Lasergestuurde Neuronal Tracing In Brain Explantaten

Summary

We beschrijven een techniek voor neuronen en hun processen label via anterograde of retrograde tracer injecties in de hersenen kernen met een in vitro bereiding. We pasten een bestaande methode i n vitro tracer elektroporatie door gebruik te maken van fluorescent gelabelde muis mutanten en eenvoudige optische apparatuur om de nauwkeurigheid etikettering te verhogen.

Abstract

Wij presenteren een techniek die in vitro tracer injectieprotocol, die gebruik maakt van een reeks elektrische pulsen en druk kleurstof opname in hersenen explantaten met gerichte laserbelichting en bijpassende filter goggles verhogen door elektroporatie tijdens de procedure combineert. De beschreven techniek van in vitro elektroporatie zelf levert relatief goede visuele controle voor het richten bepaalde hersengebieden. Door combinatie met laser excitatie van fluorescerende genetische merkers en hun uitlezing doorgaande band passeren filter bril, die halen de emissies van het genetisch gelabelde cellen / kernen en fluorescerende traceren kleurstof, een onderzoeker in hoofdzaak nauwkeurigheid van injecties vergroten door het vinden van het gebied van de rente en het beheersen van de kleurstof-spread / opname in de injectieplaats veel efficiënter. Bovendien, de laserverlichting techniek kan de functionaliteit van een bepaald neurocircuit van prov bestuderenIDing informatie over het type van neuronen projecteren op een bepaald gebied wanneer het GFP-expressie is gekoppeld aan het type zender door een subpopulatie van neuronen tot expressie.

Introduction

Om een ​​bepaalde neuronale (micro) circuit definiëren, moet men beginnen door het vinden van de verschillende deelnemers van de schakeling, en de verbinding patroon. Sinds de publicatie Waller over neurofiber traceren door middel van laesie ¹ een grote verscheidenheid van neuroanatomische tracing technieken is vastgesteld. Sommige van deze technieken kunnen in vaste weefsel post mortem ^2-4 worden toegepast, andere vertrouwen op het actieve transport van de kleurstof in levende neuronen, zoals ontdekt in 1971 ^6/5. De laatste kunnen worden onderverdeeld in twee groepen discrimineren tussen verschillende maken van actieve retrograde (va....

Protocol

1. Optische Genotyping

1. Optische Genotypering van Muis Pups

1. Controleer expressie van de respectieve fluorescerende merker met een laser pointer van het juiste excitatie golflengte (405 nm in de hier beschreven experimenten) en bijbehorende filter bril blokkeren excitatiegolflengte maar langs de emissiegolflengte (450 - 700 nm in de hier beschreven experimenten) . Richt de laser pointer aan de achterkant van het hoofd of het ruggenmerg van de muis pup (zie figuur 1). Vermijd schijnt de laser in de ogen en langdurige blootstelling van de huid aan laserlicht.

2. optische Genotypering....

Results

Figuren 1 en 2 tonen hoe de laser pointer en laser bril kan worden gebruikt om snel en goedkoop genotype GFP positieve dieren uit een nest. In het geval van de jonge muis pups, kan de techniek worden gebruikt om GFP label noninvasively identificeren in de hersenen van het dier door de schedel en de bovenliggende huid (Figuur 1A - D). Uitgezonden fluorescentie kan ten minste tot postnatale dag 3 (Figuur 1C) worden gezien door de huid en de schedel van de muis pups. De pr.......

Discussion

Een algemene kracht van in vitro elektroporatie tracer, in tegenstelling tot in vivo opsporen studies, is dat het onderzoekers betere toegang tot de hersenen interessegebied en dus niet duur stereotactische (vaak elektrofysiologische) materiaal omvatten. Bovendien is de overlevingsperiode nodig voor de hersenen explantaten omvat slechts een paar uur (1 - 4) in plaats van dagen of zelfs weken bij in vivo tracer injecties (zie een gedetailleerd overzicht van het gebruik van dextran aminen en and.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise.
Potassium chloride		P9333
Potassium phosphate monobasic		P5655
Sodium phosphate di-basic		S907
Magnesium chloride		M2670
Calcium chloride		C5080
Glucose		G7528
Sodium bicarbonate		S6297
Ascorbic acid		A4544
Myo-inositol		I5125
Sodium pyruvate		P2256
Bovine serum albumine		A2153	optional, for additional (immuno)histochemistry
Triton-X-100		X100	optional, for additional (immuno)histochemistry
Poly(ethylene glycol), 8000 MW		P2139	optional, for brain clearing
Formamide	Fisher Scientific	F84	optional, for brain clearing
Choleratoxin subunit-b	Molecular Probes	C-34776 (Alexa 555)
Dextrane tetramethyl-rhodamine	Molecular Probes	D-7162 (Alexa 555)
Fluorescent Nissl	Invitrogen	N-21479 (blue)	optional
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	SF93
Agarose	Invitrogen	16520
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Pentobarbi-tal	Vortech Pharmaceuticals	Fatal-Plus
Borosilicate glass filaments	Harvard Apparatus	G150F-10
Pipette puller	Zeitz Instruments, Germany	DMZ Universal Puller
Perfusion setup	Custom-made
Laser pointer	laserpointerpro.com, Hong Kong	HK-88007294 (405 nm)
Filter/safety goggles	Dragon Lasers, China	LSG09 (band-pass 450-700 nm)
Bionocular microscope	Wild Heerbrugg, Switzerland	Wild M3	Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.)
Picospritzer	Parker Instruments	Picospritzer III
PC with installed MC Stimulus software	Multi Channel Sys-tems, Germany (software)
2-channel stimulator	Multi Channel Sys-tems, Germany	STG-1002
Stimulation isolation unit	A.M.P.I., Israel	Iso-Flex
Micromanipulator	Narishige, Japan	YOU-1
Vibratome	Leica, Germany	VT1000S