Membraan transportprocessen geanalyseerd door een Highly Parallel Nanopore Chip System aan Single Protein Resolution

Samenvatting

Het gepresenteerde protocol beschrijft de analyse van membraaneiwitgemedieerde transport op het niveau van enkelvoudige transporteurs met behulp van porie-overspande, oplosmiddelvrije lipide dubbellagen. Dit wordt bereikt door de creatie van in grote aantallen geproduceerde nanopore-arraychips, gecombineerd met zeer parallelle dataverwerving en analyse, waardoor de toekomstige vestiging van membraaneiwiteffectorscreenings mogelijk wordt.

Samenvatting

Membraaneiwit vervoer op de enkel eiwit niveau ontwijkt nog een gedetailleerde analyse, wanneer het substraat translocatie is niet elektrogene. Aanzienlijke inspanningen zijn gedaan op dit gebied, maar technieken voor directe high-throughput transport analyse in combinatie met oplosmiddelvrije lipide bilaag technieken die nodig zijn voor de analyse van membraan transporters zijn zeldzaam. Deze klasse van vervoerders is echter van cruciaal belang in cel homeostase en dus een belangrijke doelgroep in de ontwikkeling en methodologieën om nieuwe inzichten drug hard nodig.

De hier gepresenteerde manuscript beschrijft de inrichting en het beheer van een nieuwe biochip voor de analyse van membraaneiwit gemedieerd transportprocessen in één transporter resolutie. De biochip bestaat uit microcavities omsloten door nanoporiën die zeer parallel in het ontwerp en kunnen in industriële kwaliteit en kwantiteit. Eiwit-herbergen liposomen kunnen direct worden aangebracht opde chip oppervlak vormen van zelf-geassembleerde poriën verspreid over lipidedubbellagen behulp van SSM-technieken (vast ondersteund lipide membranen). Pore ​​omspant delen van het membraan vrijstaand, door een interface voor translocatie substraat in of uit de holle ruimte, eventueel gevolgd door multispectrale de fluorescentie in real-time. De oprichting van Standard Operating Procedures (SOP's) maakt het mogelijk de eenvoudige oprichting van-eiwit herbergen lipidedubbellagen op de chip oppervlak van vrijwel elke membraaneiwit dat functioneel kan worden opgelost. De enige voorwaarde is de oprichting van een tl-read-out systeem voor niet-elektrogene transport substraten.

High content toepassingen accomplishable door geautomatiseerde omgekeerde fluorescentie microscoop opnamen meerdere chips parallel. Grote datasets worden geanalyseerd met de vrij beschikbare maat gemaakt analysesoftware. Drie-kleuren multi-spectrale tlVerder lees-out zorgt voor een onpartijdige discriminatie data in verschillende event klassen, waardoor vals-positieve resultaten.

De chiptechnologie is momenteel gebaseerd op _SiO2 oppervlakken, maar verdere functionalisering behulp goud gecoate chip oppervlakken mogelijk.

Inleiding

De analyse van membraaneiwitten is geworden van de toenemende belangstelling voor fundamenteel en farmaceutisch onderzoek in de afgelopen 20 jaar. De ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen is afhankelijk van de identificatie en de gedetailleerde karakterisering van nieuwe targets, momenteel één van de beperkende factoren. Het feit dat ongeveer 60% van alle targets zijn membraaneiwitten ^1, maakt de ontwikkeling van technieken om hun belangrijkste functie helderen.

In het verleden, zijn technieken voor het bestuderen van elektrogene kanalen en transporters ontwikkeld veelheid ^2-4. Non-elektrogene substraten in tegenstelling presenteren een meer uitdagende taak. Zij zijn echter van bijzonder belang als voornaamste drug targets, omdat ze de flux van opgeloste stoffen en voedingsstoffen door het celmembraan en fungeren als de belangrijkste receptoren controle bij het ​​signaleren van cascades ^5.

