Optogenetische Functionele MRI

Summary

Dit protocol beschrijft de stappen en gegevensanalyse die nodig zijn om optogenetisch functioneel magnetische resonantiebeeldvorming (ofMRI) met succes uit te voeren. ofMRI is een nieuwe techniek die high-field fMRI-uitlezing combineert met optogenetische stimulatie, waardoor het mogelijk wordt om celtype-specifieke kaarten van functionele neurale circuits en hun dynamica in de gehele levende hersenen te maken.

Abstract

Het onderzoek naar de functionele connectiviteit van precieze neurale circuits in de gehele intacte hersenen kan worden bereikt door middel van optogenetische functionele magnetische resonantie beeldvorming (ofMRI), een nieuwe techniek die de relatief hoge ruimtelijke resolutie van hoge-veld fMRI combineert met de precisie van optogenetische stimulatie. Glasvezels die de levering van specifieke lichtgollengten diep in de hersenen in vivo mogelijk maken, worden geïmplanteerd in regio's van belang om specifiek gerichte celtypen te stimuleren die genetisch zijn geïnduceerd om lichtgevoelige trans-membraan geleidingskanalen, opsines genaamd, te expresseren. fMRI wordt gebruikt om een niet-invasieve methode te bieden voor het bepalen van de globale dynamische respons van de hersenen op optogenetische stimulatie van specifieke neurale circuits door meting van het bloed-zuurstof-niveau-afhankelijke (BOLD) signaal, dat een indirecte meting van neuronale activiteit biedt. Dit protocol beschrijft de constructie van glasvezelimplantaten, de implantatiechirurgieën, de beeldvorming met foto-stimulatie en de gegevensanalyse die nodig is om ofMRI met succes uit te voeren. Samengevat zijn de nauwkeurige stimulatie- en hele-hersenenbewakingscapaciteit van ofMRI cruciale factoren om van ofMRI een krachtig hulpmiddel te maken voor de studie van de connectomics van de hersenen in zowel gezonde als zieke toestanden.

Introduction

Optogenetische functionele magnetische resonantie imaging (ofMRI) is een nieuwe techniek die de ruimtelijke resolutie van high-field fMRI met de precisie van optogenetic stimulatie ^1-11,38 combineert, waardoor celtype-specifieke kaart brengen van functionele neurale circuits en hun dynamiek in het hele hersenen. Optogenetics maakt specifieke celtypen te worden gericht op stimulatie door de introductie van lichtgevoelige transmembraan conductantie kanalen genoemd opsins. Specifieke elementen van neurale circuits zijn genetisch gemodificeerd om deze kanalen te drukken, waardoor milliseconde-tijdschaal modulatie van de activiteit in de hersenen intact ^1-15. fMRI geeft een niet-invasieve werkwijze voor het bepalen globale dynamische reactie van de hersenen om optogenetic stimulatie van specifieke neurale circuits door middel van meting van de bloed-zuurstof-niveau-afhankelijke (BOLD) signaal ^16-18, die een indirecte meting van neuronale activiteit verschaft.

De combinatie van deze twee technieken, genoemd optogenetic functionele magnetische resonantie imaging (ofMRI), is voordelig ten opzichte van andere methoden voor het registreren hersenactiviteit tijdens stimulatie zoals elektrofysiologie, omdat het zicht op de hele hersenen bij relatief hoge ruimtelijke resolutie kan leveren. Dit maakt de detectie van neuronale activiteit in reactie op stimulatie gericht op grote afstand van de plaats van stimulatie zonder dat invasieve implantatie van registrerende elektroden ^1-11. ofMRI is voordelig ten opzichte van de traditionele methode van het uitvoeren van elektrische stimulatie gedurende fMRI, te rekruteren verschillende celtypes de elektroden en daarmee verwarren de causale invloed van elke populatie ^19. Bovendien zijn de elektroden voor elektrische stimulatie en de opgewekte stroom kan artefacten produceren tijdens MRI ^20. Inderdaad, ofMRI maakt de observatie van de invloed op de mondiale hersenactiviteit van de specifieke modulatieen van een grote verscheidenheid aan celtypen door middel van geavanceerde genetische targeting technieken zoals het Cre-Lox-systeem in transgene dieren of het gebruik van promotoren. Combinatorische optische controle met hele-brain monitoring mogelijk ofMRI door het gebruik van zowel NpHR remmen en ChR2 specifieke celtypen te wekken. De optogenetic toolkit beschikbaar voor gebruik in ofMRI is aan snelle verbetering in de tijd met de introductie van opsins met verhoogde lichtgevoeligheid of verbeterde kinetiek van gestabiliseerde stapfunctie opsins (SSFOs) of rood-verschoven opsins dat de vereiste geïmplanteerde vezel kan teniet optica, waardoor niet-invasieve beeldvorming tijdens stimulatie ^21. Deze mogelijkheden zijn niet beschikbaar bij elektrische stimulatie.

