Met behulp van Single sensillum Opnemen op Olfactorische Neuron Reacties van bedwantsen te semiochemicaliën Detect

Samenvatting

Bedwantsen vertrouwen op olfactorische receptorneuronen die zich in hun antenne olfactorische sensilla bevinden om semiochemicaliën in de omgeving te detecteren. Met behulp van een enkele sensillum-opname demonstreren we een methode om de reactie van bedwantsen op semiochemicaliën te evalueren en het coderingsproces dat hierbij betrokken is, te onderzoeken.

Samenvatting

Het insect olfactorische systeem speelt een belangrijke rol bij het opsporen van feromonen in het milieu. Met name de antennaal sensilla die een of meerdere neuronen in het huis, worden beschouwd als de belangrijkste bijdrage in te spelen op de chemische stimuli te maken. Door direct opnemen actiepotentiaal in de olfactorische sensillum na blootstelling aan stimuli, enkele sensillum opname (SSR) techniek biedt een krachtige aanpak voor het onderzoeken van de neurale reacties van insecten chemische stimuli. Voor het bed bug, een notoire menselijke parasiet zijn meerdere soorten olfactorische sensillum gekarakteriseerd. In deze studie hebben we aangetoond neurale respons van bedinsect olfactorische sensilla twee chemische stimuli en de dosis-afhankelijke respons een van hen met de SSR methode. Deze aanpak maakt het mogelijk onderzoekers vroegtijdige screening uit te voeren voor afzonderlijke chemische stimuli op het bed bug olfactorische sensilla, die waardevolle informatie zou verschaffen voor de ontkeling van nieuwe bed bug lokstoffen of insectenwerende middelen en de voordelen van de bed bug controle-inspanningen.

Inleiding

De gemeenschappelijke bed bug Cimex lectularius L (Hemiptera: Cimicidae), als tijdelijke ectoparasiet, is een verplicht bloedzuigende insecten, wat betekent dat hun overleving, ontwikkeling en voortplanting vereisen bloed bronnen van gastheren, met inbegrip van zowel mensen als dieren ^1,2. Hoewel virusoverdracht is zelden gemeld als gevolg van C. lectularius, de bijtende overlast gegenereerd door een besmetting ernstig beïnvloedt gastheren zowel fysiek als psychisch ^3. De invoering en wijdverbreide gebruik van chemische insecticiden, met name DDT, verminderde het risico van aantasting en tegen het einde van de jaren 1950 besmettingen waren zo laag dat ze niet langer een ernstige bezorgdheid. Echter, een aantal mogelijke factoren hebben tot opleving in bed bug populaties wereld, zoals het verminderde gebruik van insecticiden, een afname van het publiek, verhoogde reizen activiteit en de ontwikkeling van resistentie tegen insecticiden ^4-9.

Chemische signalen in het milieu worden gedetecteerd en door insecten opgenomen via olfactorische organen zoals antennes en maxillaire palpen. De olfactorische sensilla op het insect antennes spelen een cruciale rol bij het opsporen van deze chemische signalen. De chemische moleculen voer de antennaal cuticula door de poriën aan de cuticula oppervlak. Geurstof bindende eiwitten in het antennaal lymfe binden aan deze chemische moleculen en transporteren naar de geurstof receptoren ^10. De geurstof receptoren en hun co-receptor van de niet-selectieve kation ionkanaal de neurale membraan dat zodra deze chemische moleculen worden gedepolariseerd worden herkend door de geurstof receptoren ^11.

Single sensillum opname (SSR) ontwikkeld om de extracellulaire verandering in de actiepotentiaal die uit de toepassing van hetzij chemische of niet-chemische stimuli detecteren. Door het inbrengen van een registratie-elektrode in de sensillum lymfe en een referentie-elektrodein een ander deel van het insect lichaam (gewoonlijk of de verbinding ogen of de buik), kan het vuren van de neuronen in reactie op stimuli worden geregistreerd ^12. Veranderingen in het aantal pieken vertegenwoordigen de gevoeligheid van het insect op specifieke stimuli. Chemische stimuli van verschillende identiteiten en concentraties zullen uitlokken verschillende neurale respons, met verschillende bakken prijzen en temporale structuren, en kan dus worden gebruikt om het coderingsproces van het insect specifieke chemische onderzoeken.

