Synthese van Keratine-gebaseerde Nanovezel voor Biomedische Technologie

Samenvatting

Electrospun nanovezels hebben een hoge oppervlak tot gewichtsverhouding, uitstekende mechanische integriteit gewicht en ondersteunen celgroei en proliferatie. Deze nanovezels hebben een breed scala van biomedische toepassingen. Hier fabriceren we keratine / PCL nanovezels, met behulp van de electrospinning techniek en karakteriseren van de vezels voor mogelijke toepassingen in de tissue engineering.

Samenvatting

Electrospinning, vanwege zijn veelzijdigheid en mogelijke toepassingen op diverse gebieden, wordt vaak gebruikt om nanovezels te fabriceren. De productie van deze poreuze nanovezels is van groot belang vanwege hun unieke fysisch-chemische eigenschappen. Hier werken wij de fabricage van keratine bevattende poly (ε-caprolacton) (PCL) nanovezels (dwz PCL / keratine composietvezel). Water oplosbare keratine werd eerst geëxtraheerd uit menselijk haar en gemengd met PCL in verschillende verhoudingen. De gemengde oplossing van PCL / keratine werd getransformeerd in nanofibrous membranen met behulp van een laboratorium ontworpen elektrospinproces opgezet. Vezelmorfologie en mechanische eigenschappen van de verkregen nanovezel waargenomen en gemeten met behulp van scanning elektronenmicroscopie en trekbank. Verder afbreekbaarheid en chemische eigenschappen van de nanovezel bestudeerd met FTIR. SEM beelden vertoonden uniform oppervlak morfologie PCL / keratinevezels van verschillende samenstellingen. De PCL / keratin vezels toonden ook uitstekende mechanische eigenschappen zoals modulus en faalpunt. Fibroblast cellen in staat waren om te bevestigen en te laten groeien en het blijkt een goede levensvatbaarheid van de cellen. Op basis van de kenmerken hierboven besproken, kunnen we stellen dat de sterk gemengde nanovezels van natuurlijke en synthetische polymeren een uitstekende ontwikkeling van composietmaterialen die kunnen gebruikt worden voor verschillende biomedische toepassingen kan vertegenwoordigen.

Inleiding

Electrospinning wordt erkend als een gangbare methode voor het bereiken polymeer nanovezels. De vezels kunnen worden geproduceerd op nanoschaal en de vezel eigenschappen kunnen worden aangepast ^1. Deze ontwikkelingen en de kenmerken van electrospun nanovezels zijn vooral interessant voor hun toepassingen in biomedische engineering geweest vooral in tissue engineering. De electrospun nanovezels bezitten overeenkomsten met de extracellulaire matrix en aldus bevorderen celhechting, migratie en proliferatie ^2. Vanwege de gelijkenis van de extracellulaire matrix (ECM), kunnen electrospun vezels worden gebruikt als materialen om te helpen bij wondverbanden, geneesmiddelafgifte en voor engineering weefsels zoals lever, bot, hart, spier en ^3.

Een grote verscheidenheid aan polymeren van synthetische en natuurlijke oorsprong zijn gebruikt om electrospun vezels voor verschillende biomedische toepassingen ⁴ maken. Onlangs er is gegroeid inlangstelling in de ontwikkeling van composiet nanovezels door het mengen van synthetische en natuurlijke polymeren ^4. In deze preparaten met name de eindproducten erven de mechanische sterkte in verband met het synthetisch polymeer, terwijl ook de vaststelling van biologische signalen en de eigenschappen van de natuurlijke polymeer.

In dit experiment, PCL en keratine worden als synthetische en natuurlijke polymeren worden toegepast voor de synthese van een samengestelde nanovezel. Keratine is een natuurlijk polymeer dat wordt gevonden in het haar, wol en nagels. Het bevat vele aminozuurresten; opmerkelijke belangstelling is cysteïne ^4,5. Idealiter een natuurlijk voorkomend polymeer zou biorenewable, biocompatibel en biologisch afbreekbaar zijn. Keratine bezit deze drie kenmerken tegelijkertijd verbeteren van celproliferatie en celhechting aan de biomaterialen het is in ⁶ opgenomen.