Echter signaalartefacten gevolg van verwarming van weefsel door licht levering in de hersenen gerapporteerd ^22, waarbij temperatuur geïnduceerde modificatie van relaxatietijden is aangetoond dat pseu producerendo activering. Onderzoekers uitvoeren ofMRI moet daarom bewust te zijn van dit potentieel verwarren. Met de juiste setup en controles, kan het probleem worden aangepakt. Bovendien kunnen betrekkelijk lage tijdsresolutie het meten van de hemodynamische respons in fMRI een beperkende factor voor bepaalde toepassingen van deze techniek.

Dit protocol worden eerst de constructie van de optische implantaten die levering van specifieke golflengten van licht mogelijk diep in de hersenen in vivo. Het protocol beschrijft dan de levering van de opsin codeert virale vector een nauwkeurige hersengebied middels stereotactische chirurgie. Vervolgens wordt het protocol beschrijft het proces van de hersenen als geheel functionele MRI bij gelijktijdig licht stimulatie. Ten slotte is het protocol schetst elementaire data-analyse van de verkregen gegevens.

Van de nota, de hier beschreven optogenetics vereisen een chronische implantaat voor lichte levering. De glasvezel implantaten stabiel en biocompatibel, waardoor longitudinale scannen en het onderzoek van neurale circuits gedurende een periode van maanden ^23,24.

Kortom, de precieze stimulatie en hele hersenen monitoring mogelijkheden van ofMRI cruciale factoren maken ofMRI een krachtig hulpmiddel voor de studie van de connectomics van de hersenen. Bovendien kan het nieuwe inzicht in de mechanismen van neurologische aandoeningen ²⁵ wanneer gekoppeld aan verschillende diermodellen verschaffen. Inderdaad, ofMRI gebruikt om de netwerkactiviteit afzonderlijke hippocampale subregio's geassocieerd met convulsies ⁸ helderen. Daarom zal laboratoria geïnteresseerd zijn in het beantwoorden van systemen-level neurowetenschap vragen deze techniek van belang te vinden.

Protocol

Ethiek Verklaring: Experimentele procedures hier zijn door de Stanford University Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) goedgekeurd.

1. Voorbereiding van patchkabels en Huls Implants

Noot: Hoewel flardkabels en flensbus implantaten zijn in de handel verkrijgbaar, produceren deze interne maakt bijzondere uitvoeringen en kost minder.

1. Op een vezel patch kabel bereiden leveren licht van de laser om het implantaat in de hersenen, eerste splitsen de optische vezel op de gewenste lengte.
   1. Met behulp van een vezelmes, beëindigen de optische vezel naar een platte uiteinde op het aansluitpunt te produceren. Als de vezel is bedekt met een jasje, strippen de jas met een vezel striptang vooraf.
   2. Klieven andere uiteinde van de optische vezel op de gewenste lengte van de kabel te produceren, zodat de kabel lang genoeg is om zich vanaf de lichtbron aan het dier in de boring vande scanner.
2. Meng een kleine hoeveelheid epoxy lijm in een 1: 1 verhouding op een stuk aluminiumfolie kort voor de volgende stap, zoals de epoxy te viskeus wordt voor 5 minuten na mengen.
3. Met behulp van een stokje, pas zacht epoxylijm op het deel van de vezel dat in de concave zijde van de keramische ring wordt geplaatst en vervolgens een kleine druppel op het oppervlak van de vlakke zijde van de ferrule. Nadat deze in de ferrule, zorgen dat een korte lengte van vezels (<0,5 mm) uitsteekt vanaf de vlakke zijde van de keramische ring. Laat de epoxy lijm O / N uitharden optimaal resultaat.
4. Aan de zijde van de optische vezel kabel die verbonden is met de laserlichtbron, pas zacht epoxylijm op het deel van de vezel dat in de concave zijde van de ferrule van de FC / PC aansluiting wordt geplaatst en vervolgens een kleine laten vallen op het oppervlak van de vlakke zijde van de ferrule. Na deze in de ring, te verzekerendat een kleine vezellengte (<0,5 mm) uitsteekt vanaf de vlakke zijde van de ferrule. Laat de epoxy lijm O / N uitharden optimaal resultaat.
5. Pools het platte uiteinde van de ferrules beide zijden van de kabel met een polijstschijf met pincet voorzichtig neerwaartse druk op de ferrule kunnen toepassen bij het maken figuur-8 rotaties op aluminiumoxide lapping platen (van 3 urn tot 1 urn tot 0,3 urn grit ).
6. Onderzoekt het platte uiteinde van de ferrule met een microscoop bij 100x vergroting. Zorgen dat het oppervlak van het platte uiteinde, met inbegrip van de vezeloptische oppervlak zelf, is vrij van epoxy lijm; verder polijsten of epoxy lijm op het oppervlak blijft. Zorg ervoor dat de glasvezel oppervlak niet heeft gebroken of afgestoken.
   LET OP: Zorg ervoor dat het personeel de nodige veiligheid laser trainingen en draag laserveiligheid bril voordat u met laserapparatuur.
7. Sluit de fiber optic patchkabel aan het laserlicht bron via de FC / PC-aansluiting en lijn van de fIber tip om het brandpunt van de koppeling. Meet het licht overdrachtsvermogen van de vezel met een vermogensmeter voldoende lichtopbrengst garanderen.
   Let op: De volgende stappen zijn voor het bereiden van keramische ferrules met glasvezel voor chronische implantatie in de hersenen; keramische ferrules zijn hol in het centrum en het dragen van glasvezel aan het licht te bevrijden van een patch-kabel aan op een regio van belang (ROI) in de hersenen.
8. Met behulp van een vezelmes, beëindigen de optische vezel naar een platte uiteinde op het aansluitpunt te produceren. Als de vezel is bedekt met een jasje, strippen de jas met een vezel striptang vooraf.
9. Klieven andere uiteinde van de optische vezel tot de gewenste lengte voor implantatie te produceren in de hersenen. Bepaal de lengte van de vezel met een stereotaxische atlas het ROI in de hersenen te richten.
   1. Bijvoorbeeld: om dorsale hippocampus bij ratten die 3,5 mm onder bregma target zorgen dat de lengte van de vezel uitsteekt uit het ferrule is 3,5 mm + 0,25 mm, goed voor schedel dikte en waardoor foutmarge. Daarom controleren of de uiteindelijke lengte van de vezel is 3,5 mm + 0,25 mm + 10,5 mm (lengte van de ring) = 14,25 mm.
10. Meng een kleine hoeveelheid epoxy lijm in een 1: 1 verhouding op een stuk aluminiumfolie kort voor de volgende stap (epoxy lijm te viskeus wordt voor 5 minuten na mengen).
11. Met behulp van een stokje, pas zacht epoxylijm op het deel van de vezel dat in de concave zijde van de keramische ring wordt geplaatst en vervolgens een kleine druppel op het oppervlak van de vlakke zijde van de ferrule. Nadat deze in de ferrule, zorgen dat een korte lengte van vezels (<0,5 mm) uitsteekt vanaf de vlakke zijde van de keramische ring. Laat de epoxy lijm O / N uitharden optimaal resultaat.
12. Pools het platte uiteinde van de ferrule met een polijstschijf met pincet zachte neerwaartse druk uitoefenen op de ring terwijl het figuur-8 rotatieinzake aluminiumoxide lapping platen (van 3 urn tot 1 urn tot 0,3 urn grit).
13. Onderzoekt het platte uiteinde van de ferrule met een microscoop bij 100x vergroting. Zorgen dat het oppervlak van het platte uiteinde, met inbegrip van de vezeloptische oppervlak zelf, is vrij van epoxy lijm; verder polijsten of epoxy lijm op het oppervlak blijft. Zorg ervoor dat de glasvezel oppervlak niet heeft gebroken of afgestoken.
14. Paar de gepolijste ferrule een glasvezel patchkabel met een ring huls en sluit de patch-kabel aan op een laser lichtbron. Meet het licht zendvermogen aan het uiteinde van de vezel met een vermogensmeter voldoende efficiëntie.
15. Een logboek van het vermogen vereist van de stift patch kabel voor elke ferrule implantaat uitgang het gewenste vermogen aan het uiteinde van de glasvezel (2,5 mW in dit protocol). Gooi ferrules met een vermindering van meer dan 50% en met een niet-cirkelvormige uitgang patroon.