Voor de gemeenschappelijke bed bug, zowel seksuele vormen delen hetzelfde patroon van olfactorische sensilla op de antennes: negen gegroefde peg C sensilla, 29 haar-achtige E (E1 en E2) sensilla, en één paar van elk van Dα, Dβ, Dγ vlotte pen sensilla ^13,14. Zoals meerdere neuronen geïdentificeerd in elk type sensillen, is het niet eenvoudig om de actiepotentialen van verschillende neuronen zich in hetzelfde sensillen onderscheiden, zodat voor dit experiment de total aantallen actiepotentialen werden geteld off-line voor een msec periode voor en na stimulatie 500. Het aantal actiepotentialen na stimulatie werd vervolgens afgetrokken van het aantal actiepotentialen voor stimulatie en vermenigvuldigd met twee om de veranderingen in de vuursnelheid in elk afzonderlijk sensillum kwantificeren pieken per seconde ^15.

Protocol

1. Voorbereiding van de instrumenten, Prikkels Solutions, en Bed Bugs

1. Bereid een 50% KNO _2-oplossing (w / v) in een 20 ml flesje.
2. Scherpen twee wolfraam micro-elektroden in KNO ₂ oplossing bij 5 V door herhaaldelijk dompelen de wolfraamelektroden in en uit van de oplossing.
   1. Ruwweg verscherpen de wolfraamdraad door dompelen ongeveer 10 mm van de wolfraamdraad in en uit de KNO _2-oplossing met de snelheid van 2 dips / sec gedurende ongeveer 5 minuten, die sterk kunnen consumeren het vooreinde van de wolfraamdraad.
   2. Fijn verscherpen de elektrode door dompelen ongeveer 1 mm van de draadpunt in en uit de oplossing met de snelheid van 2 dips / sec gedurende ten minste 1 min teneinde een fijne en scherpe punt van de elektrode te maken. Controleer de elektrode tip diameter onder de microscoop vaak tot het 0,2-0,5 urn, die fijn genoeg om de cuticula van bed bug olfactorische sensillum doorboren moeten zijn bereikt.
      Opmerking: Tijdens handmatig scherpening de elektrode, het onderdompelen snelheid van de wolfraam draad in de ₂ KNO oplossing niet constant hele tijd. Met meer praktijk is het veel gemakkelijker om een ​​relatief constante snelheid slijpen de elektrode houden. De verscherping tijd is ook onzeker, afhankelijk van hoe goed de elektrode moet worden. Hier, een elektrode met een diameter van ~ 0,2 micrometer voldoende is om te prikken door het olfactorische sensillum.
3. Verdun elk van de chemische stimuli in dimethylsulfoxide (DMSO) van de nette verbinding een beginconcentratie van 01:10 v / v als een voorraadoplossing. Een reeks verdunningen decadic afhankelijk van het aantal vereiste doses in het experiment, opnieuw met DMSO, van elk van de voorraadoplossingen van elke chemische stof. Hier, Gebruik 10% (+) - β-pineen en eucalyptol.
4. Plaats de unfed of zeven dagen na het voeden volwassen bedwantsen (mannelijk of vrouwelijk) van de Ft. Dix kolonie (een gift van Dr. Haynes in University of Kentucky) voor gebruik in thij experimenteren in een petrischaal.
   Let op: Er is geen exacte aantal voor bedwantsen geplaatst in de petrischaal. Het kan enkele of veel zijn.

