Evaluatie van longmetastase in muizenborsttumorvirus Modellen van kwantitatieve real-time PCR

Samenvatting

Dit protocol wordt beschreven hoe kwantitatieve real-time PCR (QRT-PCR) gebruikt om tumorcel specifieke mRNA die metastase in de muis longweefsel detecteren.

Samenvatting

Metastatische ziekte is de verspreiding van kwaadaardige tumorcellen uit de primaire kankertype naar een verre orgaan en is de primaire oorzaak van kanker-geassocieerde overlijden ^1. Voorkomende plaatsen van metastatische verspreiding omvatten longen, lymfeklieren, hersenen en bot ^2. Mechanismen die metastase rijden zijn intense gebied van kankeronderzoek. Bijgevolg effectieve assays voor uitgezaaide last te meten in verre plaatsen van metastase zijn instrumenteel voor kankeronderzoek. Evaluatie van longmetastasen in borsttumor modellen wordt in het algemeen uitgevoerd door het bruto kwalitatieve observatie van longweefsel na dissectie. Kwantitatieve evaluatie van metastasen momenteel beperkt tot ex vivo en in vivo imaging gebaseerde technieken die gebruiker gedefinieerde parameters vereisen. Veel van deze technieken zijn op het hele organisme niveau in plaats van het cellulaire niveau ^3-6. Hoewel nieuwere beeldvormende methoden gebruik te maken van multi-foton microscopie zijn in staat om metas evaluerenTasis op cellulair niveau ^7, deze zeer elegante procedures zijn meer geschikt voor het evalueren mechanismen van verspreiding dan kwantitatieve beoordeling van metastatische belasting. Hier is een eenvoudige in vitro werkwijze kwantitatief beoordelen metastase gepresenteerd. Met behulp van kwantitatieve real-time PCR (QRT-PCR), kan tumorcel specifieke mRNA worden gedetecteerd in de muis longweefsel.

Inleiding

QRT-PCR analyse is voorgesteld als een werkwijze voor het beoordelen van tumormetastase. Deze werkwijze is voorgesteld als een alternatief voor gebruikers die geïnteresseerd zijn in de beoordeling metastase zijn slechts toegankelijk voor bepaalde apparatuur niet zoals in vivo beeldvormende apparatuur of fluorescentie staat stereoscoop. Een bespreking van de meest gebruikte methoden gepresenteerd, gevolgd door een demonstratie van hoe QRT-PCR-analyse kan worden gebruikt als een afzonderlijke of als gezelschap methode om metastase te beoordelen. Deze procedure heeft het potentieel om een ​​kwantitatieve analyse van metastatische belasting verschaffen.

Standaardmethoden van de bruto-analyse, met inbegrip van visualisatie van de longen onder een stereomicroscoop evenals seriële snijden, gevolgd door hematoxyline en eosine (H & E) kleuring van longweefsel, kwantificeerbaar zijn maar sterk afhankelijk van door de gebruiker gedefinieerde parameters voor het tellen van ^2-5. Bij de evaluatie van hele longen met behulp van een stereomicroscoop, alleen grote oppervlakte uitzaaiingen zijn visible en analyse vereist de onderzoeker om een ​​redelijke kennis van de long anatomische structuur te bepalen wat een metastatische laesie te hebben. Fluorescentielabelling van tumorcellen met een merker zoals GFP en het gebruik van een stereomicroscoop met een lichte kubus met de geschikte excitatie- / emissie maxima (bijv nabij 470/510 nm voor GFP) bevat helpt bij dit proces, maar alleen aan de oppervlakte tumornoduli detecteerbaar . Bovendien fluorescentie van bloed verontreinigingen, die zichtbaar worden onder dezelfde parameters als GFP is, kan leiden tot vals identificeren van mogelijke metastatische laesies.

Snijden van de long, gevolgd door H & E kleuring long metastase visualiseren is een nuttige methode om micrometastasen en andere microscopische processen zoals immune infiltratie te evalueren, maar het gebruik van de gehele long weefsel voor inbedden in paraffine, snijden en kleuringen vereist vaak. Daarom stroomafwaartse procedures niet ideaal na deze method. Hoewel kwantificeerbaar, vereist deze procedure de onderzoeker een groot aantal gekleurde longsecties per dier evalueren om te garanderen dat de analyse rekening voor de gehele 3D-structuur van de longen. Bijgevolg is dit type onderzoek is tijdrovend, kan leiden tot het tellen fout, en analyse leunt zwaar op de onderzoeker discretie.