Polycaprolacton (PCL) is een resorbeerbaar synthetisch polymeer dat significanttissue engineering ^4. Dit polymeer is eerder geprezen voor de structurele en mechanische stabiliteit, maar het mist cel affiniteit en vertoont een lang afbraaksnelheid. De hydrofobe aard van PCL is waarschijnlijk verantwoordelijk voor het gebrek aan affiniteit ⁷ cel. Echter, PCL maakt voor de beperkingen door zich zeer mengbaar met andere polymeren. Een PCL / keratine composiet moet de mechanische eigenschappen van PCL te tonen en op te nemen van de biologische eigenschappen van keratine, waardoor het een ideale keuze voor verschillende biomedische toepassingen.

Protocol

Alle protocol volgt de richtlijnen van de North Carolina A & T State University Bureau voor Onderzoek Compliance and Ethics.

1. Chemische Voorbereiding voor Keratine Extraction ⁴

1. Ter voorbereiding 1000 ml 2% gew / vol oplossing van perazijnzuur (PAS), onder een afzuigkap voeg 20 ml perazijnzuur aan 980 ml gedeïoniseerd (DI) water.
2. Tot 1000 ml van 100 mM Tris-base-oplossing (TBS) te bereiden, voeg 12,2 g Tris Base tot 1000 ml DI water en roer tot volledig opgelost.
3. Bereid verdunde zoutzuuroplossing (DHAS) in een zuurkast door gieten 4 ml geconcentreerd zoutzuur in 30 ml DI water.
4. Procure ongeveer 20 g menselijk haar knipsels die niet chemisch zijn behandeld of gewijzigd. Haar kan elke lengte zijn.
5. Was het haar grondig, met de hand, met warm water en zeep. Gebruik gedeïoniseerd (DI) water voor de laatste spoeling.
6. Zet het haar in twee 600 ml bekers en plaats in een 80 ºC oven voor 1 uur.
7. Giet de vloeistof uit de bodem van het bekerglas en zet terug in de oven tot het haar volledig droog.
8. Verdeel droog haar gelijkmatig tussen de 600 ml bekers, het plaatsen van 10 g van haar in elke beker. Heeft het haar om meer dan 500 ml vullen niet toestaan.
9. Giet 500 ml PAS in elk bekerglas zorg ervoor dat alle haren te bedekken. Bedek de bekers met parafilm en op te slaan voor 12 uur.

2. Voorbereiding van de Keratine Extract Solution

1. Scheid het haar van PAS met een 500 urn zeef. Verzamel het afval PAS in een aparte container. Spoel het haar grondig met DI water om eventuele overgebleven PAS verwijderen.
2. Plaats de gespoeld haar in een 500 ml kolf. Schenk 400 ml TBS in de kolf, om ervoor te zorgen dat het haar bedekt is. Cuvette in een schudbad ingesteld op 38 * C, 65 rpm gedurende 1 uur.
3. Na 1 uur, te verwijderen uit het schudden bad en giet de vloeistof, ongeveer 400 ml van keratine extractie-oplossing (KES), into een 1000 ml beker.
4. Giet 400 ml DI water in de kolf die het haar verzekeren dat het haar is bedekt en terugplaatsen in de schudbad gedurende 1 uur. Neem de kolf uit het bad te schudden en giet de resterende 400 ml van de KES in de 1000 ml beker met de eerder verzamelde KES. Het haar is niet meer nodig en kan uit de fles worden gedumpt en weggegooid in de dichtstbijzijnde prullenbak bakje.

3. Concentratie van Keratine Extract Solution

1. Vul rotodistiller bad naar de bovenste regel met gedestilleerd water en ingesteld op 90 ºC. Stel rotatiesnelheid 200 rpm. Zet het koelmiddel chiller-pomp en ingesteld op -10 ºC.
2. Een pH-meter om de pH van de KES bewaken Gebruik een pipet 1 mM DHAS langzaam toevoegen KES, totdat de pH 7,0. Roer langzaam de oplossing wordt toegevoegd.
3. Giet het geneutraliseerde KES in de 500 ml rondbodemkolf tot ongeveer kwart gevuld. Voer de distilleerder volgens de fabrikantprotocol voor 1,25 uur.
   1. Herhaal stap 3,3 tot alle KES is gedistilleerd. Zorg ervoor dat de kolf stevig is aangesloten.

4. Dialyse van Keratine Extract Solution

1. Giet KES oplossing even in 12 afzonderlijke 14 ml conische buizen. Centrifugeer de buizen bij 1050 xg gedurende 10 min.
2. Giet de gecentrifugeerd KES in een schone beker, en zorg ervoor om weg te gieten van de verzamelde puin. Herhaal dit tot alle van de KES werd gecentrifugeerd.
3. Vul een 2000 ml maatcilinder met DI-water.
4. Snijd dialyseslang cellulose membraan 24 inch, en clip een uiteinde van de buis te houden sluiten.
5. Dompel de lengte van de buis in de cilinder DI water om het flexibeler en gemakkelijker te openen.
6. Open de niet-geknipt uiteinde van de dialysebuis cellulose membraan en giet langzaam 60 ml gecentrifugeerd KES oplossing in de slang. Met andere clip bij het uiteinde van de slang te sluiten.
7. Zet de dialysis buis in de 2.000 ml cilinder van DI water en laat het zitten voor 24 uur. Wijzig de DI water in de cilinder om de 3 tot 4 uur.
8. Na de 24 uur periode leeg de KES gedialyseerde oplossing in potten afgedekt, waarbij u ruimte bovenaan plaats laat in de vriezer bij -20 ° C gedurende 24 uur.

5. Vriesdrogen van Keratine Extract Solution

1. Stel de vriesdroger tot -86 ºC.
2. Verwijder de potten met bevroren KES uit de vriezer, neem de doppen off van de potten, en plaats ze in de vriesdroger ampullen. Plaats de zegels op de ampullen en draai de knop om een ​​vacuüm druk van 0,133 mbar te creëren. Lyofiliseren de monsters gedurende ongeveer 48 uur, totdat al het vocht is verdwenen.

6. Voorbereiding van Electrospinning Solutions (10 gew% Keratine Solution)

1. Verwijder de keratine poeder uit de vriesdroger en wegen.
2. Voeg gedeïoniseerd water aan de Keratine poeder tot een 10% gew / gew creërenKeratine oplossing.

7. Bereiding van 10% gew PCL Solution

1. Verkrijgen PCL (ε-caprolacton polymeer, Mn 70-90 kDa) en trifluorethanol (TFE). Bereid een 10% gew PCL in TFE door roeren O / N en een homogeen mengsel te verkrijgen.

8. Bereiding van Keratine / PCL Solution

1. Verkrijgen de 10 gew% PCL oplossing die vooraf was bereid en 10 gew% keratine oplossing. keratine toevoegen aan de PCL oplossing druppelsgewijs om 10 ml PCL / keratine oplossingen van 90:10, 80:20, 70:30 en 60:40 ratio creëren.
2. Gebruik een vortexer om een ​​homogeen mengsel van PCL / Keratine oplossing te verkrijgen voordat elektrospinning.

9. Productie van electrospun PCL / keratinevezel

1. Leg ongeveer 8 ml van de PCL / keratine oplossing in een 10 ml wegwerpspuit voorzien van een 0,5-mm kunststof buis. Plaats de spuit in een spuitpomp waarin de stroomsnelheid is ingesteld op 2,5 ml / uur.
2. Spanning aan de punt van de naald is verbonden met de buis (~ 23 cm geplaatst van de vezel oproltrommel en ~ 30 graden met de horizontaal). Breng een 19-22 kV spanning aan de buis en draai de collector trommel rond de 200 rpm.
   1. Wikkel de collector trommel met aluminiumfolie voordat u het monster. Zorg ervoor dat de aluminiumfolie stabiel is door toepassing van de etikettering tape aan beide zijden.
      Opmerking: De vezels worden op de aluminiumfolie vormen (zie figuur 2), slaan de vezel bedekte folie bij kamertemperatuur.

10. Mechanische Analyse van de PCL / Keratine Nanovezels

1. Snijd het monster in 60 mm bij 8 mm. Zorg ervoor dat de dikte opnemen door het gebruik van digitale micrometer. Voor elke samenstelling bereid, gebruikt vijf monsters.
2. Bevestig de 60 x 8 mm monster in de treksterkte tester. Gebruik een speciaal ontworpen preparaathouder om het monster te bevestigen. Sandwich van het monster tussen preparaathouders die is gemaakt van een index-kaart met behulp van dubbel-dubbelzijdige tape. Breng de 10 N belastingscel met een verplaatsingssnelheid van 10 mm / min.
   Noot: De monsterhouder werd ontworpen om 62 mm bij 40 mm met een inwendige raam van 50 mm bij 38 mm.
3. Record uitbreiding en load waarden door middel van software op basis van software-protocol.
4. Bereken stress door het verdelen van het geweld door deel van het onderzochte monster. Bereken vervolgens stam door de lengteverandering van aanvankelijke lengte snijdt.
5. Genereren van de spanning-rek kromme door het uitzetten van stress in y-as voor overeenkomstige spanningswaarde in de x-as.
6. Bereken de Young's modulus van het lineaire gebied waar de helling gelijk aan elasticiteitsmodulus. Bepaal treksterkte van de stress spanning plot door het nemen van 0,2% te compenseren in stam en het tekenen van een parallelle lijn aan de lineaire regio curve.
7. Voer de statistische analyse van de mechanische gegevens die zijn verkregen in drievoud eerder met behulp van one-way variantie-analyse met behulp van analysesoftware ^8. P-waarden <0,05 weopnieuw als statistisch significant.

11. Surface morfologie en structurele karakterisatie

1. Met scanning elektronenmicroscoop (SEM) met parameters van versnellingsspanning van 15 kV en stroom van 5 uA tot de morfologie van de vezels electrospun observeren.
   1. Voorafgaand aan de beeldvorming met SEM, snijd een 2 cm ^{2 sectie van} de vezel en bevestig deze aan een SEM stadium gebruik van koper tape. Plaats het podium in de sputter coater en jas met goud op 15 mA gedurende 1 minuut en 30 seconden naar een goudlaag ongeveer 11 nm dik te maken. Laad het monster in de kamer van de SEM. Let op de vezel monsters.
2. Gebruik Fourier transformatie infraroodspectroscopie (FTIR) om de chemische binding tussen de PCL- en keratine karakteriseren. Plaats de 2 cm ^{2 sectie van het} electrospun nanovezel membraan in een magnetische houder en het zuiveren van het systeem met droge lucht voor het testen. Verkrijgen spectra 200 scans en analyseren van de spectra met behulp standard software volgens softwareprotocol.
3. Uitvoeren spectrum analyse met behulp van standaard software gebruiken drievoud van elke verhouding nanovezels volgens het protocol van de fabrikant.

12. Onderzoek Cell-vezel Interactie

1. Snijd vezels tot 16 mm ² monsters. Gebruik van een biocompatibele, siliconen gebaseerde lijm aan elk monster dekglaasjes vast met een diameter van 12 mm.
2. Lijm ene uiteinde van de vezel monster op de achterkant van het dekglas, wikkel het monster rond dekglaasje, lijm dan het vrije uiteinde van het monster aan de achterkant van het dekglas ook, waardoor de bovenkant van de slip bedekt met alleen de fiber monster.
3. Plaats de vezel monsters in een 24-wells plaat. Steriliseer de monsters door onderdompeling in 80% ethanol gedurende 1 uur.
4. Spoel de ethanol uit de monsters met behulp van DI-water. Vervolgens pipet 2 ml basaal medium op de monsters, en zorg ervoor dat het gehele monster te dekken. Verwijder het medium na 5 min.
5. Gebruik fibroblast 3T3 cellen aan de vezel monsters zaad. Suspendeer de cellen in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met antibiotica en 10% foetaal runderserum (FBS), zodat er ongeveer 62.000 cellen / ^cm2 per 1 ml DMEM.
6. Drop 1 ml van de 3T3-cellen bevattende DMEM oplossing in elke well plaat zodat elk monster vezel bedekt is met ongeveer 62.000 cellen / ^cm2. Incubeer de platen goed voor 24 uur bij 37 ° C en _5% CO2. Opmerking: Gebruik 5% CO ₂ omdat dit niveau meestal handhaven van de pH van het celmedium in fysiologische bereik dagen.