2. Stereotaxische Implantation Chirurgie en Virusinjectie

1. Zorg dat alle experimentele procedures die het gebruik van dieren worden goedgekeurd door de lokale IACUC. Handhaaf aseptische omstandigheden tijdens survival operaties door het volgen van aseptische procedures, inclusief het gebruik van steriele handschoenen, steriel maskers, steriele chirurgische gordijnen en gesteriliseerd chirurgische instrumenten.
   LET OP: Zorg ervoor dat chirurgen zijn het dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), met inbegrip van een veiligheidsbril voor het begin van de procedure. Volg standaard bioveiligheid procedures bij het werken met adeno-geassocieerde vector (AAV), zorg ervoor dat spatten te voorkomen. Gooi AAV afval in een biohazard container.
2. Laad een microliter injectiespuit met voldoende AAV voor injectie in het dier plus extra om rekening te houden voor eventuele verliezen volume (totaal 4 pl per dier), waarbij de spuit op ijs voor gebruik. In dit protocol wordt AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP bij een titer van 4x10 ¹² vg / ml gebruikt. Plaats het dier onder isofluraane anesthesie met een inductie kamer, verbonden met een precisie isofluraan vaporizer set bij 3-4% met een zuurstof gasbron.
3. Scheer het hoofd met een elektrisch scheerapparaat en het uitvoeren van een drievoudige chirurgische scrub op de huid met behulp van betadine en een 70% ethanol spoelen.
4. Zodra het dier is in diepe narcose (check teen reflex en ademhaling), immobiliseren schedel van het dier in een stereotaxische apparaat met een intra-aurale positionering studs en tandstang.
   Opmerking: De gehele procedure zal duren 1 - 2 uur, van de anesthesie-inductie naar herstel.
5. Stel de narcose op een passend niveau (1-3% isofluraan op de verdamper) en voortdurend toezicht op de vitale functies van het dier, het aanpassen van de anesthesie als nodig is om een ​​ademhaling van ~ 40 ademhalingen / min behouden. Dien oogzalf op de ogen van het dier te voorkomen droogheid terwijl onder verdoving.
6. Maak een 15 - 20 mm middellijn hoofdhuid incisie met een scalpel en schuif de hoofdhuid met behulp van chirurgische hemostats eenttached het periosteum. Referentie lambda en bregma op de boorkop plaatsen via coördinaten voor de ROI.
7. Boor een kleine craniotomie (2-3 mm) over de ROI met een tandheelkundige boor, het verzorgen van de hersenen niet te doorboren. Langzaam steek naald door de craniotomie aan de microliter injectiespuit het ROI in de hersenen.
8. Met een injectiespuit pompregelaar Injecteer 2 ul van de vector oplossing in het ROI. Met een stroomsnelheid van 150 nl / min weefselschade voorkomen. Nadat de injectie is voltooid, wacht 10 minuten voor het verwijderen van de injectiespuit langzaam met een snelheid van 0,5 mm / min.
9. Na injectie, droog het oppervlak van de schedel. Referentie lambda bregma en om de coördinaten te bevestigen en vervolgens de ferrule implantaat de doeldiepte (bijvoorbeeld 3,5 mm onder bregma voor dorsale hippocampus) met een snelheid van ongeveer 0,5 mm / min. Monteer de ring implantaat aan de schedel met behulp van tandheelkundige cement. Na de tandheelkundige cement gestold is, sluit de incisie met hechtingen (siZE 5-0 voor ratten) rond de tandheelkundige cement dop.
10. Na de operatie plaats het dier in zijn kooi afzonderlijk gehuisvest met de helft van de kooi op een kachel voor anesthesie herstel. Heeft een dier niet onbeheerd achter te laten tot het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven. Plaats het dier in het gezelschap van andere dieren totdat deze volledig is hersteld.
11. Voor postoperatieve pijnbestrijding toedienen buprenorfine subcutaan om 12 uur bij een dosering van 0,05 mg / kg voor 24 uur. Toedienen van antibiotica poeder dagelijks over de incisie site voor 3 dagen.
12. Verwijder de hechtingen ongeveer twee weken na de operatie om korstvorming te voorkomen.
13. Wacht 4-6 weken na injectie van het virus voldoende expressie van genen optogenetic voordat experimenten.