Verscheidene in vivo beeldvormende technieken (bijvoorbeeld MRI, PET, SPECT) worden momenteel gebruikt uitvoeren of testen biologische processen in experimentele diermodellen ^8. Bioluminescentie beeldvorming is een gemeenschappelijke methode om een bruto weergave van metastase ⁹ verwerven. Deze techniek wordt algemeen op de aanwezigheid van luciferase-reporter-activiteit te evalueren als gevolg van de accumulatie van tumorcellen die zijn ontworpen om een ​​luciferase responselement bevatten, die in bepaalde organen zoals de melkklier na tumorcel implantatie en de longen op spontane metastase verblijven ¹0. Visualisatie van luciferase-activiteit wordt geïnduceerd door de aanwezigheid van luciferine substraat (D-luciferine). Luciferase katalyseert de oxidatieve decarboxylering van D-luciferine tot oxyluciferine genereren bioluminescentie. Terwijl informatief, is deze werkwijze beperkt door verscheidene factoren, waaronder substraat stabiliteit (bijv korte halfwaardetijd), adequate verdeling van substraat hangt af van hoe het wordt geleverd aan proefdieren en lage detectiegevoeligheid ^9. Een belangrijke verdienste van deze techniek is dat het niet-invasief kan worden uitgevoerd op levende dieren, en kan leiden tot de detectie van tumorcellen metastasen in meerdere organen die niet zijn normaliter geoogst dissectie ^9,10.

Een positief aspect van in vivo imaging technieken is dat het longweefsel wordt ongestoorde waardoor secundaire procedures zoals paraffine inbedding of zoals hier gepresenteerd, QRT-PCR-analyse. Omdat QRT-PCR theoretically een gevoeligere maat voor detectie bruto evaluatie niet gering aantal tumorcellen in de long zichtbaar. Hoewel nuttig, kan de beeldvormende technieken hierboven beschreven gesubstitueerd of aangevuld met QRT-PCR methode die momenteel beschreven. QRT-PCR heeft het potentieel om een ​​gevoelige maatstaf van tumor afgeleide mRNA binnen een long.

Protocol

Het protocol volgt de richtlijnen en verzorging van dieren normen van de Medische Universiteit van Zuid-Carolina (MUSC) en de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC).

1. Lung Dissection

1. Borsttumor dissectie (optioneel afhankelijk van de studie doelen en of de primaire tumor analyse of staartader injectie werd uitgevoerd).
   1. Euthanaseren muis met behulp van een dodelijke dosis van isofluraananesthesie volgens IACUC en universitaire regelgeving. Bevestig euthanization door chirurgische dislocatie.
   2. Op schuim aan boord, pin met dissectie pinnen door het plaatsen van de muis op zijn rug met de ledematen gespreid.
   3. Spray muis met 70% ethanol.
   4. Met behulp van een tang, pakt het onderste gedeelte van het dier in het centrum.
   5. Met behulp van schaar, sneed omhoog in de richting van de hals door de huid, zorg dat u de buikholte van de muis niet te doorboren.
   6. Bezuinigen huid op de ledematen om tumorweefsel te onthullen.
   7. Ontleden tumorweefsel en preserve door voorkeursmethode, zoals bevriezing en fixatie, voor verdere analyse (niet verder in dit protocol besproken).
2. Longweefsel dissectie.
   1. Als tumorweefsel werd geoogst zoals hierboven beschreven, vastpinnen overtollige huid.
   2. Met behulp van een tang, grijpen peritoneum aan ondereinde van het dier gaan knippen opwaarts naar de basis van de hals.
   3. Knip voorzichtig langs de linker en rechterkant van de ribbenkast en voorzichtig om te voorkomen dat eventuele bloedvaten die kan bloeden in de borstholte verbreken. Verwijder de ribben door het snijden naar links en rechts door het membraan en bovenste gedeelten van de ribbenkast.
   4. Met behulp van een tang grijpen van de luchtpijp van de muis en trek naar voren.
   5. Sever de luchtpijp met dissectie schaar en verwijder de longen van de muis.
      Let op: kan het hart verbonden aan de longen blijven. Als dit gebeurt, zorgvuldig ontleden hart weg van de longen voorzichtig om alle vijf lobben te verzamelen (zie figuur 1 ).
   6. Was voorzichtig met PBS om overtollig bloed te verwijderen.
3. Bruto evaluatie van longweefsel.
   1. Optie 1: In vivo beeldvorming.
      1. Voor luciferase imaging, ~ 10 min voor beeldvorming, geven de dieren een 150 mg / kg dosis van luciferine door intraperitoneale (ip) injectie. Afbeelding longen in vivo verdoofde dieren of bij verwijdering na sectie (figuur 2) ^5.
   2. Optie 2: Bruto evaluatie.
      1. Onderzoek longen onder stereo microscoop om tumoren te visualiseren. Opmerking: Als cellen GFP label, kan een fluorescentie staat stereomicroscoop met een lichte kubus met de juiste excitatie / emissie maxima (bijvoorbeeld in de buurt van 470/510 nm) om GFP te detecteren worden gebruikt om de longen stereoscopisch onderzoeken voor fluorescentie voorafgaand aan de verwerking.
   3. Als longen zijn om onmiddellijk te worden geanalyseerd, gaat u naar sectie 'RNA Isolation'. Anders snap bevriezen weefsel met behulp van vloeibare zeeid stikstof of droogijs. Bewaren bij -80 ° C.