2. Bed Bug Antennes Voorbereiding

1. Verdoven het bed bugs op ijs (2-3 min).
2. Fix zowel de antennes en insecten lichaam op een microscoop dekglaasje met dubbelzijdige tape en verwijder de benen met fijne schaar.
3. Gebruik een kleine pin om zachtjes aanraken van de antennes zodat ze plakken op de band gestaag.
4. Laat de dekglaasje tegen een kleine bal (~ 1 cm diameter) van tandheelkundige wax manipulatie vergemakkelijken en aanpassen aan een geschikte hoek (~ 90 °) van de registratie-elektrode (figuur 1).
5. Eenmaal bevestigd, plaatst het bed bug onder een stereo-microscoop, zet de koude lichtbron en de intensiteit van de verlichting tot de antenne duidelijk wordt gepresenteerd, en de focus van de microscoop op de tweede flagellum van de bed bug antenne bij een hoge vergrotingsfactor (720x) .
   AantekeningDe intensiteit van de verlichting in het experiment gebruikte niet gekwantificeerd, wat eigenlijk afhankelijk van de ogen van de experimentator voelt de intensiteit van de verlichting.

3. Single sensillum Recording

1. Sluit de voorversterker (10X) met de signaalregistratie controller, die is verbonden met de computer voor signaalopname en visualisatie. Zet de computer en start de software, bijvoorbeeld AutoSpike32 en klik op de "Record" mode in de menubalk. Kies dan de "wave" om zo te beginnen met het opnemen van de wave signalen.
   Opmerking: een vlakke lijn loopt van links naar rechts van de monitor herhaaldelijk moet nu zichtbaar zijn. Hier, het opnamevenster duurt 40 sec. Max wave opname is 10 sec. Geselecteerde sampling rate is 96000 en de digitale sampling rate is 240. Er is 0% te compenseren en er geen filtering, geen correctie voor het opnemen van signalen. Al deze parameterinstellingen in de software kan worden aangepast indien nodig.
2. Schakel de luidspreker en voorversterker, die wordt gebruikt om de toning stand presenteren de neuronale reacties van antennal sensillum.
3. Plaats de referentie-elektrode in het abdomen van de gestabiliseerde bed bug.
   Opmerking: De referentie-elektrode werd gehouden door een metalen staan ​​magnetisch bevestigd aan de lucht-tafel.
4. Nadat de referentie-elektrode is verbonden met het bed bug buik Verplaats de registratie-elektrode, die is verbonden met de voorversterker en gemanipuleerd door een micromanipulator, naar het achterste uiteinde van het bed bug antenne.
5. Wanneer de registratie-elektrode in contact is met het juiste uiteinde van de antenne schakelen van de microscoop en lokaliseren van de elektrode bij een lage vergroting.
6. Stel de registratie-elektrode en stijgt de vergroting tot zowel de elektrode en het antennaal sensillum in hetzelfde vlak en duidelijk zichtbaar onder de microscoop.
   Opmerking: deze keer, de microscoop gebruikelijkly op het hoogste vergroting.
7. Plaats de registratie-elektrode in de schacht van de sensillum met de micromanipulator en gaat iets dieper wanneer de achtergrondruis is hoog vergeleken met de actiepotentiaal.
8. Zodra duidelijk actiepotentialen worden waargenomen uit de opgenomen sensillum, vul een micropipet met 10% (+) - β-pineen. Gebruik de micropipet om 10 pi hoeveelheid van 10% (+) te storten - β-pineen op een filter papierstrook (~ 3 x 15 mm) geplaatst in een glas Pasteur pipet.
   1. Sluit het geladen pipet naar de uitlaat van de puls stromingsbuis van de stimulus controller en plaats de punt van de pipet in het gaatje in de buis gericht naar de antenne.
9. Wanneer al deze verbindingen zijn gestabiliseerd, drukt u de voetschakelaar van de stimulus-controller om een ​​0,5 sec trekje van de stimulus (0,5 l / min) geven in de continue bevochtigde luchtstroom. Het opnemen van actiepotentialen zal gelijktijdig worden gestart wanneer de footswitch is depressief. De opname proces zal de laatste zijn voor 10 sec met ingang van 1 sec voor de stimulatie.
10. Tel de actiepotentialen off-line voor twee 500 msec periodes, één voor en één na de stimulatie. Aftrekken elke verandering in de piek tarief tijdens de 500 msec na de stimulatie van de spontane activiteit opgenomen in de voorafgaande 500 msec en zetten de graven in de gebruikelijke omvang van spikes / s door ze te vermenigvuldigen met 2.

4. Stimulus Vervanging in de SSR

1. Zodra de voetschakelaar is geactiveerd, levert de 10% (+) - β-pineen in de pipet op het bed bug antennes en registreer het antwoord op deze specifieke geurstof gedurende 10 seconden, waarna de pipet verwijderd.
2. Label een nieuwe pipet met de 0,001% eucalyptol worden getest. Leg een klein stukje filtreerpapier waarop 10 ul van de stimulus is toegepast, in de nieuwe pipet.
3. Wacht 2-5 min totdat de stimulus geheel Vaporized in de glazen pipet. Bevestig de pipet op de uitlaat van de puls stromingsbuis.
4. Plaats de pipet in de kleine opening van de buis gericht op de antenne. Druk de voetschakelaar in en start de 10 sec opname.
5. Koppel de pipet en bereiden een pipet met 0,01% eucalyptol.
6. Test alle overige doses eucalyptol (0,001% tot 10%) van de antennaal sensilla de dosis-afhankelijke respons te observeren. Test van de meest verdunnen tot de minst verdunnen doses.

Resultaten

Single sensillum opname is een krachtige onderzoekstechniek gebruikt in studies van insecten chemische ecologie en neurale fysiologie. Onderzoek naar de neurale reacties van insecten op verschillende vluchtige verbindingen, vooral die dacht te ecologisch gerelateerd aan de overleving en ontwikkeling van de insecten, geeft ons niet alleen waardevolle inzichten in het insect reukzin proces, maar opent ook veelbelovende nieuwe wegen die kan leiden de ontwikkeling van bruikbare nieuwe reagen...

Discussie

De interne sensillum opnametechniek is uitgebreid gebruikt bij het testen van de neurale respons van insecten zoals fruitvliegen, muggen en bed bugs verschillende chemische stimuli in de omgeving. Deze chemische stimuli worden vaak opgelost en verdund in een gewoon oplosmiddel om verschillende doseringen van de behandelingen te bereiden. Echter, verschillende oplosmiddelen heel verschillende afgiftesnelheden van de stimuli produceren. Eerdere studies op sommige uitgebreid bestudeerd insecten zoals Drosophila melanog...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Tungstendraad	A-M SYSTEMS	#716500	Gebruikt voor het voorbereiden van de elektrode
KNO2	Sigma	#310484	Gebruikt voor het slijpen van de wolfraamdraad
AC-voeding	BK Precision	1653A	Zorgt voor de spanning bij het slijpen van de wolfraamdraad
Leica Z6 APO Microscoop	Leica	10447424	Gebruikt voor het observeren van de sensilla op antennes
Simulus-controller	Syntech	CS-55	Gebruikt voor het regelen van de stimulustoediening
4-kanaals USB-acquisitiecontroller	Syntech	IDAC-4	Real-time weergave op het scherm van alle signalen voor en tijdens de opname
Lichtbron	SCHOTT	A20500	Zorgt voor lichtbronnen voor observatie
Micromanipulator	Leica	115378	Gebruikt voor kleine bewegingen van de elektrode
Luidspreker	Juster	95a	Verbonden met acquisitiecontroller IDAC-4 en zorgt voor geluid voor het signaal
Magneetstandaard	Narishige	GJ-1	Gebruikt om de referentie-elektrode, gestabiliseerd bedwants en stimulusafgifteslang vast te houden
TMC Trillingsisolatietafel	TMC	63-500	Gebruikt om de trillingen van de apparatuur te isoleren
Dekglas	Tedpella	2225-1	Gebruikt om de bedwants vast te houden
Dubbelzijdig plakband	3M	XT6110	Gebruikt om de bedwants op het dekglas te stabiliseren
Tandartswas	Dentakit	DK-R012	Gebruikt voor het ondersteunen van het dekglas waar de bedwants is gestabiliseerd