3. optogenetische Functionele MRI

LET OP: Wees voorzichtig rond de permanente magnetische veld van een MRI-scanner. Secure equipment, met inbegrip van de functie generator, lichtbron, ventilator, capnograaf en gastanks, voldoende afstand (minstens boven de 5 Gauss limiet).

1. Leg het dier onder gas anesthesie met een inductie kamer, verbonden met een precisie isofluraan vaporizer vastgesteld op 5% met een zuurstof gasbron.
2. Zodra het dier is in diepe narcose (check teen reflex en ademhaling), intuberen het dier volgens het protocol beschreven in Rivard et al. (2006) aan het toezicht van kooldioxide mogelijk te maken door capnografie ^26. Opmerking: intubatie is van cruciaal belang voor het behoud van de juiste niveaus van uitgeademde CO ₂ tijdens de beeldvorming.
3. Zet het dier in de scanner houder.
   Let op: In dit protocol, werd de wieg aangepaste geproduceerd maar dergelijke cradles zijn ook commercieel verkrijgbaar. De rat cradle functies om het dier veilig te stellen binnen de scanner voor de levering van de anesthesie, verwarmde lucht en voor de beperking van de beweging.
4. Lever een mix van isofluraan (Ranging 1,2-1,5%) bij ongeveer 60% lachgas en 40% zuurstof via slang door de houder. Zorgen dat het dier hoofd stevig om bewegingsartefacten te vermijden wordt vastgesteld.
5. Zorg voor verwarmde lucht door slangen in de wieg en plaats een rectale thermometer met glijmiddel om de lichaamstemperatuur te controleren. Dien oogzalf op de ogen van het dier te voorkomen droogheid terwijl onder verdoving.
6. Sluit de optische vezel kabel op een laser lichtbron en het meten van de output op het puntje van beentje de patchkabel met een power meter.
7. Stel de gewenste vermogen (eerder bepaald in stap 1,15) op het gewenste (2,5 mW in dit protocol) aan het uiteinde van de vezeloptische geïmplanteerd in de hersenen veroorzaken. Overmatige vermogen van de vezeloptische mogelijke weefselschade in de hersenen kunnen veroorzaken of verwarming van weefsel dat signaalartefacten zal produceren, niet aanzienlijk verhogen het vermogen van de laservoorbij de beoogde output.
8. Voorkom licht lekkage uit het implantaat met een kegel van zwarte elektrische tape en hebben betrekking op de ogen van het dier. Stel de glasvezelkabel de ferrule implantaat aan het dier met een ring sleeve.
9. Plaats de spoel over het hoofd van het dier. Plaats de houder met dieren in de boring van de scanner.
   Let op: In dit protocol, de single-loop-zend ontvangstspoel werd op maat geproduceerd en pre-afgestemd op de optimale radiofrequentie van hersenweefsel te ontvangen.
10. Monitor ademhaling en lichaamstemperatuur gehele proces voltooid is kan de kunstmatige beademing en verwarming nodig fysiologische waarden binnen de perken te houden (let expiratoire CO ₂ is 3-4% door draaiing van de knoppen op het beademingsapparaat slagfrequentie en volume te regelen en dat temperatuur is 37 ° C door te klikken op de pijlen voor temperatuurinstelling).
11. Selecteer een positionering sequentie het imago van de dierlijke hoofd locatie. Indien de bregen is niet in het iso-centrum, pas de dierenkop locatie en herhaal de positionering scan totdat de hersenen is in het iso-centrum. Selecteer een lineaire vulplaten volgorde en klik lading in de volgorde selectie venster. Klik vervolgens beginnen om inhomogeniteiten van het magnetisch veld te verminderen.
    Opmerking: vulplaten is een kritische stap die direct de integriteit van de fMRI gegevens beïnvloeden.
12. Selecteer een T2-gewogen sequentie en klik lading in de volgorde selectie venster. Klik vervolgens beginnen T2-gewogen hoge resolutie coronale anatomische afbeeldingen ophalen voordat fMRI te controleren op de algehele integriteit van de hersenen en de locatie van de optische vezel implantaat te bevestigen.
    Opmerking: Deze beelden kunnen als anatomie overlays voor ofMRI scan series.
13. Verbinding BNC kabels van de triggering haven van de MRI scanner om de functiegenerator zodat de laserlichtbron wordt aangedreven volgens een experimentele paradigma stimulatie.
    Let op: In dit protocol, het stimuleren pAradigm is 30 sec van de baseline, gevolgd door 20 seconden aan / 40 sec af voor zes min.
14. Selecteer een multi-slice gradiënt opgeroepen echo (GRE) sequentie en klik lading in de volgorde selectie venster. Vervolgens klikt u op Start te verwerven 35 mm x 35 mm (2D FOV) in het vlak coronale plakjes met 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm ruimtelijke resolutie.
    Opmerking: de GRE sequentie die hier gebruikt heeft een herhalingstijd (TR) en echo tijd (TE) van TR / TE = 750/12 msec en een 30 ° flip hoek.
15. Aan het einde van de scan, verwijder het dier uit de scanner en de monitor totdat het ontwaken uit narcose en kan borstligging behouden.

4. ofMRI Data Analysis

Let op: De volgende stappen worden uitgevoerd in MATLAB, zoals beschreven in een publicatie over high-throughput ofMRI ^27.

1. Nadat de ruwe scangegevens is overgebracht naar de computer gebruikt voor analyse, gebruik schuifraam reconstructie om het beeld elke TR te werken, meteen vier-interleave spiraal uitlezing, 750 msec TR en 12 msec echo tijd tot 23 sneetjes per scan serie te verwerven. In plaats van de conventionele reconstructie waar nieuwe fMRI beelden worden gereconstrueerd nadat alle schutbladen worden verworven voor elk segment, het schuifraam reconstructie methode reconstrueert beelden na de overname van elk schutblad ^27.
2. Verwerk de ruwe gegevens voor twee-dimensionale netten in de wederopbouw, beweging correctie, en de berekening van tijdreeksen, zoals eerder ²⁷ beschreven.
3. Gebruik een drempel samenhang werkwijze geactiveerde voxels bepalen door het berekenen van het percentage modulatie van de BOLD signaal van elke voxel ten opzichte van de referentieperiode verzameld vóór stimulatie zoals eerder ²⁷ beschreven. Bereken samenhang waarden de omvang van de Fourier transformatie van de herhalingsfrequentie van de stimulatie cycli gedeeld door de som van kwadraten van alle frequentiecomponenten ^8.
4. Met behulp van de time-serie data voor elke vOxel, gemiddeld-motion gecorrigeerde beelden die deel uitmaken van opeenvolgende scans van dezelfde stimulatie paradigma eerste. Af te stemmen dan de gemiddelde 4D-beelden naar een gemeenschappelijke coördineren frame met een zes graden-van-vrijheid star lichaam transformatie plus isotrope scaling voor de vergelijking binnen en tussen dieren zoals eerder ²⁷ beschreven.

Results

Figuur 1 en figuur 2 tonen representatieve gegevens uit 20 Hz (15 msec pulsbreedte, 473 nm, 30% duty cycle) optogenetic stimulatie van de motorische cortex. Een stimulatie paradigma van 30 seconden basislijn gevolgd door 20 sec op / 40 sec uit zes minuten werd gebruikt. Eerdere studies hebben aangetoond dat dit paradigma produceert stevige BOLD signaal van optogenetic stimulatie ^1,8. Figuur 1 toont geactiveerde voxels gedetecteerd zowel de lokale plaats van stimulatie (motorische cortex) en in de thalamus, als gevolg van de lange afstand synaptische verbindingen tussen deze gebieden. Figuur 2 toont dat temporele informatie kan worden afgeleid uit HRFs, als thalamische gebeurt vertraagd (lagere initiële helling) vergelijking met de motorische cortex optogenetic respons na stimulatie.

p_upload / 53346 / 53346fig1.jpg "/>
Figuur 1. Activatie Kaart van BOLD signaal geïnduceerd door optogenetische Stimulatie van CaMKIIa expressie cellen in motorische cortex. Samenhang waarden van actieve voxels, geïdentificeerd als die aanzienlijk gesynchroniseerd met herhaalde prikkels, worden getoond bedekt op een coronale anatomische slice-T2-gewogen. De verzamelde gegevens over een zes min, 30 sec periode (eerste 30 sec baseline en zes stimulatie cycli van 20 seconden aan / 40 seconden af ​​met 473 nm licht, 20 Hz, 15 ms pulsbreedte) worden gecondenseerd in één activering kaart. Sequential schijfjes zijn 0,5 mm van elkaar en de locatie van de glasvezel implantaat wordt aangeduid met de driehoek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Hemodynamische Response Function. (links) Het percentage modulatie van het BOLD signaal ten opzichte van de basislijn wordt getoond voor actieve voxels in de motorische cortex en de thalamus tijdens optogenetic stimulatie van de motorische cortex (zes stimulatie cycli van 20 seconden aan / 40 sec off met 473 nm licht, 20 Hz, 15 msec puls breedte). Gearceerde grijze foutbalken geven standaardafwijking over geactiveerde voxels binnen ROI. (Rechts) tijdgemiddelden antwoorden worden gegeven door de hemodynamische respons functie (HRF). De thalamus HRF toont een vertraagde reactie ten opzichte van de gestimuleerde motorische cortex. Blauwe balken geven de periodes van 473 nm fotostimulering. Gearceerde grijze foutbalken geven standaardafwijking in zes cycli. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Beweging van het subject tijdens de beeldvorming is een belangrijke bron van artefacten die kunnen leiden tot beschadiging van gegevens. Adequaat beveiligen van het dier op de imaging cradle kan een dergelijke artefacten te minimaliseren zal het handhaven van de juiste verdoving niveaus. Hier gebruikten we isofluraan maar alternatieve anesthetica, zoals medetomidine of ketamine en xylazine, moeten worden overwogen. Echter, de niveaus en de keuze van anesthesie vele parameters beïnvloeden de hersenen, waaronder de BOLD respons ^28. Isofluraan kan veranderingen in neuronale prikkelbaarheid ²⁹ veroorzaken. Andere anesthetica kan ook invloed hebben op GABA synaptische remming ^30. Zo is de keuze van anesthesie is belangrijk bij het uitvoeren ofMRI gezien zijn vermogen om neuronale activiteit beïnvloeden. ofMRI in de afwezigheid van anesthesie is mogelijk, maar kan een uitdaging met verhoogde beweging van het dier, dat kan worden verlaagd als het dier gewend; zoals wakker ofMRI studies zijn eerder voerde eennd zou de verstorende invloed van verdoving op de hersenen ^9,10 vermijden. Naverwerking motion correctie algoritmes kunnen worden gebruikt om de effecten van beweging sterk verminderen. Een aantal van deze methoden bestaan, met inbegrip van de inverse Gauss-Newton algoritme gebruikt in dit protocol, dat de som van de kwadraten kosten functie van het referentiegebied en het beeld minimaliseert onder correctie. Het algoritme is nuttig omdat het zorgt voor een snelle en krachtige beweging correctie, met behulp van een GPU parallel platform ontwerp tot de verwerking tijden ²⁷ te verminderen.

Voor de wederopbouw van gegevens in dit protocol, werd op maat geschreven software in een MATLAB-omgeving gebruikt voor twee-dimensionale netten in de wederopbouw, waar de spiraal monsters in k-ruimte worden omgebouwd tot gerasterde beelden ^31-33. Tijdreeksgegevens werden gegenereerd door het berekenen van het percentage modulatie van het BOLD signaal van elk voxel ten opzichte van de basislijn periode voorafgaand aan stimulatie verzameld. Voxels waarvan tijdreeksen werden synchroniseerd met blokken optogenetic stimulatie met een coherentie waarde van 0,35 of meer werd gedefinieerd als geactiveerde voxels; deze samenhang komt overeen met minder dan 10 ^-9 P waarde ^8. Samenhang waarden werden berekend als de grootte van de Fourier transformatie van de herhalingsfrequentie van de stimulatie cycli gedeeld door de som van kwadraten van alle frequentiecomponenten ^8,27. Familywise fout kan worden geregeld met de Bonferroni-correctie voor meerdere vergelijkingen. Andere analysemethoden kunnen worden gebruikt, waaronder parametrische statistische tests zoals de algemene lineaire modellen (GLMS). De samenhang methode vereist minder voorkennis van de HRF vergelijking met de conventionele algemene lineaire model. Daarom is het voordelig bij het verkennen van gegevens met behulp ofMRI. Echter, de samenhang methode alleen gebruikt worden voor gegevens blokontwerpen of geselecteerde evenementgerelateerde ontwerpen met een vast interval interstimulus en kunnen niet worden gebruikt ofMRI gegevens met andere event-related ontwerpt of gemengde ontwerpen. Vervolgens kan dynamische causale modellering (DCM) worden gebruikt om de interacties tussen hersengebieden geïdentificeerd door middel van ofMRI analyseren. DCM is een Bayesian statistische techniek ontwikkeld voor de analyse van functionele connectiviteit van het systeem reacties op experimentele inputs tijdens fMRI ^34.

Aanvullende technische problemen voor ofMRI komen hier aan bod. Implantaten kunnen worden beschadigd of vallen, waardoor het verwijderen van het zieke dier uit de studie. Re-implantatie operaties worden niet aanbevolen als gevolg van de extra onzekerheid van zich te richten op dezelfde ROI als in het oorspronkelijke implantatie chirurgie en als gevolg van dierenwelzijn. Vanwege de aanzienlijke hoeveelheid tijd en middelen die in elk dierlijk subject, onderzoek van de sterkte van het materiaal is een belangrijke zorg bij het kiezen van een geschikte tandheelkundig cement voor gebruik in ofMRI studies. De implantatie chirurgie is een kritische factor bij het maximaliseren van de levensduur van de Implant en dierlijke patiënt. Bijvoorbeeld, ervoor te zorgen dat de schedel droog is voor het aanbrengen van de tandheelkundige cement en het plaatsen van een voldoende hoeveelheid cement rond de keramische ring implantaat kan zorgen voor stabiliteit over de mogelijke maanden durende tijdlijn van het dier tijdens de studie. Daarnaast kunnen alternatieve ontwerpen kooi worden onderzocht en met de lokale dier zorginstelling besproken kooien met draad toppen die het voedsel en water dat vaak steken in de kooi te voorkomen en bieden mogelijkheden voor het dier om het implantaat beschadigen. Belangrijk is dat de tandheelkundige cement zorgvuldig worden gekozen om artefacten die invloed beeldvorming en andere cementen kan worden getest door toepassing op een fantoom en beeldvorming in een scanner voor gebruik bij dierproeven verminderen. Trial and error met diverse tandheelkundige cement heeft aangetoond dat de cement gebruikt in dit protocol geeft relatief weinig artefacten. Een ander technisch probleem bij het uitvoeren ofMRI is de nauwkeurigheid van vezeloptische plaatsing op de beoogde ROI, gezien de extremely kleine afstanden die kunnen bestaan ​​tussen kernen in de hersenen ^35. Na de implantatie operaties kunnen T2-gewogen anatomische scans worden gebruikt om correcte plaatsing bepalen bedekken op een hersenatlas. De vaardigheid van de chirurg en de praktijk uitvoeren van deze operaties kunnen verbeteren juiste plaatsingspercentages. De specificiteit en expressie van het opsin bij de beoogde ROI kan aan het einde van de studie worden geverifieerd door perfuseren het dier en de vaststelling van de hersenen, met behulp van immunohistochemie of de endogene fluorescentie van een reporter-eiwit tag aan de opsin voor visualisatie. Deze reporter eiwitten kunnen ook worden colocalized met andere eiwitten zodat de opsin wordt uitgedrukt in de gewenste neurale celtypes ^1,8,15,25. Zoals eerder vermeld, kunnen artefacten ontstaan ​​bij het ​​uitvoeren ofMRI door verwarming van weefsel tegen licht aflevering ^22. Het weefsel verwarmen veroorzaakt modificatie van relaxatietijden, waardoor valse BOLD signaal. Om ervoor te zorgen dat acactivatie gevolg van lichte stimulatie tijdens ofMRI niet door deze artefact zou opsin-negatieve controles worden uitgevoerd waarbij ofwel zoutoplossing geïnjecteerde dieren of dieren geïnjecteerd met controle fluorofoor vectoren (zoals AAV-CaMKIIa-EYFP) ondergaan ofMRI. Daarnaast moet alleen goed gevormde glasvezel implantaten met goede lichttransmissie efficiëntie worden om de noodzaak hoge laservermogens gebruiken verwijderen. ofMRI studies zijn uitgevoerd waarbij valse activering als gevolg van weefsel verwarming is niet een probleem ^1,6-8,10,11 geweest.

Wat de keuze van vector de vereiste optogenetic genen in neuronen voor expressie, zijn AAV niet bekend dat zij ziekten bij mensen veroorzaken en dus een handige optie, aangezien het lagere bioveiligheidsniveau moeten deze middelen (BSL-1) gebruikt. Daarnaast is een groot aantal kernen vector dragen AAV verpakt samen met optogenetic genen in voorraad en met meerdere serotypen. Het serotype van AAV worden gekozen based op de beoogde celpopulatie optimale expressieniveaus ^36,37 waarborgen. Lentivirussen kunnen ook worden gebruikt, maar vereisen een hogere bioveiligheidsniveau. De tijd die nodig is voor voldoende expressie van de genen optogenetic hangt mede af van de specifieke gebruikte diermodel, de specifieke gebruikte AAV en de specifieke experimentele paradigma. In dit protocol wordt Sprague Dawley ratten van 11 weken oud gebruikt en optogenetic studies beginnen 4-6 weken na injectie virus. Transgene muizen kunnen ook worden gebruikt in optogenetic studies. Er moeten proefprojecten uitvoeren om de specifieke hoeveelheid tijd die voldoende expressie van het opsins bepalen. Stimulatie paradigma kan variëren afhankelijk van de specifieke gebruikte opsin. In dit protocol wordt AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP gebruikt en de stimulatie paradigma 20 seconden aan / 40 sec uit. Bij gebruik van een SSFO, zal de stimulatie paradigma variëren omdat de SSFO vereist slechts een korte lichtpuls om ac te zijnveerd en vervolgens een korte lichtpuls in andere golflengte worden beëindigd.

Een bijkomend cruciaal punt van zorg bij het uitvoeren van ofMRI wordt voorkomen dat het licht lekkage uit het beentje implantaat interface met glasvezel patchkabel tijdens optogenetic stimulatie om een ​​verwarrende hersenen signaal afkomstig van visuele stimulatie te voorkomen, zelfs wanneer het dier is verdoofd. Kegels zwarte elektrische tape kan worden gebruikt om het licht van de ferrules blokkeren en de ogen van het dier in kwestie. Belangrijk is dat fysiologische waarden waaronder uitgeademde _CO2 en de lichaamstemperatuur van de patiënt goed worden gehandhaafd gedurende de duur van de beeldvorming. Expiratoire CO ₂ worden bewaard tussen 3-4% en de lichaamstemperatuur op 37 ° C. Bovendien, de vulplaten sequenties inhomogeniteit zoveel mogelijk te beperken in het magnetisch veld voor het starten ofMRI scant sterk bepalend voor de kwaliteit van de verkregen data BOLD. Controle van deze factorenis van cruciaal belang in het produceren van betrouwbare ofMRI data. In dit protocol worden DPSS lasers gebruikt als lichtbron voor optogenetic stimulatie. Omdat laserlicht coherent, kan meer dan genoeg vermogen gemakkelijk worden geleverd via de glasvezel. LED lichtbronnen gekoppeld met glasvezel zijn verkrijgbaar bij commerciële leveranciers, maar hebben het nadeel van verminderde kracht van lichttransmissie. De laser lichtbron vereist aanpassing aan elke specifieke fiber optic patch-kabel, maar met de praktijk, kan de uitlijning worden bereikt binnen enkele seconden tot minuten.

Toekomstige toepassingen van ofMRI omvatten het gebruik van de volgende generatie opsins zoals rood-verschoven opsins voor niet-invasieve beeldvorming stimulatie tijdens schakelen. Bovendien kan de implantatie van MRI-compatibele EEG of soortgelijke registrerende elektroden met de vezeloptische implantaat oog op het verkrijgen van gegevens met hoge resolutie temporele naast de hoge ruimtelijke resolutie gegevens van MRI. ofMRI met electrophysiological opname kan uitgebreide informatie over de functionele connectiviteit van de hersenen te bieden. Samengevat, de kracht van ofMRI de gehele hersenen bewaken in reactie op het stimuleren van specifieke celpopulaties gedefinieerd door genetische of anatomische identiteit maakt ofMRI een essentieel instrument voor gebruik in de studie van neurologische aandoeningen en de connectomics van de gezonde hersenen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7 Tesla scanner	Agilent Technologies	Discovery MR901 System
Sprague Dawley-ratten	Charles River	Crl:SD	11 weken oud
vezelsplijter	Fujikura	CT-05
multimode optische glasvezel	Thor Labs	AFS105/125Y
vezelstripper	Thor Labs	T08S13
keramische splitsleuvenhuls	Precision Fiber Products	SM-CS1140S
epoxylijm	Thor Labs	G14250
wattenstaafjes	Stoelting Co.	50975
multimode keramische zirkonia ferrules	Precision Fiber Products	MM-FER2002
FC/PC multimode connector	Thor Labs	30128C3
slijpschijf voor glasvezel	Precision Fiber Products	M1-80754
aluminiumoxide slijpplaat, 0,3 µm	Thor Labs	LFG03P
aluminiumoxide slijpplaat, 1 µm	Thor Labs	LFG1P
aluminiumoxide slijpplaat, 3 µm	Thor Labs	LFG3P
biologisch biologisch microscoop 40X-1.000X	Amscope	B100
laserveiligheidsbril	Kentek	KXL-62W01
473 nm DPSS-laser	Laserglow	LRS-0473
594 nm DPSS-laser	Laserglow	LRS-0594
Allen-zeskantsleutelset			2,0 mm (5/64") voor uitlijning van vezeltip naar brandpunt van koppeling in de laser
vermogensmeter, Si-sensor, 400-1.100 nm	Thor Labs	PM121D
Isofluran (Isothesia)	Henry Schein	50033
isofluranverdamper met inductiekamer	VetEquip	901806
NanoFil 100 µl-spuit	World Precision Instruments	NANOFIL-100
UltraMicroPump met SYS-Micro4-controller	World Precision Instruments	UMP3-1
functiegenerator	A.M.P.I.	Master-8
stereotax voor kleine dieren	David Kopf Instruments	Model 940
Model 683 kleine dierenventilator	Harvard Apparatus	550000
Type 340 capnograaf	Harvard Apparatus	733809
tandartsboor (roterend micromotorkit)	Foredom Electric Co.	K.1070
oftalmische zalf (Artificial Tears)	Rugby	00536-6550-91
instrumentensterilisator	CellPoint Scientific	Germinator 500	glaskralen sterilisator
antibioticumpoeder	Pfizer	NEO-PREDEF	neomycinesulfaat, isoflupredonacetaat en tetracainehydrochloride
buprenorfine pijnstiller	Hospira	NDC:0409-2012	schema III gereguleerde stof, 0,3 mg/ml stock