2. RNA Isolation

Opmerking: Voor de representatieve analyse werd RNA geïsoleerd met behulp van een RNA-isolatie kit (zie Materials List). Terwijl de huidige analyse gebruikt product een bepaalde fabrikant, diverse isolatie kits zijn verkrijgbaar bij verschillende leveranciers betrouwbare. Bovendien, non-kit gebaseerde centrifugeren methoden zijn ook mogelijk. cDNA tevens bereid vanuit een positieve controle RNA-monster, bijvoorbeeld een cellijn of plasmide voor standaard curve analyse. Als alternatief kan een positieve controle specifiek voor de primer probe set worden aangeschaft (zie Materials List).

1. Bij gebruik van eerder ingevroren weefsel, verzamelen bevroren weefsel op droog ijs.
2. Homogeniseren weefsel met behulp van een van de volgende methoden zoals: mortier en stamper slijpen uitgevoerd door de hand over droog ijs na het bevriezen van weefsel in vloeibare stikstof; weefselhomogenisator of mechanische dissociatie apparaatper suggestie fabrikant; sonicatie of andere voorkeurswerkwijze.
   Opmerking: Voor de vertegenwoordiger van de analyse, de voorkeur van homogenisering is sonicatie.
   1. Voor de in figuur 3 analyse bereiden lysis buffer (verschaft in RNA isolatie kit) en 2-mercaptoethanol in een verhouding van 20 pl 2-mercaptoethanol voor elke 1 ml lysisbuffer. Resuspendeer weefsel in 300 pi lysisbuffer aangevuld met 2-mercaptoethanol per 30 g weefsel en ultrasone trillingen gedurende 10 sec met sonicator vastgesteld op 30% amplitude.
   2. Bij gebruik van mortier en stamper, resuspendeer grond weefsel in 300 pi lysisbuffer na het slijpen.
3. Voeg 10 ul proteinase K tot 590 gl TE-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA). Voeg 600 ul proteinase K oplossing voor elke 300 gl (dat wil zeggen voor elk 30 mg) weefsel. Incubeer gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
   Opmerking: De spijsvertering kan variëren.
4. Centrifugeer monsters bij ≥13000 g gedurende 10 minuten om vuil te verwijderen.
5. Breng supernatant nieuwe buizen.
6. Voeg 450 pl ethanol (96% -100%) per 900 pl supernatant precipiteren RNA.
7. Breng 700 pi van het lysaat / ethanol mengsel aan de kolom.
8. Centrifugeer monsters bij ≥13,000 g gedurende 1 min om RNA te binden aan de kolom.
9. Gooi vloeibaar afval en voeg de resterende supernatant naar kolom en spin weer.
10. Zodra alle lysaat wordt gesponnen door de kolom, voeg 350 ul wasbuffer 1 naar het bovenste gedeelte van de kolom en centrifugeer monsters bij ≥13,000 g gedurende 30 sec.
11. Gooi vloeistof uit kolom en vervang bovenste gedeelte.
12. Bereid DNase door 5 eenheden DNase I enzym met 5 ui 10X DNase en 40 gl DNase / RNase vrij water per monster (totaal volume van 50 ul / monster).
13. Voeg 50 ul DNase mengen om elke kolom en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
14. Voeg 350 ui wasbuffer 1 kolom en centrifugeer samselen bij ≥13,000 g gedurende 30 sec.
15. Gooi vloeistof uit kolom en vervang bovenste gedeelte.
16. Voeg 600 ui wasbuffer 2 aan de kolom en spin 30 sec bij ≥13,000 g.
17. Gooi vloeistof uit kolom en vervang bovenste gedeelte.
18. Voeg 250 ui wasbuffer 2 en centrifugeer gedurende 2 min bij ≥13,000 g.
19. Zet een deel van de kolommen in de nieuwe collectie buis en oude collectie buis weggooien.
20. Voeg 50-100 ul van RNase / DNase-vrij water kolom en incubeer gedurende 1 min.
21. Spin gedurende 1 min bij ≥13,000 g.
22. Re-run verzameld eluaat door de kolom om RNA opbrengst te verhogen.
23. Voor onmiddellijk gebruik, houden monsters op ijs en overgaan tot kwantificering. Voor later gebruik, snap bevriezen van droogijs of vloeibare stikstof. Bewaren bij -80 ° C vriezer totdat het nodig is.

