Primaire Sertoli cellen nodig zijn voor het bestuderen van testis-immune privilege, signaaltransductie tijdens ontsteking of infectie, en het gebruik van hun immunobeschermende eigenschappen. Hier beschrijven we een enzym-gebaseerd protocol voor de isolatie van zeer zuivere primaire Sertoli cellen en peritubulaire cellen van ratten testes.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van Sertoli cellen en peritubulaire Cellen van Rat Testikels
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De testis, en met name de mannelijke gameten, daagt het immuunsysteem op een unieke manier, omdat gedifferentieerd sperma eerst verschijnen op het moment van de puberteit - meer dan tien jaar na de oprichting van de systemische immunologische tolerantie. Spermatogenese cellen brengen een aantal eiwitten die kunnen worden beschouwd als niet-zelf door het immuunsysteem. De testis moet dan in staat zijn tolerantie vast te stellen die neo-antigenen enerzijds maar nog steeds in staat om zich tegen infecties en tumorontwikkeling anderzijds. Daarom is de testis is een van de weinige immune bevoorrechte plaatsen in het lichaam die vreemde antigenen tolereren zonder nadelig roepen inflammatoire immuunrespons. Sertoli cellen spelen een belangrijke rol voor het onderhoud van deze immuun bevoorrechte omgeving van de testis en ook de overleving van cotransplanted cellen te verlengen in een vreemde omgeving. Daarom primaire Sertoli cellen zijn een belangrijk instrument voor het bestuderen van het immuunsysteem voorrecht van de testis die niet kan worden easily vervangen door gevestigde cellijnen of andere cellulaire modellen. Hier presenteren we een gedetailleerde en uitgebreide protocol voor de isolatie van Sertoli cellen - en peritubulaire cellen indien gewenst - van rat testes binnen een enkele dag.
Inleiding
Testikels produceren mannelijke gameten en geslachtshormonen, dat wil zeggen, androgenen. Het orgaan bestaat uit twee compartimenten. In de interstitiële compartiment, dat vertegenwoordigt ongeveer 10-12% van de totale testis volume 1, steroidogenesis plaatsvindt binnen de Leydigcellen. De buisvormige compartiment vertegenwoordigt ongeveer 60-80% van de testiculaire volume 1 en bevat kiemcellen en twee typen somatische cellen - peritubulaire cellen en Sertoli-cellen. De testis wordt gedeeld door bindweefsel septa in 250-300 lobben, elk met 1-3 zeer ingewikkelde testes. Deze buisjes worden omsloten door een basaal membraan, een ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Animal Ethics Verklaring
De experimenten die hier beschreven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van het Regierungspräsidium Giessen, Duitsland, als de lokale overheid en bevestigen om het Duitse Code of Practice voor de zorg en het gebruik van dieren voor experimentele doeleinden (Toestemming nr.: GI 20/23 Nr A 31 / 2012).
2. Voorbereiding van de Media, Enzyme Solutions and Animals
- Bereid 1% jodium alcohol door het oplossen van 1 g jodium in 100 ml ethanol.
- Bereid 2x 500 ml Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder Ca2 + en Mg2 + aangevuld met elk 7,5 ml D-glucos....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De beschreven werkwijze maakt isolatie van ongeveer 12 x 10 7 Sertoli cellen uit 10 ratten testes. 3 x 10 6 cellen per putje op een plaat met 6 putjes zodat zes tot zeven 6-well platen zijn voor experimenten op dag 7. Het trypsine-digestie DNase I is de meest cruciale stap in Sertoli cell isolatie. Als digestie op dit punt te ver vordert, de verhouding van kiemcellen / Sertoli cellen disproportioneel verhogen tot het einde. Gedurende dag 3-6 van de cultuur is het be.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De zaadvormende tubuli worden begrensd door een cirkelvormige laag peritubulaire cellen en een basale laag aan de luminale zijde. Sertoli-cellen rusten op de basale laag, vormen de bloed-testisbarrière door het vormen van occluderende verbindingen tussen aangrenzende cellen en bieden het structurele raamwerk voor de organisatie van het zaadvormende epitheel. Sertoli-cellen en aangrenzende spermatogenese-cellen onderhouden intieme contacten gedurende de ontwikkeling van de kiemcellen, zowel voor fysiek contact als voor co.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag bedanken Guido Verhoeven en Ludo Deboel, Leuven, die was zeer behulpzaam bij het vaststellen van de isolatie van primaire Sertoli cellen in het lab Meinhardt in Giessen waren. Monika Fijak, Gießen, is erkend voor haar hulp met figuur 1A en advies. Studies werden ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft door middel van subsidie BH 93 / 1-1 (SB) en de financiering van het International Research Graduate College JLU Gießen (Duitsland) / Monash University (Melbourne, Australië) GRK 1871 (SB). Ondersteuning werd ook verkregen uit een subsidie van de staat van Hessen binnen het programma "Landes-Offensive zur Entwicklung wissenschaftl....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Actine (gladde spier) antilichaam klon 1A4 | Dako | M0851 | Monoklonaal muis anti menselijk antilichaam. Gebruik 1:100 verdunning voor immunofluorescentie. |
| Albumine bovien fraction V Standaard kwaliteit, gelyofiliseerd | Serva | 11930.04 | Filter (0.45 µm) BSA oplossingen gebruikt voor immunofluorescentie. |
| Corning Cell Strainers 70 µm | Corning | 431751 | Witte kleur |
| Collagenase A van Clostridium histolyticum | Roche | 10103586001 | |
| DAPI mountant ProLong Gold Antifade | Life technologies | P-36931 | |
| D-glucose | Sigma | G8644 | 100 g/L |
| Dulbecco´s PBS zonder Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14190-094 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Elektronenmicroscoop | Zeiss | EM 109S | |
| Fluorescentiemicroscoop | Zeiss | Axioplan 2 | |
| Hyaluronidase uit rundertesten | Sigma | H3506 | |
| Omgekeerde lichtmicroscoop | Olympus | CKX41 | Routine celkweekmicroscoop |
| Muis IgG / IgM (H+L) polyklonaal secundair Antilichaam | Life technologies | A-10684 | Alexa Fluor 488-conjugaat |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | Heeft Sudan III en Sudan IV vervangen vanwege helderdere kleur. |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Penicilline (5.000 U/ml)/ Streptomycine (5.000 µg/ml) | Gibco | 15070-063 | 100x oplossing |
| RPMI-1640 | Gibco | 21875-034 | Bevat 300 mg/L L-glutamine |
| Trypsine uit varkenspancreas | Sigma | T5266 | |
| Trypanblauwkleuring (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsine-remmer uit sojabonen | Sigma | T6522 | Het Sigma-product is aanzienlijk goedkoper dan de eerder gebruikte BPTI (Aprotinine) van Roche. |
| Vimentin antilichaam (V9) | Sigma | V6630 | Monoklonaal muis anti varkens vimentin antilichaam. Gebruik 1:100 verdunning voor immunofluorescentie. |
| Wistar WU ratten | Charles River | Zullen 19 dagen oud zijn op de dag van het experiment. |
Referenties
- Andrology. Male Reproductive Health and Dysfunction. Nieschlag, E., Behre, H., Nieschlag, S. , 3rd ed, Springer. (2010).
- Esaki, S. Über Kulturen des Hodengewebes der Säugetiere und über die Natur des interstitiellen Hodengewebes und der Zwischenzellen. Z. Mikros....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
