoneale organen en door dissociatie of afstoten van cellen uit de primaire tumor oppervlak als enkele cellen of meercellige aggregaten. De cellen worden afgeworpen in de buikholte, waarin ze zich verzetten tegen-detachement geïnduceerde apoptose ^4. Ophoping van peritoneale ascites komt vaak voor, zoals schuur tumorcellen blokkeren peritoneale lymfedrainage en tumors produceren groeifactoren die vasculaire permeabiliteit te wijzigen. Een gedeelte van loods tumorcellen hechten aan het oppervlak van peritoneale organen en structuren zoals darmen, lever, omentum en mesenterium, waarna ze verankeren en prolifereren meerdere wijd verspreide secundaire laesies ^3,5 produceren. Hematogene metastase is ongewoon. Zo klinische behandeling bestaat gewoonlijk van cytoreductieve chirurgie met inbegrip van "optimale debulking", gedefinieerd als resectie van alle zichtbare tumor (hoe klein ook). Volledige cytoreductie gaat gepaard met een aanzienlijke toename van de totale overleving ^6,7 en wordt geassocieerd met de uitdaging van identificatie en verwijdering van laesies <0,5 cm.

Kleine diermodellen hebben bewezen nut in eierstokkanker onderzoek in het verbeteren van ons begrip van de progressie van de ziekte en de identificatie van prognostische biomarkers en het testen van nieuwe chemotherapieën of combinatietherapie benaderingen. Als de primaireplaats van eierstokkanker incidentie en metastase is de peritoneale holte orthotopische modellen van EOC metastase omvatten de analyse en karakterisering van intraperitoneale ziekte. Hoewel recente verbeteringen in de mogelijkheid om beelden op tumorcellen hebben, zelfs op de enkele cel niveau, bestaan ​​er nog steeds grote moeilijkheden bij het kwantificeren van de metastatische tumorlast van EOC. Deze problemen resulteren uit het aantal, grootte en anatomische locatie van metastatische laesies. Verder bestaat er behoefte aan label kankercellen te onderscheiden van normale gastheercellen. Eerdere studies hebben antilichamen gebaseerde labeling protocollen of transfectie van tumorcellen met luciferase ^8,9 gebruikt. Direct fluorescent labeling van kankercellen werd eerst beschreven door Chishima en medewerkers in 1997 ^10. Fluorescente labels geen toevoeging van exogeen substraat vragen en tevens uitstekende tumorcel specificiteit, een meer effectieve manier om kanker metastase ^11,12 bijhouden .

Hierin beschrijven we een optische imaging methode voor de kwantitatieve analyse van metastatische ziekte met behulp van een syngene orthotope xenograft model bestaat uit rood fluorescerend eiwit (RFP) gemerkte muizen ID8 eierstokkanker cellen ¹³ en immuno-competente C57 / Bl6 muizen. We tonen een nieuwe werkwijze van relatieve kwantificatie tumorlast combineren in vivo en ex vivo beeldvorming onder verwijdering van weefsel auto-fluorescentie. Deze aanpak heeft potentieel nut bij onderzoeken om het effect van specifieke genetische, epigenetische of micro-omgeving aan te passen en / of behandelingen op orgaanspecifieke metastase van eierstokkanker evalueren.

Protocol

Alle in vivo studies werden goedgekeurd door de Universiteit van Notre Dame Animal Care en gebruik Comite en gebruikte vrouwelijke C57 / BL6J muizen.

1. Muizen Ovarian Cancer Cell Culture

1. Maak de ID8 muis eierstokkanker celcultuurmedium als volgt: 1 L Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 4% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline / streptomycine, 5 ug / ml insuline, 5 ug / ml transferrine en 5 ng / ml natriumseleniet.
2. Transduceren ID8 muizen eierstokkanker cellen ¹³ tot Red Fluorescent Protein (RFP) met in de handel aangekocht lentivirale deeltjes uitdrukken RFP en een selectie marker (blasticidine-gen) uit te drukken. Merk op dat groen fluorescerend eiwit kan worden gebruikt, maar geeft een zwakker fluorescentiesignaal.
   1. Onmiddellijk voorafgaand aan transductie, kweekcellen tot 50-70% samenvloeiing en voeg vers medium (zonder penicilline / streptomycine) dat 1 ml polybreen (5 ug / ml uiteindelijke omvatconcentratie).
   2. Voorzichtig pipet RFP-lentivirus (20 gl) druppelsgewijs in de schaal en incubeer bij 37 ^° C gedurende 72 uur. Verwijder medium en geïncubeerd met vers medium gedurende 24 uur. Begin selectie van getransduceerde cellen door toevoeging blasticidine aan het kweekmedium (5 ug / ml) en toezien op rode cellen met behulp van fluorescentie microscopie (Figuur 1).
3. De cultuur-RFP hebben cellen in ID8 medium door enten ongeveer 10 ⁶ cellen in een weefselkweekplaat en dagelijks visualiseren met behulp van een lichtmicroscoop totdat de cel monolaag confluent.
4. Bij samenvloeiing, de oogst van de cellen met behulp van trypsine (0,25%, 3 min) en de terugkeer van de kolf met het 37 ^o C incubator totdat de cellen worden losgemaakt.
5. Neutraliseren van de trypsine met 6 ml van ID8 kweekmedium dat serum. Pipet op en neer tegen de bodem van de schaal, vervolgens transfer naar een 15 ml conische buis. Centrifugeer bij 1200 tpm gedurende 2 min, daarna zuig het medium met een glass pipet.
6. Was de cellen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) door zachtjes resuspenderen in 6 ml warm PBS en centrifugeren zoals in 1.5 hierboven. Hersuspenderen in PBS tot een eindconcentratie van 5 x 10 ⁶ cellen / ml. Houd cellen warm (37 ^° C) tot injectie.

2. Intra-peritoneale injectie van ID8 cellen en in vivo beeldvorming

1. Injecteer elke muis met 2 ml van de warme ID8 PBS-oplossing voor een totaal van 10 miljoen cellen door intraperitoneale (ip) injectie. Sta tumorcellen groeien in vivo gedurende ongeveer 10 weken met wekelijkse levende imaging.
2. Onmiddellijk na de injectie en elke week daarna, wegen de muizen en vervolgens verdoven elke muis met behulp van isofluorane (2,5% debiet in 0,5 l / min O ₂ flow). Opmerking: De muizen werden gewogen, niet als een kwantitatieve maat van tumorlast, maar een meer algemene maat voor individuele muizen fysieke progressie gedurende de studie. muizen wegents werden vergeleken met hun eigen eerdere gewichtswaarden.
   1. Verdoven muizen door het plaatsen van een isofluorane kamer. Zorg voor een constante verdoving tijdens het scannen door het positioneren van de muis hoofd in de neus-cone voor de blootstelling aan 2,5% debiet isofluorane tijdens de gehele procedure.
3. Gebruik ontharingscrème om het haar op de romp en buik van elke muis verwijderd, als zwarte haren verzwakking van het fluorescentiesignaal veroorzaken. Muizen worden gebaad met warm water na het aanbrengen van de ontharingscrème en gedroogd met RT papieren handdoeken.
4. Terwijl verdoofd, scant het hele lichaam van elke muis met behulp van een klein dier optische imaging-systeem. Hiermee worden alle muizen in een cohort op elk tijdstip. Gebruik de volgende twee stappen protocol (Figuur 2A):
   1. In stap 1, om fluorescent gelabelde (RFP) tumorcellen observeren uitvoeren multispectrale overname in totaal 5 afbeeldingen met excitatie filters van 440 nm, 460 nm, 4 verzamelen80 nm, 520 nm en 540 nm en een emissie van 600 nm filter. Gebruik de volgende acquisitie parameters: een standaard blootstelling van 15 sec, 2 x 2 binning, FOV van 160 mm en f _stop van 1,1.
   2. In stap 2 om het hele dier te observeren, beeld reflectie verwerven met behulp van een open excitatie filter (wit licht), een open emissie-filter, een standaard belichting van 0,2 sec met 2 x 2 binning en een FOV van 16 cm. Opmerking: De werkelijke imaging tijd is ~ 1 min.

3. Mouse Dissection en Image Acquisition

1. Bij live-imaging toont de aanwezigheid van uitgebreide intra-peritoneale ziekte of dieren vertonen ophoping van ascites (zoals blijkt uit een opgezette buik), verlies of winst van het lichaamsgewicht van meer dan 20%, lethargie of andere tekenen van nood, euthanaseren elke muis met behulp van CO ₂ anesthesie gevolgd door cervicale dislocatie.
2. Snijd de huid voren langs de ventrale middellijn van de muis en werd gerichte dissection schaar, vanaf de bovenkant van de dijen naar de onderkant van de ribbenkast. Wees uiterst voorzichtig te snijden door middel van alleen de huidlaag (figuur 2BI). Voorzichtig scheiden de huid van de peritoneale weefsel, en zorg ervoor dat de peritoneale muur niet doorboren.
3. Via gerichte dissectie scharen, zijdelings snijden zowel langs de onderzijde van de ribbenkast en de bovenkant van de dijen twee flappen van de huid is (Figuur 2B ii, iii).
4. Plaats elke muis op zijn buikzijde (buikholte naar beneden kijkend) met de huid flappen opengetrokken en scan elke muis met haar organen in situ met behulp van het kleine dier optische imaging-systeem (figuur 3A, B).
   1. Gebruik dezelfde beeldopname parameters zoals beschreven in 2.4.1.-2.4.2.
5. Verder ontleden van de muis door extractie individuele peritoneale organen zoals lever, omentum / pancreas, maag, middenrif, dunne darm, dikke darm, links en rechts peritoneum, eierstokken, kidneys, mesenterium en vet pad.
   1. Observeren, opsommen, en zichtbare tumoren opnemen op elk orgaan. Gebruik een dikte tot de diameter van elke tumor te meten.
   2. Wijzen tumoren kleiner dan 2 mm in diameter kleine, tussen 2 en 5 mm als medium en groter dan 5 mm zo groot.
6. Plaats de organen op het orgel scanning matrijs (figuur 4) die een vooraf bepaalde locatie identificeert voor elk orgaan. Met PBS om de organen vochtig.
7. Scan elk vel organen met de kleine dieren optisch afbeeldingsstelsel (Figuur 3C, D).
   1. Gebruik dezelfde beeldopname parameters zoals beschreven in stap 2.4.
8. Na het scannen plaats organen in 10% formaldehyde tot verdere verwerking mogelijk te maken voor histologie.

4. Kwantificering van tumorlast in the Fluorescentie Images

1. Om de hoeveelheid auto-fluorescentie in elke multispectrale scan verminderen, eerste unmix de bestanden met software met de kleine dieren afbeeldingssysteem.
   1. Laad eerst de RFP: In Vivo spectrale bestand, gevolgd door de Autofluor: In Vivo Red bestand in het venster Unmixed Afbeeldingen en selecteer Unmix.
2. Exporteer de .bip bestanden als 16 bit .tiff (ongeschaald) formaat.
3. Gebruik ImageJ software (ex vivo organen en daarna het volle muis lichaam met organen in situ).
   1. Gebruik Bestand> Openen om de 16 bit TIFF-bestanden van het orgel scannen template-bestanden te openen in ImageJ.
   2. Onder Afbeelding> Aanpassen> Helderheid / Contrast, ervoor kiezen om de minimum weergegeven waarde op 0 en de maximale weergegeven waarde voor 35.353 en vervolgens onderAfbeelding> Lookup Tables, selecteert Red Hot. Opmerking: Diverse diermodellen hebben verschillende helderheidsniveaus nodig, maar het is belangrijk om de helderheid consistent in een bepaalde studie houden.
   3. Met het gereedschap Selectie uit vrije hand, trek je een free-form regio van belang selectie (ROI) rond elk orgaan en het gebruik van het gereedschap Meetlat (CTRL + M) aan de oppervlakte van elk orgaan te berekenen; opnemen Het oppervlak van elk orgaan in een spreadsheet.
   4. Met de getekende rond elk orgaan ROI, klik met de rechtermuisknop binnen de ROI en selecteer Duplicate om alleen het orgel bevatten.
   5. Terwijl u naar het individu orgel, onder Afbeelding> Aanpassen> Drempel, ervoor kiezen om de drempel van het beeld op een lagere drempelwaarde van + 1200 en een Upper Threshold niveau van + 1700 ONL te selectereny de meest fel fluorescerende regio's en controleer donkere achtergrond te selecteren; selecteer OK. Opmerking: De afbeeldingen kunnen handmatige manipulatie van de drempel schuifknoppen in ImageJ vereisen zodat de eerder helderste gebieden worden geselecteerd voor de analysestap, zoals hierboven getoond. Verschillende ziektemodellen hebben verschillende beperkingen drempel vereist, maar het is belangrijk om de drempelniveaus consistent in een bepaalde studie houden.
   6. Onder Analyze> Analyseer Deeltjes, verander de grootte (pixels ^ 2) tot 10-Infinity, ervoor kiezen om Show: Contouren, controleer dan alleen "Resultaten weergeven" te selecteren en klik op OK om zowel het gebied en ruwe geïntegreerd dichtheden van deze heldere gebieden te meten, geacht tumoren.
   7. Noteer de waarden van de oppervlakte en het Raw geïntegreerde Dichtheid van elke tumor selectie weergegeven in de Resultaten tafel in dezelfde spreadsheet met het orgel oppervlakten.
   8. Onder Analyze> Extra> Calibration Bar, voeg een kalibratie schaal bar om de beelden van de organen. Opmerking: In dit voorbeeld, werd dit gedaan door het veranderen van de locatie naar de rechterbovenhoek, de Fill kleur naar zwart, de Label Kleur White, het aantal labels tot en met 5, de decimalen op 0, de lettergrootte tot 12 en de Zoom factor tot 4,0 en het mogelijk maken Bold tekst.
   9. Onder Bestand> Opslaan als ..., sparen de montage als een .tiff en .Jpeg.
   10. Gebruik Bestand> Openen om het JPEG-bestand van de organen en vervolgens onder Invoegen> Text Box te openen , voeg orgaan labels door een tekstvak onder elk van de drie rijen van organen.
   11. Gebruik Bestand> Openen om elk van de 16 bit TIFF-bestanden van de full body scans in ImageJ openen om van de muis nummer.
   12. Onder Afbeelding> Aanpassen> Helderheid / Contrast, ervoor kiezen om het minimumpakket weergegeven waarde op 0 en de maximale weergegeven waarde naar + 35.353 en vervolgens onder Afbeelding> Lookup Tables, selecteert Red Hot.
   13. Onder Bestand> Opslaan als ..., sparen de montage als een. Tiff en .Jpeg.

5. Data Analysis

1. Voeg de tumor selectiegebieden en ruwe dichtheden geïntegreerd, respectievelijk voor elk orgaan van elke muis en de totale orgel tumor oppervlak per muis opnemen.
2. Normaliseren van de opgenomen gebied en ruwe integrated dichtheidswaarden voor de grootte van elk orgaan door het totale tumor stippellijn totale ruwe geïntegreerde dichtheidswaarden te delen door het overeenkomstige orgaan oppervlak (tabel 1).
3. Bereken en plot de gemiddelde van het genormaliseerde tumor oppervlakken en de genormaliseerde ruwe geïntegreerde densiteitswaarden (Figuur 5A, B).
4. Vergelijk deze gemiddelde waarden die worden verkregen door visueel tellen van de tumoren die tijdens de inspectie van elk orgaan voor metastatische laesies zichtbaar waren voor het blote oog.

Resultaten

Het mechanisme van metastatische ovariumkanker gekenmerkt door zeer diffuse intraperitoneale metastase uit talrijke lesies van verschillende grootte, waaronder meerdere kleine (<2 mm) laesies. Aldus gebruik van RFP gelabelde tumorcellen (figuur 1) en optische beeldvorming verschaft een alternatieve methode voor handmatige telling en meting van verwondingsgrootte. De ontwikkeling van tumor belasting in de tijd kan worden bepaald door wekelijkse weging van muizen en met...

Discussie

In tegenstelling tot onderzoek met humaan ovarium kankercellen die in immuungecompromitteerde muizen moeten worden uitgevoerd, de hierboven beschreven protocol gebruikt immuuncompetente C57 / Bl6 muizen en syngene muizen eierstokkankercellen. Hoewel dit maakt evaluatie van de mogelijke rol van immune infiltraten bij tumorprogressie en metastase, de aanwezigheid van donker haar op het buikoppervlak maakt beeldvorming minder gevoelig. Toepassing van een ontharingscrème om haar voorafgaand aan beeldvorming versterkt beeldv...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning	10-014-CM
Fetal bovine serum	Gibco	10437-028
penicillin/streptomycin
Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement	Sigma	I-1884
Bruker Xtreme small animal imaging system	Bruker Corp.
Bruker Multispectral software	Bruker Corp
lentiviral particles with Red fluorescent protein	GenTarget, Inc.	LVP023
trypsin for cell culture	Corning	25-053-CI
PBS	Corning	21-040-CM
depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion)	aankopen bij de drogisterij	n/a
ImageJ software	http://imagej.nih.gov/ij/		gratis download
dissectie-instrumenten (tang)	Roboz Surgical Instrument	RS 5130
dissectie-instrumenten (Schaar)	Roboz Surgical Instrument	RS 5910