Aanzienlijke inspanningen werden in de ontwikkeling van t gezetechniques de functie van membraan transporteiwitten ^{6, 7} bestuderen. Systemen met vaste drager als membranen meest veelbelovende hulpmiddelen ontstond in dit gebied ^8-10, waaronder vaste drager lipidendubbellagen gebonden dubbellagen ^{11, 12,} microblack lipide membranen ^{13, 14} en inheemse vesicle arrays ^{15, 16} te noemen. Sommige zijn zelfs verkrijgbaar als commerciële opstellingen ^{17, 18.} Voorbeelden zijn gepubliceerd combineren vermogen enkelvoudige membraaneiwitten te bestuderen op een zeer parallelle wijze ^{14, 19,} een voorwaarde voor screening toepassingen. Echter, deze methoden zelden overbruggen van fundamenteel onderzoek tot de industriële omgeving. Het feitelijke probleem vaak het vermogen van het systeem om automatiseerbare, de kostbare productie en / of bewerkelijke bereiding. Een aanpak overcoming alle hierboven genoemde obstakels is het einddoel.

De techniek die hier werd ontwikkeld om membraankanalen en transporters studie in vitro in een gecontroleerde omgeving voor de interne eiwitniveau ^20-22. Reconstructie van gezuiverde membraaneiwitten in LUV's is veel meer gevestigde dan vergelijkbare aanpak voor GUVs ^23-26 of zwarte lipide membranen ^27. Ze kunnen direct worden aangebracht op het chip oppervlak, waarbij bilaag vorming plaatsvindt via een zelf-assemblageproces. De glazen bodem ontwerp van de nanoporeuze chip (fig. 1) maakt lucht microscopie, die de eenvoudige automatisering van het systeem mogelijk maakt. In combinatie met een gemotoriseerde fase kan meerdere chips worden gemeten op hetzelfde tijdstip, waarbij elke gezichtsveld met duizenden afgesloten holtes voor analyse.

Figuur 1. Ontwerp van multiplex nanogaatje biochips. A) een silicon-on-insulator (SOI) wafer wordt gestructureerd door reactief-ion etsen. Ongeveer 1.150 individuele chips worden vervaardigd uit elk wafer met identieke eigenschappen en kwaliteit. B) Elke chip bestaat uit 250.000 individuele microcaviteiten met nano openingen. Schaal bar:. 200 pm C) elke holte is adresseerbare via multispectrale fluorescentie uitlezing. Een ondoorzichtige bovenlaag blokkeert de fluorescentiesignalen uit het bufferreservoir, waardoor de biochip compatibel met omgekeerde fluorescentie microscoop. D) Atomic Force Microscopy (AFM) beeldvorming openbaart gelijk geschikt poriënopeningen en oppervlakteruwheid van de siliciumdioxide-laag van 3,6 nm (n = 40) optimaal voor blaasje fusion. Schaal bar:. 5 micrometer E) Scanning electron microscopy beeld (SEM) toont een dwarsdoorsnede door de nanoporiën de toegang tot de femtoliter holten in de siliciumchip. Dit cijfer werd hergebruikt met toestemming van ^21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Alle data-analyse wordt uitgevoerd met behulp van freeware naar onbeperkte toegang voor eindgebruikers te garanderen. Tijdreeksen worden geanalyseerd met behulp van gratis software voor beeldverwerking en een custom build curve analyse software die batch processing en ongecompliceerd correlatie van grote datasets met meerdere fluorescerende kanalen en duizenden bochten.

De model-eiwit gebruikt in dit protocol is de mechanosensitieve kanaal van grote geleidbaarheid (MscL) kanaal eiwitten afkomstig van E. coli. Het functioneert als een klep om osmotische shock aard vrij, maar werd aangepast zodanig dat rationeel ontworpen Synthetic functionaliteiten kunnen covalent aan de kanalen vernauwing zijde worden bevestigd. Via charge-afstoting van het covalent gebonden activator (MTSET) het kanaal wordt geactiveerd om te openen, het creëren van een nano-klep. Kleine moleculen zoals ionen, water, kleine eiwitten, maar ook kleine fluoroforen kan doordringen door het kanaal. Hier wordt het eiwit gebruikt als een model om het vermogen van het systeem om eiwit gemedieerde translocatie detecteren tonen.

Protocol

1. Bereiding van grote unilamellaire blaasjes (LUV's)

1. Reinig een rondbodemkolf (10 ml volume) met stikstofgas om stof te verwijderen. Spoel de rondbodemkolf met ethanol.
   Opmerking: Residuele ethanol kan worden getolereerd en geen latere stappen verstoren.
2. Was een 1 ml glazen injectiespuit 4x met chloroform, om eventuele verontreinigingen te verwijderen. Voeg 4 ml SoyPC20 (25 mg / ml in chloroform) aan de rondbodemkolf en de dope lipideoplossing een extra DOPE ^{ATTO 390} tot een uiteindelijke concentratie van 0,1 mol%.
   Opmerking: In plaats van DOPE ^{ATTO 390} andere fluorofoor-gemerkte lipiden en lipofiele kleurstoffen kunnen ook worden gebruikt, afhankelijk van de beschikbare excitatiebronnen.
3. Sluit de rondbodemkolf een rotatieverdamper. Droog het lipide film voor 40 min bij 300 mbar, 30 ° C badtemperatuur en maximale rotatiesnelheid, een homogene vetfilm op de glazen wand van de kolf te vormen.
4. transfer de kolf met een hoge vacuümpomp en de droge lipide film aanvullende 30 minuten bij kamertemperatuur.
5. Voeg 5 ml buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; steriel gefiltreerd) en 8 glasparels (2,7 mm diameter, ethanol gewassen en gedroogd) aan de kolf. Verbind de kolf met het roterende verdamper en roteren zonder vacuüm bij 50 ° C op maximale snelheid.
   Opmerking: Glazen kralen mechanisch verdringen de lipide film van de glazen wand, wat leidt tot (multilamellaire) vorming van blaasjes. Na 45 min rotatie van de oplossing blijkt melkachtige en geen overblijvende lipide film moet zichtbaar zijn op de kolf muren. In plaats van glasparels andere methoden zoals sonicatie de kolf in een waterbad sonifier, vortexen de kolf of de zachte rehydratie methode is bruikbaar.
6. Breng de kolf onder inert gas (argon) een ultrasoonbad ultrasone trillingen gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.
   Opmerking: De ultrasone schokgolven verstoren de liposomen, waardoor ze unilamellaire.
7. Splits de LUV-oplossingin 1 ml porties.
8. Voer 5 vries / ontdooi cycli van bevriezen van de LUV oplossing in vloeibare stikstof, gevolgd door ontdooien bij 40 ° C in een waterbad.
   Opmerking: Dit leidt tot scheuren en spontane omlegging van afzonderlijke liposomen met elkaar, wat leidt tot vergroot.
9. Voor deze laatste bevriezingsstap slaan alle monsters bij -80 ° C.
   Opmerking: De LUV stabiel blijft gedurende tenminste 6 maanden.

2. Eiwit Reconstitutie

1. Ontdooien 1 ml LUV monster op ijs. Direct voor reconstructie, extruderen liposomen 17x door een 400 nm polycarbonaat filter membraan met behulp van een mini-extruder.
   Opmerking: Lipide aggregaten worden verwijderd en de uiteindelijke homogene grootteverdeling wordt bereikt.
2. (V / v) destabiliseren LUV door toevoeging van 4% Triton X-100 (v / v) tot een eindconcentratie van 0,25% en incubeer gedurende 5 minuten bij 50 ° C.
   Opmerking: De hoeveelheid liposomen in deze stap is afhankelijk van de massa van het gezuiverde MscL ^{G 22 C gebruikt (zie stap 2.3). Zuiver MscL G 22 C (afgeleid van E. coli) zoals beschreven in 28.}
3. Mix gezuiverd MscL ^{G 22 C} en detergens verzadigde liposomen 1:20 (w / w) verhouding en incubeer gedurende nog 30 minuten bij 50 ° C.
4. Voor het verwijderen afwasmiddel bio-korrels in Tris buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; steriel gefiltreerd) het eiwit / liposoom-oplossing, met 16 mg (vers gewicht) bio-korrels per ul detergent gebruikt om liposomen te destabiliseren stap 2.2.
5. Voer detergens verwijderen overnacht (16 uur) bij 4 ° C op een roterende plaat.
   Opmerking: Het constant mengen van de oplossing optimale detergensverwijdering.
6. Na verwijdering detergens proteoliposomen opslag bij 4 ° C en gebruikt voor experimenten op dezelfde dag.

3. Activity Assay

1. Tijdens eiwit reconstructie neem een ​​100 pl hoeveelheid van een schoonmaakmiddelgedestabiliseerd proteoliposoom oplossing na afwerkingsstap 2,3.
2. Voeg 1 volume calceïne (30 mM) aan het eiwit-liposoom-oplossing en incubeer aanvullende 5 minuten bij 50 ° C.
3. Verwijderen detergens uit de oplossing als beschreven in stap 2,4-2,6.
4. Na verwijdering detergent in evenwicht een grootte-uitsluiting-kolom (20 ml bed volume of meer) met Tris buffer (3x het volume bed).
   Opmerking: proteoliposoom scheiding kan worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, maar het houden van het monster constant op 4 ° C wordt aangeraden om optimaal eiwit activiteit mogelijk na fractionering.
5. Proteoliposomen gescheiden van vrij calceïne door toepassing van het gehele monster (200 pl) aan de gelfiltratiekolom. Laat het mengsel dringen in de kolom, gevolgd door elutie van de proteoliposomen uit de kolom via continue buffer applicatie geplaatst middels zwaartekracht. Let op de calceïnebevattende proteoliposomen als een discrete oranje band in de elutie front. Verzamel fracties van 500 & #181; l respectievelijk.
   Opmerking: vrij calceïne kleurstof elueren na proteoliposoom fractie met volledige scheiding.
6. Pipetteer 80 ul van elke fractie op een micro-well plaat voor TL uitlezing en identificeren van de fractie die het hoogste bedrag van de calceïnebevattende proteoliposomen via fluorescentie-emissie. Detecteren fluorescentie bij 520 nm met excitatie bij 490 nm. Gebruik het proteoliposoom fractie met het hoogste signaal voor volgende activiteitstest.
7. Meng 20 pl van de proteoliposoom-bevattende fractie met 980 ul Tris-buffer in een 1 ml cuvette fluorescentie.
8. Meet fluorescentie-emissie bij 520 nm (excitatie 490 nm) met een spectrofluorometer. Record voor 1 min en voeg 25 ul van MTSET ([2- (trimethylammonium) ethyl] methanethiosulfonate) van een voorraadoplossing (160 mM) en meng. Blijf op de opname tijdens het mengen. bereiden altijd de voorraad oplossing verse direct voor gebruik.
   Let op: Eenmaal opgelost in buffer MTSET hydrolyserenB binnen 30 minuten en niet-reactief. MTSET kunnen worden gewogen en bewaard in droge poeder monster bij -20 ° C tot gebruik.
   Noot: Eenmaal geactiveerd de MscL ^{G 22 C} kanaal opent en laat de ingesloten calceïne, wat leidt tot een plaatselijke afname van de concentratie van calceïne als effluxing de proteoliposomen en daaropvolgende dequenching van de kleurstof, wat resulteert in een toename van de fluorescentie-emissie.
9. Na de fluorescentie-emissie een stabiel plateau weer heeft bereikt, oplosbaar de liposomen door toevoeging van 50 pl Triton X-100 (4% v / v).
   Opmerking: niet op een grotere fluorescentie stijging kon worden vastgesteld, wat impliceert actief eiwit in elk liposoom.

4. Grootte Distributie Meting van LUV's met behulp van nano-deeltjes Tracking

1. Merk op dat slechts minimale monsters van het liposoom of proteoliposoom oplossing nodig grootteverdeling analyse met behulp van nanodeeltjes tracker zijn. Verdun een liposoom oplossing van 5 mg / ml lipide concentratie 1: 5000 (v / v) in buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; steriel gefiltreerd) voor analyse naar een eindvolume van 1 ml. Filter alle buffers gebruikt voor het verdunnen en LUV voorbereiding vooraf en reconstructie met behulp van een 0,2 um membraan om eventuele zwevende deeltjes zoals stof die grootteverdeling metingen verstoren verwijderen.
2. Was de stroom-kamer met ultra-zuiver water.
3. Gebruik het oppervlak markers om zich te concentreren op de lichtbundel. Injecteren ongeveer 300 pi van de verdunde liposoom monster en onmiddellijk sluit de uitgang klep om de stroom in de stroom kamer te stoppen, zonder dat er eventuele luchtbellen.
4. Pas de scherpstelling en de sluiter van de camera / gain-instellingen om voldoende verstrooiing signaal van het monster voor de detectie te garanderen.
   Opmerking: 20 - 80 signalen moeten duidelijk zichtbaar in het gezichtsveld worden. Voorkom overbevolking (> 80 signalen) als de software niet in staat zal zijn om de individuele signalen bijhouden wanneer overlappen.
5. Ga naar de "Capture" scrEén. Stel de temperatuur tot 25 ° C en de vangst duur tot 90 seconden met behulp van de software controles. Druk op "Record" om te beginnen met het opnemen van een tijdreeks.
   Let op: Na afloop van de tijdreeks een nieuw venster geopend.
6. Sla de tijdreeksen in de gegeven-formaat (* .avi). Om praktische redenen tijdens de batch-analyse op te slaan alle bestanden in één map.
7. Open de uitlaatklep en injecteer nog eens 300 ul in de stroom kamer. Sluit het ventiel en herhaal de stappen 4,3-4,6 maal.
8. Na het voltooien van alle steekproef runs was de stroom kamer met 5 ml ultrapuur water. Ga naar het scherm "Pre-Process". Stel de kalibratieparameters temperatuur = 25 ° C en de viscositeit = 0,91 voor de Tris buffer die in dit protocol.
9. Open de partij proces-venster en laadt de geregistreerde tijdreeksen (Advanced / Batch Process / Set File 1-3). Druk op "GA" om de grootteverdeling analyse starten.
   Let op: de analytische software automatisch volgt de enkele deeltjes en berekent de diameter op basis van hun bewegingsgedrag met behulp van de in stap 4.8 parameters.
   Opmerking: De resulterende grootteverdeling analyse slaat automatisch in dezelfde map als de tijdreeks bestanden.
10. Daarnaast maakt u een rapport bestand naar de resultaten (Export / Rapport PDF) samen te vatten.

5. Chip Holder Voorbereiding

1. Weeg 1,0 g MDX4 medische kwaliteit elastomeer base en 0,1 g MDX4 verharder in een 50 ml reageerbuis. Blend zowel grondig met een glazen bar.
2. Doe de buis in een exsiccator gedurende 1 uur ontgassen de kleefstof. Daarna gebruiken binnen 30 minuten voor de chip lijmen, omdat de kleefstof zal verharden en zijn te moeilijk om mee te werken.
3. Tijdens elastomeer ontgassen (stap 5.1) schoon te maken een objectieve glasplaatje grondig met chloroform om eventuele verontreinigingen voordat chip bonding verwijderen. Spoel de dia met 5 ml chloroform met een glazen injectiespuit. Verzamel dechloroform in een daaronder geplaatste beker. Na het wassen laat de dia drogen.
   Let op: Voer deze stap onder een zuurkast. Alternatief chloroform, kunnen andere organische oplosmiddelen zoals aceton worden gebruikt.
4. Stort een kleine hoeveelheid van het lijmen materiaal op het deksel glas met een pipet tip (crystal tips voor 10 pi pipetten). Herinner dat de chips moeten later in de 8-kamer diahouder passen en hebben derhalve de slede worden geplaatst.
5. Haal een chip op een moment uit de wafer board met behulp van fijne tip pincet en de chip deponeren op de daling van de lijm op de deksel glas. Zorg ervoor dat de gecoate zijde van de chip naar boven wijst.
6. Duw de chip op de dekking van glas met de achterkant van een stompe PE pincet. Opdat de lijm gelijkmatig verdeeld onder de chip, schuif de chip heen en weer. Kritische stap: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen gevangen onder de chip, zoals het optische beeldvorming verstorenvan de chip holten later. Ook voor zorgen dat er geen zelfklevend materiaal vervuilt de chip oppervlak.
7. Uitdrogen de afgewerkte dekglas gedurende 2 uur bij 65 ° C in een kast droger.
   Noot: chips nog steeds bedekt met een beschermende laag afkomstig van de fabricage die moet worden verwijderd.
8. Om de beschermende laag te verwijderen, het uitvoeren van een sequentiële oplosmiddel wasstap. Tijdens het uitharden van chips Verwarm een ​​waterbad tot 54 ° C.
9. Plaats 3 glazen bekers in het waterbad, beiden gevuld met isopropanol en één gevuld met aceton.
10. Plaats de chip dekglas in een houder en dompel het in de eerste isopropanol gevuld schotel voor 10 min. Daarna mogelijk in een aceton gevulde schotel, opnieuw incubeer 10 min door te verbinden voor de laatste wasstap aan de tweede isopropanol schotel en incubeer nog 10 min.
11. Haal de diahouder van het gerecht en zorgvuldig wassen uitgebreid met Ultrapure water, gevolgd door drogen van de chips met een voorzichtige stroom stikstofgas.
12. Take-off van de lamineren vel uit de 8-well sticky-slide en zet deze naar achteren op de bank. pick voorzichtig op de cover glijbaan en druk voorzichtig op de sticky-slide met de chips tegenover de putten. Laat de afgewerkte chip houder rust voor een paar minuten voor gebruik.