13. Afbraak van Nanovezel Matrix

1. Cut gedroogde PCL / keratine nanovezel membranen in vierkante ongeveer 30 mm x 30 mm.
2. Steriliseer de 900 mm ² monsters met 80% alcohol voor een 10 minuten incubatieperiode en grondig wassen met DI water. Incubeer de monsters in 15 ml PBS, pH 7,5, bij 37 ° C. Vervang de buffer om de 3 dagen.
3. Neem de membranen uit de oplossing op bepaalde tijdstippen, 1 week en 7 weken en spoelen met DI water.
4. Plaats het membraan monsters in vriesdroger ampullen. Plaats de zegels op de ampullen en draai de knop om een ​​vacuüm te creëren. Lyofiliseren gedurende 24 uur, tot het volledig droog.
5. Bevestig de gedroogde monster naar een SEM stadium gebruik van koper tape. Plaats het podium in de sputter coater en jas met goud op 15 mA gedurende 1 min en 30 sec.
6. Laad het monster in de kamer van de SEM. Let op de vezel monsters bij een versnellend voltage van 1,5 kV en 5 uA stroom.

Resultaten

vezel morfologie
SEM beelden van de vezels werden verkregen voor de vezelsamenstelling. Zie figuur 3. Image Fiber bevestigt dat de vezels willekeurig zijn georiënteerd.

mechanische testen
Mechanisch sterke vezels zijn meestal nodig voor verscheidene toepassingen weefselmanipulatie. Deze vezels moeten voldoende sterkte en flexibiliteit onder bepaalde stre...

Discussie

Extractie van keratine van mensenhaar werd met succes bereikt. De perazijnzuur fungeerde als oxidatiemiddel op het menselijk haar, waardoor de keratine te extraheren door de Tris Base. De productie van keratine poeder werd kleinschalig door het feit dat het alleen gedaan voor onderzoeksdoeleinden. Deze procedure is reeds vastgesteld in de industrie voor grootschalige productie. Te onttrekken kleinschalige keratine was verontreiniging, batch variabiliteit en kosteneffectiviteit regelen.

Kerat...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Human Hair			Verkregen bij lokale kapper in Greensboro
Peracetic acid	Sigma Aldrich
PCL (e-caprolactone polymeer)	Sigma Aldrich	502-44-3	Mn 70-90 kDa
Trifluoroethanol (TFE)	Sigma Aldrich	75-89-8
Tris Base (TrizmaTM Base Powder)	Sigma Aldrich		>99,9% kristallijn
Hydrochloric Acid	Fischer Scientific	A144C-212 Lot 093601	Waltham, MA
Kwik-Sil	World Precision Instruments		Sarasota, FL
Cellulose membrane	Sigma Aldrich		12 - 14 kDa moleculaire afsnijding
optische microscoop	Olympus BX51M	BX51M	Japan
scanning elektronenmicroscoop	Hitachi SU8000	SU8000	Japan
Table-Top Shimadzu-machine	North America Analytical and Measuring Instruments AGS-X-serie	AGS-X-serie	Columbia, MD
Fourier-transformatie infraroodspectroscopie	Bruker Tensor 2-instrument		Billerica, MA
Microcal Origin-software			Northampton, MA
Röntgendiffractie (XRD)	Bruker AXS D8 Advance röntgendiffractometer		Madison, WI
Fibroblast 3T3  cel	American Tissue Type Culture Collection		Manassas, VA
Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM	Invitrogen		Grand Island, NY
Spectra max Gemini XPS microplaatlezer	Molecular Devices		Sunnyvale, CA
Student- Newman-Keuls post hoc-test	SigmaPlot 12-software