3. First Strand Synthesis

Opmerking: de representatieve analyse het reverse transcriptase (RT) reactie uitgevoerd een First Strand cDNA synthese kit ontworpen voor QRT-PCR (zie Materials List).

1. Als monsters die eerder werden verzameld, ontdooien buizen op ijs.
2. Meet RNA hoeveelheid met behulp van een spectrofotometer.
3. Met behulp van 0,5-2 ug totaal RNA, voeren de eerste streng synthese met behulp van reverse transcriptase om cDNA voorraad genereren.
   1. In steriele, RNase / DNase-vrij PCR tubes / platen bereiden het reactiemengsel (tabel 1). Meng voorzichtig en centrifuge. Programmeer een standaard PCR machine (tabel 2).
4. Verdunnen afgewerkte reactie gewenste volume (meestal 50-100 pi) met steriele nuclease-vrij water.

4. Real-time PCR

Opmerking: Voor de representatieve analyse werd SYBR groen gebruikt. Echter kan elke voorkeurswerkwijze worden vervangen naar keuze van de gebruiker.

1. Met behulp van een positieve controle cDNA, het opzetten van een standaard curve voor elke primer set.
   1. Voor de analyse getoond in figuur 3, de voorbereiding van de standaard curve voor menselijke HER2 met de fabrikant aanbevolen positieve controle cDNA (zie Materials List). Voor muis GAPDH, met de negatieve controle long cDNA van een standaardcurve. Voor elke probe, serieel verdunnen cDNA 1: 4-5 normen genereren.
2. Bereken het totale aantal monsters dat moet de standaardkromme en experimentele monsters.
   Opmerking: Voor de hier beschreven analyse, werden 2-3 experimentele herhalingen per monster geanalyseerd. Standaard curve analyse werd uitgevoerd om een eenvoudige lineaire regressiemodel dat kan worden toegepast om te bepalen de relatieve hoeveelheid HER2 en GAPDH per monster genormaliseerd uiteindelijke hoeveelheid berekenen genereren. Deze analyse zal er ook voor zorgen dat de primer efficiëntie is voldoende voor de analyse bij de hand.
3. In een steriele, RNase / DNase-vrij buis bereiden master mix (Tabel 3).
   1. Bereken master mix amount per monster. Opschalen voor meer dan één monster. Gebruik een master mix voor elke experimentele gen van belang, evenals een interne controle zoals GAPDH. Gebruik voor GAPDH primers in een uiteindelijke concentratie van 200 nM.
      Opmerking: De interne controle is vooral handig wanneer het proberen om onderscheid te maken tussen mens en muis cel oorsprong.
      Opmerking: Primer concentratie HER2 werd bepaald en geoptimaliseerd door de fabrikant.
4. Bereid testplaat met 1 pl cDNAs overeenkomt met elke standaard of experimentele monster. Goed toe te wijzen ten minste 1 cDNA monster / voor elke primer sonde. Voeg 19 ul van de master mix per putje voor elke primer sonde.
   Opmerking: de representatieve gegevens in Figuur 3 werden de cDNA monsters in duplo geanalyseerd voor elke primer probe en geplot als gemiddelde van de twee monsters.
5. Run reactie in QRT-PCR machine met aanbevolen of eerder geteste PCR-protocol. Zie tabel 4 aan de PCR protocol voor de representatieve gegevens in Figuur 3 en figuur 4.

Resultaten

Voorbij de tijd die nodig is om de initiële inoculatie van tumorcellen te voeren in het proefdier en zo uitvoeren, de primaire tumor in vivo analyse van het weefsel oogst, RNA-isolatie en QRT-PCR analyse een 1-2 dagen procedure (figuur 1) .

Een voorbeeld van grove analyse bioluminescentie beeldvorming tumorcellen te evalueren in het longweefsel. Hier werd een borstklier tumorgenese experiment uitgevoe...

Discussie

Dit protocol beschrijft het gebruik van QRT-PCR om mammaire tumorcelmetastase evalueren aan de longen met een xenograft muismodel. Er wordt erkend dat andere technieken, zoals bioluminescentie beeldvorming, zijn beschikbaar en zijn ook effectief voor het detecteren van metastasen ondanks hun eigen waarden en beperkingen. De gepresenteerde gegevens suggereren dat QRT-PCR een effectieve maatregel detecteren tumor afgeleide mRNA in longweefsel voor kwantificering van totaal metastase. Voorgesteld wordt QRT-PCR analyse een ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2-mercaptoethanol	Fisher	BP176-100
DNAse	Thermo Scientific	EN0521
GeneJet RNA Isolation Kit	Thermo Scientific	K0732
iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR	Bio-Rad	1708841
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121
PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human	Bio-Rad	100-25636
PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human	Bio-Rad	100-25716
gapdh Primer Sequence			For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG