Enten van kralen in de ontwikkeling van kippenembryo Ledematen kunnen identificeren signaaltransductieroutes invloed Gene Expression

Samenvatting

Door kralen gedrenkt in groeifactoren of specifieke remmers van signaalroutes in zich ontwikkelende embryo's te enten, is het mogelijk om hun effecten direct in vivo te testen. In dit protocol worden kralen in de ledemaatknop geënt om de effecten van deze moleculen op genexpressie en signaaltransductie te bepalen.

Samenvatting

Met behulp van kippenembryo's is het mogelijk om direct de effecten van beide groeifactoren of specifieke remmers van signaaltransductiewegen op genexpressie en activering van signaaltransductieroutes testen. Deze techniek maakt de afgifte van signaalmoleculen op exact gedefinieerde ontwikkelingsstadia specifieke tijden. Na deze embryo's kunnen worden geoogst en genexpressie onderzocht, bijvoorbeeld door in situ hybridisatie, of activering van signaaltransductieroutes waargenomen met immunokleuring.

In deze video heparine kralen gedrenkt in FGF18 of AG 1-X2 kralen gedrenkt in U0126, een MEK-inhibitor, worden geënt in de ledematen kiem in ovo. Hieruit blijkt dat FGF18 induceert expressie van MyoD en ERK fosforylatie en zowel endogene als FGF18 MyoD geïnduceerde expressie wordt geremd door U0126. Kralen gedrenkt in een retinoïnezuur antagonist kan voortijdige MyoD inductie versterken door FGF18.

Deze aanpak kan onsed met een groot aantal verschillende groeifactoren en remmers en wordt gemakkelijk aangepast aan andere weefsels in het ontwikkelende embryo.

Inleiding

Aviaire embryo's een krachtig hulpmiddel voor de studie van ontwikkeling bedoeld jaren ^1. Een van hun meest nuttige eigenschappen is dat ze relatief gemakkelijk te manipuleren. Externe ontwikkeling maakt het mogelijk om het ei te openen om het embryo en uitvoeren van verschillende micromanipulations met voorbeelden zoals de klassieke kwartel-chick chimera voor het bestuderen lot van de cel ^2,3, de injectie van retrovirussen voor overexpressie in specifieke weefsels tijdens de ontwikkeling ^4,5 en explantatie cultuur ontwikkelingsstoornissen signalering bronnen ⁶ identificeren. Meer recent hersenschimmen gegenereerd tussen ongelabelde gastheren met enten van een transgene kippen lijn die GFP heeft aangetoond dat de combinatie van klassieke enten en genetische modificatie belangrijke inzichten kunnen geven in de ontwikkeling van ^7,8.

Het gemak waarmee het aviaire embryo kan worden gemanipuleerd heeft gemaakt een uitstekend model voor de studie ledematenontwikkeling ^9. Toepassing van specifieke groeifactoren aan de ontwikkeling van ledematen in vivo is behulpzaam geweest bij het ​​identificeren van factoren die ledematen patronen ^10,11 veranderen en blijft om inzicht te geven in dit proces ¹² geweest. Deze aanpak is ook gebruikt om de factoren die spierontwikkeling regelen bestuderen en heeft rollen voor diverse signalen zoals Wnts ^13, BMP's ¹⁴ en ¹⁵ HGF blootgelegd.

Recent werd deze techniek gebruikt om de signalen te besturen myogene genexpressie in de ledemaatknop onderzoeken en blijkt dat de interacties tussen FGF18 en retinoïnezuur het tijdstip van MyoD expressie ¹⁶ kan besturen. Met een combinatie van groeifactoren en kleine moleculen die op kralen kunnen worden geladen en vervolgens direct geënt in specifieke weefsels in ontwikkelingsstadia gedefinieerde geeft de mogelijkheid om op bijna elk moment en omgeving ingrijpen tijdens de ontwikkeling. Deze is gebruikt om INVEstigate veel processen waaronder somiet patroonvorming ^17,18, neurale specificatie ^19, neurale lijst migratie ^{20 en} as uitbreiding ^21.

Hier beschrijven we een werkwijze voor het enten korrels geweekt in beide groeifactoren of inhibitors in ontwikkelende kippenembryo ledematen. Deze is gebruikt om het effect van deze signalen op myogenesis bepalen door het analyseren spieren genexpressie met in situ hybridisatie. We beschrijven implantaten met behulp van heparine geweekte korrels, die worden gebruikt voor groeifactoren of AG 1-X2 parels voor kleine hydrofobe moleculen zoals retinoïnezuur of kleine molecule inhibitoren van specifieke signaleringsroutes. Maar andere kralen zijn ook beschikbaar, die zijn gebruikt om zowel FGF's ²² en ²³ Shh leveren.

Protocol

Ethiek Verklaring: Al deze experimenten volgen het dier zorg en ethische richtlijnen van de Universiteit van Nottingham.

1. Voorbereiding van de Heparine Kralen voor Enten

1. Was heparine korrels grondig in PBS vóór gebruik. Opmerking: Parels kunnen bij 4 ° C worden bewaard als een suspensie in PBS.
   1. Selecteer kralen voor enten door het verwijderen van hen uit de voorraad met een 20 ul pipet in een 1 ml daling van PBS. Gebruik een micropipet ingesteld op 2 pl kralen over in een 20 ul druppel PBS in een petrischaal 3 cm. Kies kralen op basis van grootte en met behulp van een stereo dissectiemicroscoop, transfer geselecteerd kralen met een P2 pipet tip; die rond 100 micrometer diameter zijn ideaal.
2. Verwijder de PBS uit de korrels. Verwijder het meeste vocht met een 20 ul pipet en de residuele vloeistof door capillaire werking met fijne horlogemakers pincet. Opmerking: Het is van belang om zoveel mogelijk te verwijderen, zodat de groei factor is niet verdund wanneer het wordt toegevoegd aan de korrels.
3. Pipetteer de groeifactor direct op de korrels. Voor FGF18 voeg 0,5 ul recombinant FGF18 gereconstitueerd in 0,5 mg / ml in 0,1% BSA in PBS. Plaats enkele druppels water rond de randen van de schotel naar het verhinderen dat vloeistof verdampen.
4. Incubeer de kralen voor 1 uur bij KT. Verwijder de druppels water uit de schotel met een Pasteur pipet en plaats op ijs klaar voor transplantatie.
5. Indien nodig (voor transparante kralen) overdracht 4-5 kralen tot 2% fenol rood voor het enten te helpen visualiseren. Spoel in PBS alvorens naar het embryo.

2. Voorbereiding van AG 1-X2 Kralen voor Enten

1. Vóór derivatiseren kraaltjes met 0,2 N mierenzuur.
   1. Gebruik hiervoor een spatel kralen overdracht naar een 1,5 ml microcentrifugebuis. Voeg 1 ml 0,2 N mierenzuur en was op een schudplateau gedurende 1 uur.
   2. Verwijder vervolgens de mierenzuur met een P1000 pipet en te vervangen door 1ml water. Wassen 1 uur en herhaal zesmaal resterende mierenzuur verwijderen.
   3. Verwijder overblijvende vloeistof met een P1000 pipet en bewaar de korrels bij 4 ° C. Opmerking: Het is niet nodig om al het restwater in dit stadium te verwijderen.
2. Verwijderen van een kleine pellet van kralen van ongeveer 5-10 ul volume van de voorraad met een kleine spatel in een 3 cm petrischaal en voeg 1 ml DMSO (of een ander oplosmiddel wordt het geneesmiddel opgelost in). Opmerking: Dit moet honderden parels om die van de juiste grootte te selecteren verschaffen.
3. Gebruik een pipet P2 ingesteld op 2 pl aan kralen overdracht van ongeveer 100 urn diameter een 20 ul druppel oplosmiddel in een 3 cm petrischaal.
4. Verwijder oplosmiddel met een 20 ul pipet en eventuele achtergebleven oplosmiddel met 2 pi pipet. Vervang door 20 gl van het geneesmiddel aan te passen.
   Opmerking: Om consistent te lossen het geneesmiddel bij een concentratie van 100 uM in DMSO (of die ooit oplosmiddel wordt gebruikt),20 pl aliquot in en bewaar bij -80 ° C als een kleine molecule inhibitoren zijn onstabiel en is het best om herhaalde vries-dooien te voorkomen. Eventueel verdun het geneesmiddel voor de gewenste concentratie voor het weken kralen. Doeltreffende concentraties moeten empirisch worden bepaald voor elk geneesmiddel.
5. Incubeer gedurende 1 uur. Beschermen tegen licht als veel van deze moleculen zijn gevoelig voor licht.
6. Voor enten overdracht 05/04 kralen met een pipet p2 ingesteld op 2 pi in 20 gl 2% fenolrood opgelost in water. Voer deze stap met behulp van een stereo dissectiemicroscoop om de kralen te visualiseren. Verwijder een enkele kraal met fijne horlogemakers pincet of een draad lus en spoel in PBS alvorens naar het embryo. Niet parels in 2% fenolrood reactie langer dan 15 min vóór gebruik als dit verlies aan activiteit kan veroorzaken.

3. Voorbereiding Tungsten Naalden

1. Snijd fijne wolfraam draad in 3-4 cm lengte. Steek een stuk draad in het uiteinde vaneen glazen Pasteur pipet en smelten in een Bunsen brander te fixeren. Bereid tot 10 naalden zodat er reserveonderdelen als ze beschadigd tijdens gebruik.
2. Plaats het uiteinde van de draad in een steekvlam vlam en houd hem daar tot de wolfraam gloeit witte en de tip is scherp (ongeveer 2-3 minuten). Opmerking: Tijdens het gebruik van de naald kan worden gereinigd en opnieuw aangescherpt in de brander als dat nodig is.
   OPMERKING: Deze naalden kunnen ook gebruikt worden om lussen te maken voor overdracht kralen. Zachtjes aanraken van de naald naar de bank en het zal buigen om een ​​lus te vormen.

4. De voorbereiding van embryo's voor Bead Enten

1. Broeden eieren met de stompe eind tot ze de gewenste fase (3-5 dagen voor de meeste ledematen knop manipulaties) te bereiken. Met behulp van stompe tang tik op de stomp uiteinde aan de schaal te breken en vervolgens met de tang om de schil te verwijderen en het embryo bloot te leggen. Zorg ervoor dat de eierschaal membraan wordt ook verwijderd.
   OPMERKING: 1-2 ml PBS kan worden toegevoegd met een pasteurpipet te helpen metDit als het membraan vasthoudt aan de dooier. Voorzichtig pipet de PBS op het oppervlak van de dooier, het grijpen van de membraan met de tang, het verzorgen van de dooier niet te beschadigen, en trek het voorzichtig uit de buurt van het ei.
2. Verwijder tot 5 ml van albumine uit het ei met een spuit 10 ml en een 19 G naald. Neem slechts zoveel als nodig is om de embryo maakt contact met de cassette om het ei het verwijderen van grotere hoeveelheden afdichting embryo overleving verminderen niet te garanderen.
3. Visualiseren het embryo voeg een 5-6 druppels kunstenaars india inkt 15 ml PBS met 100 U penicilline en 0,1 mg streptomycine / ml. Injecteren 0,5-1 ml direct onder het embryo met een spuit van 1 ml en een 25 G naald.
4. Voeg 2-3 ml PBS met 1% foetaal kalfsserum en 100 U penicilline en 0,1 mg streptomycine / ml in het ei om het embryo niet uitdrogen garanderen. Met behulp van geslepen horlogemakers pincet verwijder de vitelline membraan en open de amnion over de ontwikkeling van ledematen. Zorg ervoor dat de embryo niet uitdroogt enIndien nodig, voeg meer PBS / FCS.
   Opmerking: De ledematen is duidelijk te zien als gepaarde uitwassen op de flank van het embryo. Op deze fasen wordt het embryo slag zodanig rechts gewoonlijk boven. Daardoor gewoonlijk gemakkelijker parels enten in de juiste ledematen en gebruik de linker die als contralaterale controles.
5. Gebruik een scherp wolfraamdraad om een ​​incisie te maken in de ledemaatknop wanneer de hiel wordt geïmplanteerd. Zaag niet helemaal door de ledemaatknop indien mogelijk, maar op jongere stadia dit moeilijk.
   Opmerking: In oudere embryo's (HH fase 22 en hoger) is het mogelijk specifieke gebieden van de ledemaatknop selecteren voor enting maar op jongere stadia is moeilijker omdat de ledemaatknop zelf is klein. Het is ook belangrijk om te onthouden dat de ledemaatknop voorbij de geënte hiel zal groeien zo, vooral bij jonge stadia, de hiel wordt in de proximale extremiteit blijven.
6. Pick-up een kraal van zowel de groeifactor of drugs met behulp van extra fijn watchmakers pincet of een lus gemaakt van een wolfraam naald. Als de kraal is gedrenkt in hetzij DMSO en fenolrood, spoelen in PBS alvorens het embryo. Breng de kraal naar de embryo met de tang / draad lus. Gebruik dan de geslepen wolfraamdraad aan de korrel te voegen in de incisie.
7. Voeg 1-2 ml PBS / FCS om het ei te zorgen dat het embryo gehydrateerd wordt gehouden, maar vermijd direct aanbrengen op het embryo zich als dit de embryo's kunnen beschadigen en de kraal te worden verdreven. Verzegel het ei met tape en terug naar de incubator.

Resultaten

Bij HH stadium 21 MyoD niet wordt uitgedrukt in ontwikkelingslanden ledematen myoblasten hoewel kleuring te zien in de myotoom van de ontwikkeling somieten (Figuur 1A). Figuur 1B toont in situ hybridisatie voor MyoD 6 uur na FGF18 kraal graft. MyoD wordt geïnduceerd in myoblasten nabij de hiel terwijl er geen expressie in de contralaterale ledemaat. Co-enten een kraal gedrenkt in U0126, een specifieke remmer van MEK, blokken FGF18 inductie van MyoD (figuur 1C)....

Discussie

Het gebruik van kralen grafts rechtstreeks op ontwikkelende weefsels in ovo is een krachtig hulpmiddel om de rol van de groeifactor signalering ontleden tijdens de ontwikkeling die ongekende controle over het ontwikkelingsstadium waarin zij worden toegepast en de blootstellingsduur.

De keuze van de kraal voor elk type molecuul van belang. Kleine hydrofobe moleculen, zoals beschreven remmers en retinoïnezuur, goed binden gewoonlijk gederivatiseerde AG 1-X2 korrels hoewel het noodzakelijk om d...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Heparine acrylkralen	Sigma	H5263	De acryl-heparine kralen die zijn gebruikt, zijn niet langer verkrijgbaar. Er is echter een alternatief product beschikbaar, heparine agarose kralen, cat no H6508. Deze zijn transparant dus moeilijker om mee te werken, maar kunnen op dezelfde manier als AG 1-X2 kralen met fenol rood worden gekleurd,
AG 1-X2 kralen	Bio-Rad	140-1231
Affi Gel blauwe kralen	Bio-Rad	153-7301; 153-7302	Deze kralen zijn gebruikt met een reeks groeifactoren, waaronder Shh en FGF's en kunnen worden gebruikt om heparine kralen te vervangen
FGF18	Peprotech	100-28	Resuspendeer in PBS met 0/1% BSA, bereid eenmalige gebruiksaliquots van 0,5-1ul en bewaar bij -80°C. Batches en leveranciers kunnen variëren, dus verschillende concentraties moeten worden getest om een effectieve dosis te bepalen.
U0126	Cell Signalling	9903	Maak een 20mM stockoplossing in DMSO en bewaar in eenmalige gebruiksaliquots bij -80°C. Bescherm tegen licht.
BMS-493	Tocris Biosciences	3509	Resuspendeer in DMSO en bewaar in eenmalige gebruiksaliquots bij -80°C. Bescherm tegen licht.
Zwarte Indiase inkt	Windsor and Newton	5012572003384 (30 ml)	Hoewel er alternatieven voor dit product beschikbaar zijn, moet u voorzichtig zijn, omdat sommige inkten giftig zijn voor embryo's
Wolfraamdraad, 0,1 mm dia. 99,95%	Alfa Aesar	10404
Penicilline / streptomycine	Sigma	P0781	Verdun 100X in PBS/inkt en PBS/FCS