6. Assay Voorbereiding

Opmerking: Nanopore chips vastgelijmd aan een dekking van glas en van elkaar gescheiden door een 8-well sticky-slide bezitten het voordeel, kan die meerdere chips worden aangepakt in een enkele experimentele run, met chips wordt volledig gescheiden van elkaar.

1. Na chip houder voorbereiding, spoel elke chip met pure ethanol en drogen onder een stikstofgas, om eventuele verontreinigingen zoals stof te verwijderen.
2. Maak de chip oppervlak met lucht, zuurstof of stikstof plasma. Afhankelijk van het type plasmareiniging termijnen variëren: uitvoeren zuurstofplasma behandeling van 1 min, lucht en nitrogen plasma gedurende 5 min bij 0,3 mbar bij 80% vermogensinstelling (RF-vermogen gemiddeld of hoog).
3. Na incuberen plasmareiniging chips in zuivere ethanol gedurende 10-15 min holte nat wordt.
4. Stapsgewijze uitwisseling ethanol buffer door het toevoegen van 400 pl Tris-buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; steriel gefiltreerd), gevolgd door mengen van de oplossing zonder dat er luchtbellen en daaropvolgende verwijdering van 400 pl. Herhaal deze procedure 12 keer, om ethanol te verwijderen te garanderen.
   Opmerking: Ethanol is schadelijk voor liposomen en zwevende lipide dubbellagen zijn.
5. Dope Tris buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; steriel gefiltreerd) met 5 mM _CaCl2 en 1 uM Oy647 kleurstof. Volledig verwijderen van de wasbuffer uit de chip en onmiddellijk de gedoteerde buffer toe te voegen aan de chip. Opmerking: Chips worden bedekt met een dunne film na buffer wasbuffer verwijderd, zodat de chip niet in direct contact met lucht teneinde een constante bevochtiging van de holten en het chip oppervlak.
6. Voeg 1 mg / ml of LUV's proteo-LUV in Tris buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; steriel gefiltreerd) aan elk putje.
   Opmerking: Het eindvolume in elk putje is 300 pi. Overweeg latere toevoegingen van de controle kleurstof en de chemische modifier MTSET tijdens gedoteerde Tris buffer toevoeging.
7. Voor porie spanning lipide bilaag formatie op het chip oppervlak incubeer de chip gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met de liposoomoplossing. Daarna wassen elke chip met 4x 400 ul van Ca ^{2 +} -vrij Tris buffer.
8. Voeg de besturing kleurstof aan elk putje met een uiteindelijke concentratie van 5 uM. De chips zijn nu klaar voor de translocatie assay.

7. Assay Setup

1. Monteer de chip houder aan de epifluorescentie microscoop (20X lucht doelstelling, lange werkafstand). Focus op de rand van de nanogaatje chip gemakkelijker vinden het brandvlak van de micro-holten. Zodra de holten in instelaftasting de nanoporiën array voor een regio thten hoogste displays afdichtende verhouding.
   Opmerking: Elke geïnverteerde epifluorescentiemicroscoop kan worden gebruikt om chip assays. Afhankelijk van het doel vergroting (20X - 60X) het aantal getest holten variëren met tot 9000 gaatjes in één gezichtsveld gebruik 20X vergroting. Air doelstellingen met een lange werkafstand de voorkeur. Het gebruik van omgekeerde confocale laser scanning microscoop (CLSM) is ook mogelijk, maar beeldacquisitie kan de beperkende factor als gevolg van de beperkte diepte van de focus.
2. Optimaliseer de chip verlichting.
   Let op: Zorg ervoor dat beide kleurstof kanalen niet hoger zijn dan de maximale grijswaarde, de veranderingen niet kunnen worden waargenomen. Voor de export experimenten aan te passen verlichting van de translocatie kleurstof tot 90% van de maximale capaciteit van het signaal. Stel de controle kleurstof in de open holten tot 80-90% van de maximale signaal capaciteit om duidelijk te detecteren die lek membraan afdichting.
3. Wanneer alle kanalen zijn ingesteld start de tijdreeks. Neem beelden elke 10-20 seC gedurende 90 min.
   Opmerking: Dit is voldoende om ook te volgen specifieke en niet-specifieke efflux evenementen.
4. Initialiseer efflux van het fluorescerende substraat door toevoeging van cysteïne-specifieke, positief geladen verbinding MTSET tot een eindconcentratie van 3 mM. Tenminste 5 min experiment runtime voordat MTSET aanvulling kunnen een stabiele fluorescentiesignaal basislijn vóór opening kanaal later vaststelt. bereiden altijd MTSET oplossing verse direct voor gebruik.

8. Data Analysis

1. Open de time beeld-serie stapel met een standaard versie van ImageJ (File / Import / Image Sequence).
2. Als fluorescerende kanalen worden gestapeld, splitsen de kanalen in afzonderlijke stapels voor elk kanaal (Image / Stacks / Stack Images).
3. Dupliceren het eerste beeld van de translocatie substraat kanaal voor ROI (regio's van belang) identificatie (Image / Duplicate).
4. Converteren het beeld naar een binair beeld (Image / Aanpassen / Threshold). verzekerendat het gebruikte algoritme geeft signalen voor alle gesloten holten zonder overlapping pixilation.
5. regio's van belang met het deeltje Analyzer automatisch define (Analyze / Analyseer Particle). Definieer een minimale deeltjesgrootte gedefinieerd, om deeltjes ruis te voorkomen. Controleer de opties 'te sluiten op de randen "en" bevatten gaten ". Zorg ervoor dat de resulterende ROI weerspiegelen de microcavity matrix patroon. Tussenliggende ROI zijn artefacten, dus ze te verwijderen. Sla de ROI lijst.
   Opmerking: Meting parameter moet worden ingesteld op "ruimte" voor analyse van deeltjes (Analyseren / Set Metingen / Area)
6. Open de Time Series Analyzer plug-in (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/time-series.html), die alle ROI automatisch het formaat van dezelfde grootte. Re-size alle bestaande ROI tot een breedte / hoogte van 6x6 pixels en ovale vorm (Timer Serie Analyzer / AutoROIProperties). Vink de optie "Resize bestaande ROIS". Sla de resulterende ROI lijst aangepast.
7. Open de ROI manager(Analyseer / Tools / ROI Manager) en laad het aangepast ROI lijst voor elk kanaal van de tijdreeks (ROI Manger / Meer / Open). ROI wordt gesuperponeerd. Om het signaal verandering voor elke ROI analyseren start de Multi Measure gereedschap (ROI Manager / Meer / Multi Measure), selecteer "Maatregel alle segmenten" en "One rij per slice" en start de multi-maatregel.
   Opmerking: Meting parameter moet worden ingesteld op "betekenen grijswaarde 'voor deze stap (Analyseer / Set Metingen / Mean grijswaarde)
8. Sla de resulterende tabel, waardoor de gemiddelde grijswaarde voor elk ROI in * .txt of * .xls-indeling.
9. Importeer de ROI-analyse van elk imaging kanaal in NanoCalcFX via de optie 'Import File ". Stel "Gebruik eerste regel voor het benoemen serie". Stel de grootte stap tussen afbeeldingen op basis van de termijnen afbeelding serie acquisitie en kies de overeenkomstige kolom en decimaal teken.
10. Gebruik de optie 'multiple sheet "om automatisch te correleren de grafieken van de individuele fluorescent kanalen.
    Opmerking: De gebeurtenissen kunnen nu worden geanalyseerd en ingedeeld aan de hand van de informatie die door de 3-kleur spectrale informatie.
11. Fit geselecteerde krommen met behulp van de ingebouwde fit-functie (fit optie).
    Opmerking: De uitgevoerde uitstroom en instroom vergelijking is geschikt voor alle monoexponential basis van diffusie gebeurtenissen en geschikte grenzen kunnen worden ingesteld. Resulterende snelheidsconstanten kunnen worden uitgezet met behulp van het histogram gereedschap of geëxporteerd voor nadere gegevens verfijning.

Resultaten

-Pore spanning membranen kunnen eenvoudig worden gemaakt op de nanostructuur chip oppervlak in een zelf-geassembleerde manier. Maar het onderliggende proces is nog steeds delicaat en beïnvloed door vele parameters zoals liposoom omvang, monodispersiteit van het liposoom bevolking, lamellarity, lipide en zout-concentratie en chemische oppervlakte-eigenschappen. De meeste van deze parameters zijn zorgvuldig gekarakteriseerd en gestandaardiseerd in bovenstaande protocol. Andere parameters e...

Discussie

De techniek die hier kan een zeer parallelle analyse membraaneiwit transport. Gereconstitueerd membraaneiwit systemen kunnen direct worden aangebracht op de biochip, waardoor de aanpassing van theoretisch elke membraantransporter of kanaal mogelijk. Transport analyse wordt alleen beperkt door de oprichting van een tl-read-out systeem, hetzij via directe fluorescentie verandering (translocatie van fluoroforen of fluorescent gelabelde substraten) of indirecte fluorescentie change (pH-gevoelige kleurstoffen, secundaire enz...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagens
[2-(Trimethylammonium)ethyl] methaanthiosulfonaat	Toronto Research Chemicals Inc.	T792900	MTSET; gehydrolyseerd door water. Bewaar als droog poeder in porties bij -80 °C. Direct gebruiken (30 minuten) na oplossing in buffer.
1 ml gasdichte spuit	Hamilton	#1001
10 ml ronde fles	Schott Duran
2,7 mm glaskralen	Roth	N032.1
2-Propanol	Roth	9866.5
30 cm Luer-Lock verlengingsbuis	Sarstedt	744304
Aceton	Roth	5025.5
Bio-Beads SM-2 Adsorbens	Bio-Rad	152-3920	moet geactiveerd worden voor het eerste gebruik
CaCl2 Dihydraat	Roth	HN04.3
Calcein	Sigma	C0875	bewaar in het donker bij -20 °C
Chloroform reagent grade	VWR Chemicals	22711324
DOPEATTO390	ATTO-TEC	AD 390-165	bewaar in het donker bij -20 °C
Ethanol absoluut	Sigma-Aldrich	32205
Injekt eenmalige spuit	Braun	460 60 51V
Injekt-F eenmalige spuit	Braun	91 66 017V
Keck klemmen	Schott	KC29
L-α-Fosfatidylcholine, 20% (Soy)	Avanti Polar Lipids	5416016	bewaar onder inert gas bij -20 °C
NaCl 99,5% p.a.	Roth	3957.2
Nanopore E100 wafer/chips	Micromotive (Mainz/Germany)		beschikbaar op aanvraag
Nucleopore Track-Etch Membraan 0,4 µm	Whatman	800282
Oregon Green Dextran 488 (70 kDa)	life Technologies	D-7173	bewaar in het donker bij -20 °C
Oy647	Luminartis (Münster/Germany)	OY-647-T-1mg	bewaar in het donker bij -20 °C
Rotilabo-slangenfilter, onsteriel, poriegrootte 0,22 µm	Roth	P 818.1
Sephadex G-50	Sigma-Aldrich	G5080	kolom materiaal voor grootte-exclusiechromatografie
Silastic MDX4-4210	Dow Corning		uithardingsmiddel voor chipbevestiging op glasondersteuning
sticky-Slide 8-well	ibidi	80828	multi-well kamer voor de montage op glasplaten (chip houder)
Driewegkraan blauw	Sarstedt	744410001
Tris Pufferan 99,9% Ultra Quality	Roth	5429.2
Triton-X 100	Roth	6683.1
Whatman 0,2 µm cellulose nitraat membraanfilter	Roth	NH69.1
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Apparatuur
Büchi 461 waterbad	Büchi
Büchi Rotavapor RE 111	Büchi
Cary Eclipse Fluorescerende Spectrophotometer	Varian
LiposoFast Mini Extruder	Avestin
Membraanpomp	Vaccubrand	15430
Nanosight Nanoparticle Tracking Microscoop	Malvern / Nanosight	LM 14C
NyONE microscoop	Synentec		beschikbaar op aanvraag
Pompsturing	Vaccubrand	CVC 2II
Sonicator bad Sonorex RK100H	Brandelin electronic	31200001107477
Vacuumpomp RC5	Vaccubrand	1805400204
Waterbad W13	Haake	002-9910
Plasma Cleaner PDC-37G	Harrick Plasma	PDC-37G
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Software
ImageJ	Open Source	http://imagej.nih.gov/ij/	wetenschappelijke beeldverwerkingssoftware
NanoCalcFX	Freeware	http://sourceforge.net/projects/nanocalc/	gegevensanalyse-/evaluatiesoftware voor massieve transportkinetische datasets
NTA 2.3 Analytische Software	Nanosight		gegevensverwervings- en analysesoftware voor nanoparticle tracking microscoop
NTA 2.3 Temperatuur Comms	Nanosight		temperatuurcontrolesoftware voor nanoparticle tracking microscoop