Hoge-resolutie Kwantificering van Geur-begeleide Gedrag in Drosophila melanogaster Met behulp van de Flywalk Paradigm

Summary

De automatische tracking systeem Flywalk wordt gebruikt voor hoge-resolutie kwantificering van geur-begeleide gedrag in Drosophila melanogaster.

Abstract

In hun natuurlijke omgeving, insecten zoals de azijn Drosophila melanogaster worden gebombardeerd met een enorme hoeveelheid chemisch verschillende geurstoffen. Om de zaak nog verder te compliceren, de gedetecteerd door het insect zenuwstelsel geuren zijn meestal niet enkel verbindingen, maar mengsels waarvan de samenstelling en de concentratie ratio's variëren. Dit leidt tot een bijna oneindig aantal verschillende olfactorische stimuli die moeten worden geëvalueerd door het zenuwstelsel.

Om te begrijpen welke aspecten van een geur stimulus zijn bepalend voor de evaluatie door de vlieg, is het daarom wenselijk om efficiënt te onderzoeken geur geleid gedrag ten opzichte van vele geurstoffen en geur mengsels. Om direct correleren gedrag neuronale activiteit, moet het gedrag worden gekwantificeerd in een vergelijkbare tijd en onder dezelfde voorwaarden als stimulans in neurofysiologische experimenten. Echter, veel momenteel gebruikt olfactorische bioassays in Drosophila neuroethology nogal speciaseerd, hetzij in de richting van de efficiëntie of naar resolutie.

Flywalk, een geautomatiseerde geur levering en tracking systeem, overbrugt de kloof tussen efficiëntie en resolutie. Zij maakt de bepaling van precies wanneer een geur packet stimuleerde vrijlopende vlieg en de animal's bepalen dynamische gedragsreactie.

Introduction

Het overkoepelende doel van een neuroethological onderzoek is om een ​​oorzakelijk verband tussen de activiteit staten van enkele neuronen of neuronale circuits en het gedrag van een organisme vast te stellen. Om dit doel te bereiken neuronale activiteit en het gedrag moeten worden gecontroleerd onder identieke stimulus omstandigheden en deze stimulans voorwaarden idealiter vergelijkbaar zijn met die van het zenuwstelsel onder de loep geëvolueerd om gevoel van te maken. Vooral als het gaat om gedragsverandering bioassays, hebben deze eisen in het verleden bewezen heel veeleisend in Drosophila melanogaster olfactorische neuroethology.

Eenmaal vrijgekomen uit de bron, geur pluimen snel breken in dunne filamenten met turbulente diffusie veroorzaakt door beweging van de lucht zijn de belangrijkste determinant van geur verdeling ^1. Dientengevolge, een insect navigeren naar een geurbron ervaart intermitterende stimulatie met geur pakketten afgewisseld met variabele intervallen van schone lucht. Beidewandelen en vliegende insecten - met inbegrip van Drosophila - is aangetoond dat deze regeling intermitterende stimulatie voor navigatie misbruiken door stijgende upwind op pluim ontmoeting en overwegend bewegende cross-wind in de afwezigheid van geuren ^2-5. Overwegende dat stimulatie procedures in fysiologische experimenten grotendeels lijken op die van een insect kunnen ervaren in de natuurlijke omgeving door ofwel het verstrekken van enkele trekjes van geuren afgewisseld met langere periodes van schone lucht of dynamische stimulatie sequenties ^6-11, veel gedragsproblemen bioassays gebruikt in Drosophila neuroethology zoals val assay , open veld arena's of T-doolhof vertrouwen op geur-hellingen ^12-15. Omdat geur hellingen per definitie variabele concentratie, afhankelijk van de afstand tot de geurbron een bepaald gedrag kan niet worden toegeschreven aan een nauwkeurige geurconcentratie via deze paradigma. Bovendien is de helling vaneen geur gradiënt kritisch afhangt van de fysisch-chemische eigenschappen van de geurstof. ^20, hetgeen kan leiden tot een verkeerde interpretatie ^- Een gradiënt van een zeer vluchtige verbinding zullen ondieper dan door een minder vluchtige verbinding en dus ook moeilijker te sporen om een organisme te vertrouwen op het meten concentratieverschillen in ruimte als de enige navigatiemiddel ¹⁶ zijn olfactorische preferenties name keuze assays. Dit effect is ook zeer schadelijk is bij het onderzoek naar gedrag naar geur mengsels, omdat het leidt tot verschillende mengselcomponent verhoudingen op elk punt in de ruimte en dus opnieuw verzet tegen een duidelijke correlatie tussen de fysiologie en gedrag.

Terwijl azijn vliegt de neiging te aggregeren op het vergisten van fruit, ze zijn solitair in hun navigatie richting voedselbronnen en ovipositie sites. Niettemin plaats testen van individuele dieren vele gedragsparadigma's gebruikt in Drosophila neuroethology onderzoekt de geur geleid gedrag van cohorten van vliegen en aantrekkingskracht wordt gescoord als de fractie van vliegen het kiezen van de geur over een controle stimulus. Deze cohort experimenten hebben in belangrijke mate bijgedragen aan het begrip van fly neuroethology en veel van de opmerkingen van het gebruik van hen kon in single-fly experimenten worden bevestigd. Er is echter waargenomen dat vliegt kan elke other's beslissing ²¹ beïnvloeden en in het uiterste geval de evaluatie van een geur kan overschakelen van onverschilligheid voor het vermijden, afhankelijk van de bevolkingsdichtheid ^22. Bovendien, de resultaten van dergelijke experimenten geven vaak slechts het eindpunt van een sequentie van gedrags- besluiten in plaats observeren wat vlieg doet terwijl het doet, hetgeen wenselijk is bij een poging om gedrag neuronale activiteit correleren. Deze vrij lage resolutie cohort experimenten worden in contrast met single-fly methoden met een hoge resolutie, zoals aangebonden vlucht arena's en loopbanden die het mogelijk makenvoor een directe observatie van gedragsreacties op het moment dat de stimulus wordt gepresenteerd ^20,23,24. Toch cohort experimenten zijn nog steeds populair, omdat ze zijn zeer efficiënt en bieden robuuste resultaten, zelfs bij relatief lage steekproefomvang omdat inter-individuele en inter-proces variabiliteit gedeeltelijk uitgemiddeld als gevolg van de observatie van de bevolking gedurende langere perioden. Terwijl vastgebonden vlucht en loopband verschaffen waarschijnlijk de gouden standaard betreffende stimulus en temporele resolutie, worden de arena gebruikt voor eenmalig dieren en derhalve tijdrovend te verkrijgen steekproef noodzakelijk maten voor statistische analyse. Verscheidene andere benaderingen zijn recentelijk ontwikkeld dat een efficiënte acquisitie van hoge-resolutie gedragsgegevens in combinatie met een goed gedefinieerde stimulus regeling mogelijk maken. Deze omvatten zonder toezicht 3D-volgen van meerdere azijn vliegen in een windtunnel in combinatie met een nauwkeurige 3D-model van de geur pluim ⁵ , het bijhouden van meerdere afzonderlijke vliegen in keuze kamers met luchtstromen geleverd aan beide zijden ^{25 en} de Flywalk paradigma ^26.

In Flywalk, zijn 15 individuele vliegen gelegen in kleine glazen buisjes en continu bewaakt door een overhead camera onder rood licht. Geuren worden toegevoegd aan een continue luchtstroom van 20 cm / sec en reis door de glazen buizen met een constante snelheid. De luchtstroom wordt bevochtigd door het door 250 ml flessen met gedestilleerd water (luchtbevochtigers) voordat de geur afgiftesysteem. De flies' posities worden opgeslagen in een vierkant gebied van belang (ROI) omvat de meeste van de lengte van de geur buizen (met uitzondering van de buitenranden van de buizen (ongeveer 5 mm aan elke kant) wanneer de vliegen niet kan bewegen verder omhoog of wind) rond de tijd van geur presentatie (figuur 1A, B). Fly identiteiten worden constant gehouden door het volgsysteem throughout het experiment op basis van de Y-posities (gebruikte glazen buis grenzen). Geur stimulering wordt bereikt met een multi-component stimulus inrichting waarbij het ​​voorleggen van maximaal 8 enkele geuren en alle mogelijke mengsels daarvan ^26,29 (Figuur 1B) mogelijk maakt. Tijdens een proef wordt bestuurd door een computer regelen van de geur afgiftesysteem en het verzamelen van temperatuur en vochtigheid informatie (computer 1, figuur 1C). Deze computer stuurt ook een datalogger (start / stop opname) op een tweede computer die continu tracks vliegen posities bij 20 frames per seconde (computer 2). Vliegen posities, geur klep staat (dwz tijd-punt van de klep opening), geur ID, ​​temperatuur en vochtigheid rond geur stimulatie cycli worden aangemeld bij de computer 2. Op deze manier informatie over de geur en vliegen posities worden gesynchroniseerd en geëxporteerd als CSV-bestanden die kunnen verder worden verwerkt en met behulp van aangepaste geschreven analyseroutines geanalyseerd. Omdathet hele systeem computergestuurd, zonder menselijke tussenkomst nodig tijdens een experimentele sessie.

Protocol

De bouw en de technische details van Flywalk zijn beschreven elders ²⁶ (in geval van problemen van de oprichting van deze set-up, nadere informatie kan worden verkregen bij MK). Hier richten we ons op gedetailleerde instructies over de afhandeling van het paradigma die zullen helpen om betrouwbare resultaten te verkrijgen.

1. Fly Handling

1. Achterste vliegt in lage tot gemiddelde dichtheid culturen aan voedsel medium ²⁷ onder een 12 uur: 12 uur licht: donker regime bij 23-25 ​​° C en 70% relatieve vochtigheid. Daartoe laat 20-30 nieuw opgedoken volwassen vliegen te reproduceren in een grote food flacon voor 1 week, dan gooi volwassen vliegen en wachten tot nakomelingen te ontstaan.
2. Verzamel 30-40 nieuw opgedoken (leeftijd <24 uur) volwassen vliegen en ouder ze op in een nieuwe flacon met voedsel medium ^{27 voor} 3-5 dagen.
3. Vierentwintig uur vóór de start van de gedragsexperiment: 30-40 Breng alle eerder verzamelde 3-5 d oud (zie 2.2) vliegt in nieuw vial met een vochtige rubber schuim stekker of een vochtige tissue papier met behulp van een aspirator.
   OPMERKING: Niet vliegen met behulp van CO ₂ verdoven.

2. Voorbereiding van de Flywalk Setup

1. Gebruik 250 ml flesjes als luchtbevochtigers. Vul luchtbevochtigers met 100 ml gedestilleerd water.
2. Bereid geur flacons.
   1. Bereid 500 pi 10 ^-3 verdunningen zuivere geuren ethylacetaat, ethyl butyraat, isopentylacetaat en 2,3-butaandion in oplosmiddel minerale olie.
   2. Bevestig twee kogels per geur flacon. Merk op dat terugslagkleppen zorgen voor uni-directional alleen luchtstroom. Daarom sluit terugslagkleppen op zodanige wijze dat de lucht de flacon kan invoeren aan de ene zijde en laat het aan de andere kant.
   3. Verwijder het deksel van een 200 pi PCR-reactiebuis. Pipetteer 100 ul van elke verdunning geur in een afzonderlijke reactiebuis en plaats de buizen in afzonderlijke flesjes geur. Ook bereiden een geur flesje met alleen het oplosmiddel minerale oil.
   4. Goed af, de geur flacons door het sluiten van hen met behulp van roestvrij staal pluggen en rubberen afdichtingen.
   5. Sluit de 5 geur flacons (4 bevat geuren en 1 minerale olie) om de geur afgiftesysteem. Zorg ervoor om ze te verbinden in de juiste stroomrichting. Een verkeerde aansluiting zal niet alleen het gevaar geplande experiment, maar kan ook verontreinigen het afgiftesysteem.
3. Controleer op lekkage door het afdichten van de uitlaat van de mengkamer van de stimulus apparaat. Zorg ervoor dat alle luchtstromen voordat de stimulus apparaat nu geleidelijk dalen tot nul. Zo niet, controleer op lekken die nu kunnen worden geïdentificeerd door het sissende geluid van de lucht het verlaten van het systeem.
4. Zorgvuldig overdragen 15 individuele vliegen tot 15 individuele glazen buizen met behulp van een aspirator en dicht glazen buizen aan beide zijden met behulp van de bijbehorende adapters.
   Let op: Omdat het systeem hermetisch wordt afgesloten voor een succesvolle experimenten, ervoor te zorgen dat adapters passen glazen buisjes straken er rekening mee dat glazen buizen tijdens deze stap kan breken. Zorg om verwondingen te voorkomen door het dragen van beschermende handschoenen en een veiligheidsbril.
5. Sluit de glazen buizen aan de Flywalk setup en vanaf hier op, wacht tenminste 15 minuten voor aanvang van het experiment te laten vliegen om wennen aan de nieuwe omgeving.
6. Na het bevestigen van glazen buizen: controleer de uitlezing van de downstream digitale flowmeters op computer 1 als de 16 luchtstromen na de glazen buizen toe te voegen aan de luchtstroom in het systeem. Kijk ook op de computer 1, indien de vochtigheid tussen 60% en 80%.
7. Ontwerp stimulus protocol besturen van de volgorde en timing van geur stimuli gepresenteerd aan de vliegen. Gelijktijdig krijgen bijvoorbeeld de beschreven gegevens, aanwezig 4 geuren en de controle (minerale olie) afzonderlijk en alle mogelijke ternaire en quaternaire mengsels van de geuren voor 40 keer per stuk. Stel pulsduur tot 500 msec in een interstimulus interval van 90 sec en willekeurig stimulus volgorde.
8. Schakel de light bron (LED-cluster; λ = 630). Zorg ervoor dat voldoende licht voor efficiënte tracking verschaffen zonder dat de temperatuur in de glazen buizen.
9. Opzetten van een gebied van belang van het volgsysteem door het slepen van een frame over het te bewaken gebied zodanig dat alle 15 glazen buisjes opgenomen en ongeveer 5 mm van de randen van de buizen worden uitgesloten.
10. Instellen 14 evenwijdige scheidingslijnen tussen individuele buizen in het volgsysteem door het veranderen van de Y-posities in het bijbehorende script individuele houden vliegt identificeerbaar gedurende het experiment. Zorg ervoor dat ze te positioneren zodanig dat er altijd een glazen buis tussen twee dergelijke scheidingslijnen, omdat slechts een vlieg worden bijgehouden tussen elk stel van twee lijnen.
11. Zorg ervoor dat cameraparameters op zodanige wijze dat op een betrouwbare manier vliegt bijgehouden gedurende de glazen buizen. Als vliegen verloren aan de randen van het gebied van belang, te verhogen helderheid of versterking van de tracking software. Vermijd mechanische trillingen van het volgsysteem. Volg het gebruik van commerciële software volgens het protocol van de fabrikant.
12. Begin experiment door het starten van de stimulus-protocol. Record flies' XY-coördinaten bij 20 fps (frames per seconde) en log in combinatie met de status geur klep in tekstbestanden.

3. Data Analysis

Opmerking: De volgende stappen van de gegevensanalyse worden geautomatiseerd met behulp van aangepaste geschreven routines geprogrammeerd R. Door deze stappen is cruciaal voor zinvolle resultaten Toch zal in een stap voor stap manier gepresenteerd krijgen. De ruwe gegevens van de analyse CSV-bestanden met gesynchroniseerde gegevens over geur klepstatus, aantal impulsen in het experiment en 15 fly x-posities in cm op een gemeenschappelijke tijdas één geur stimulatiecyclus. Aangepaste code voor data-analyse kan worden geleverd op aanvraag.

1. Open CSV-bestand, vinden de tijd-punt van de klep opening aangegeven door een chaNSE in de kolom die de status van de klep.
2. Bereken de lineaire functie van geur positie van de vorm
   f (t) = s * t + i
   waarin t de tijd in de stimuleringcyclus, s de windsnelheid (hier 20 cm / sec) en het snijpunt i kan worden berekend met de tijdpunt de geur komt de buizen op positie 0 (ventielopening Delay).
3. Vind het tijdstip waarop geur en vliegen x-positie kruisen voor elke vliegen en stel dit keer-punt op 0. Opmerking: Op deze manier vlieg posities zijn afgestemd op elk individual's ontmoeting met de geur.
4. Uitsluiten vliegen zitten aan de randen van de regio van belang.
5. Bereken snelheid van X-posities door het verdelen verplaatsing langs de x-as door het tijdsinterval (100 msec) en herhaal procedure voor elke stimulatiecyclus.
6. Om de time gangen verkrijgen zoals getoond in figuur 2E berekent gemiddelde snelheid tijdsverloop voor elke vliegen en geur en uit die de gemiddelde tijdsverloop van een bepaalde geur.
7. Om nettoverplaatsing verkrijgen zoals getoond in figuur 3C berekenen nettoverplaatsing binnen 4 seconden nadat de geur puls voor elke gebeurtenis het bijhouden en daarna de gemiddelde nettoverplaatsing per vlieg en geur.

4. Reiniging Procedure

1. Schone glazen buizen
   1. Verwijder vliegen en adapters van glazen buizen en genieten glazen buizen in wasmiddel.
   2. Spoel glazen buizen onder stromend gedestilleerd water en droog ze met behulp van perslucht.
   3. Heat glazen buizen bij 200 ° C gedurende 8 uur.
2. Clean Geur Delivery System
   1. Verwijder alle geur flacons en leidingen van de centrale mengkamer.
   2. Verwijder slang adapters van de mengkamer.
   3. Clean mengkamer door het te spoelen met het laboratorium reinigingsmiddel en oplosmiddelen (bijvoorbeeld ethanol, aceton). Voer de volgende stappen in het kader van het laboratorium motorkap.
   4. Droge mengkamer behulp van perslucht en verwarm bij 200 ° C gedurende 8 uur.
3. Schoon Geur Flesjes en keerkleppen
   1. Verwijder staal plug (teruggooi rubberen pakking) en keerkleppen van geur flacons en geniet van alle componenten in het laboratorium reinigingsmiddel.
   2. Ultrasone trillingen componenten in een ultrasoon bad en spoel ze af met gedestilleerd water.
   3. Reinig alle onderdelen behalve terugslagkleppen met ethanol en aceton. Voer de volgende stappen in het kader van het laboratorium motorkap.
   4. Droge componenten met behulp van perslucht en verwarm ze bij 200 ° C gedurende 8 uur.
   5. Clean terugslagkleppen aan de binnenzijde door spoelen ze met ethanol en aceton met een spuit (interessant stroomrichting). Voer de volgende stappen in het kader van het laboratorium motorkap dragen laboratorium bril. Omdat aceton aanvallen rubber onderdelen, direct droog terugslagkleppen door spoelen ze met perslucht.
   6. Verwijder overblijvende geuren door pulserende lucht door terugslagkleppen voor meerdere dagen. Gebruik een incubator bij 60 ° C en een 1 sec lucht op / 1 sec lucht uit regeling voor deze reiniging stap.

Results

Omdat vliegen zich vrij binnen de glazen buizen verdelen geur pulsen en de geur puls loopt door de glazen buizen met een constante snelheid vliegt ondervindt de geur op verschillende tijdstippen, afhankelijk van hun x-positie ten tijde van de stimulatie. Hierdoor worden de aanzetten van de wind trajecten opgeroepen door een 500 msec puls van een aantrekkelijke 10 ^-3 verdunning ethylacetaat vertraging van ongeveer 1 sec voor vliegen aan het einde van de wind glasbuizen vergeleken met die van vliegen zitten dic...

Discussion

Hoewel de Flywalk systeem lijkt eerder verfijnd op het eerste gezicht, een keer up and running is het eenvoudig te gebruiken en levert zeer robuuste resultaten. Om de consistentie van het geproduceerde de bioassay resultaten wijzen kan worden gezegd dat de representatieve resultaten hier opgegeven waarden werden bijna 2 jaar na een aantal van de in een eerdere studie ²⁹ met een gewijzigde opstelling met een nieuwe tracking software en lichtbron resultaten. Toch is de lokstof reacties zijn - ondanks de iets ho...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flywalk setup	Custom		details beschikbaar op aanvraag
stimulus device	Custom		details beschikbaar op aanvraag
LED cluster	Custom		details beschikbaar op aanvraag
HD Pro Webcam C920	Logitech, Lausanne, Zwitserland
2 Computers
Flywalk Reloaded v1.0 software	Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net)
Labview 11.0 software	National Instruments, Austin, TX
Standard fly food	Custom
Standard fly vials	Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Duitsland
Standard fly vials	Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Duitsland
aspirator	Custom
mineral oil	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)
odors	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)
200 µl PCR reaction tubes	Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Duitsland