Biomimetische materialen Bacteria-gastheer interacties karakteriseren

Samenvatting

Bacterieel hechting aan gasthercelten is een sleutelstap tijdens gastheerkolonisatie en infectie. Dit protocol beschrijft de generatie van polymeer-gekoppelde recombinante adhesines als biomimetische materialen die analyse van de bijdrage van individuele adhesines aan deze processen mogelijk maken, onafhankelijk van andere bacteriële factoren.

Samenvatting

Bacterieel hechting aan gasthercellen is een van de vroegste gebeurtenissen tijdens bacteriële kolonisatie van gastherissuen en dus een sleutelstap tijdens infectie. De biochemische en functionele karakterisering van adhesines die deze initiële bacteriën-gastheerinteracties mediëren, wordt vaak belemmerd door de aanwezigheid van andere bacteriële factoren, zoals celwandcomponenten of uitgescheiden moleculen, die interfereren met de analyse. Dit protocol beschrijft de productie en het gebruik van biomimetische materialen, bestaande uit zuivere recombinante adhesines chemisch gekoppeld aan commercieel verkrijgbare, functioneel gemodificeerde polystyreenkralen, die met succes zijn gebruikt om de biochemische en functionele interacties tussen individuele bacteriële adhesines en gastheercelreceptoren te ontcijferen. Protocollen voor verschillende koppelchemieën, die directionele immobilisatie van recombinante adhesines op polymeerschalen mogelijk maken, en voor evaluatie van de koppelefficiëntie van de resulterende “bacteriomimetische” materialen worden ook besproken. We beschrijven verder hoe deze materialen kunnen worden gebruikt als een hulpmiddel om door pathogenen gemedieerde cytotoxiciteit te remmen en bespreken het bereik, de beperkingen en verdere toepassingen van deze benadering bij het bestuderen van bacteriële - gastheerinteracties.

Inleiding

Het ontleden van de interacties tussen bacteriële adhesines en gastheeroppervlaktereceptoren aan het gastheer-pathogeen-interface is een essentiële stap naar ons begrip van de onderliggende mechanismen die bacteriële adhesie aansturen. Uiteindelijk zal dit ons helpen om strategieën te identificeren om deze processen tijdens infecties te verstoren. Bij het uitvoeren van dergelijke studies worden we vaak geconfronteerd met een dilemma: biochemische en biofysische analyse van de moleculaire mechanismen van adhesine-binding vereist hun scheiding van andere celwandcomponenten, die interfereren kunnen met adhesie-evenementen. Aan de andere kant vereenvoudigt het gebruik van recombinante oplosbare eiwitten het adhesie-evenement, doordat het ankering van eiwitten in de bacteriële celwand en de multivalentie van binding die wordt bereikt door bacterieel oppervlaktedisplay wordt genegeerd. Evenzo heeft vanuit het perspectief van de gastheercel het aantreffen en binden aan enkele adhesine-moleculen niet altijd dezelfde impact op de organisatie van het plasmamembraan, membraanvloeibaarheid en receptorclustering¹ en dit maakt het uiteindelijk moeilijk om de impact van adhesie op gastheercellulair signaal en het resultaat van bacterie-gastheerinteracties te evalueren.

Recent werd een methode ontworpen waarbij recombinante gezuiverde adhesines of adhesinefragmenten richtingsgebonden en covalent gekoppeld worden aan polymeerdeeltjes die qua grootte vergelijkbaar zijn met bacteriën, waardoor bacterieel oppervlaktedisplay wordt nagebootst. Deze aanpak is gebruikt op een reeks verschillende adhesines, van Gram-negatieve Multivalente Adhesiemoleculen (MAM's)^{2, 3}, tot Gram-positieve adhesines inclusief Staphylococcus aureus fibronectine-bindend eiwit (FnBPA)^{4, 5} en Streptococcus pyogenes F1 ^{6, 7}. Deze methode heeft het mogelijk gemaakt om adhesinefragmenten die belangrijk zijn voor gastheercelbinding te ontleden, gastheeroppervlaktereceptoren te identificeren en hun gedrag op het gastheerceloppervlak te bepalen, waarbij zowel bindingsaffiniteit als aviditeit in overweging worden genomen ^{1, 8}. Bovendien is deze aanpak gebruikt om de werkzaamheid van geïmmobiliseerde adhesines en derivaten als remmers van gastheer-pathogeeninteracties te onderzoeken ^{8, 9}. Het is aangetoond dat oppervlaktegekoppelde derivaten van de Vibrio parahaemolyticus Multivalente Adhesiemolecuul (MAM) 7 kunnen worden gebruikt om een reeks bacteriële infecties in vitro te verminderen, inclusief die veroorzaakt door multidrug-resistente pathogenen zoals Acinetobacter baumannii en methicilline-resistente S. aureus (MRSA) ^{7, 9}.

Hier beschrijven we verschillende chemieën die kunnen worden gebruikt om adhesines te immobiliseren op commercieel verkrijgbare gefunctionaliseerde polystyreen-deeltjes. Vanwege de brede waaier van beschikbare oppervlaktefunctionaliteiten, labels en deeltjesgroottes, zijn deze een nuttig scaffol voor de productie van bacteriemimetische materialen om adhesine-gastheerinteracties te onderzoeken. Verder beschrijven we methoden voor de initiële karakterisering van de koppelingsreactie en voor de berekening van belangrijke eigenschappen van de resulterende materialen. Ten slotte wordt het gebruik van parelkeppelings-adhesines als competitieve remmers van in vitro bacteriële infecties besproken als een voorbeeld van hun toepassing, evenals de toekomstige reikwijdte en beperkingen van deze aanpak.

Protocol

1. Chemische koppeling van eiwitten aan polymeerpareltjes

1. Thiol-amine richtkoppel
   Opmerking: Dit protocol is geschikt voor het koppelen van cysteine-bevattende eiwitten om amine-gefunctionaliseerde polymeerkralen met behulp sulfosuccinimidyl 4- (p -maleimidophenyl) butyraat (sulfo-SMPB) als verknopingsmiddel (figuur 1).
   
   Figuur 1. Verknoping strategie voor directionele thiol-amine koppeling van eiwitten aan polymeerpareltjes. Amine-gemodificeerd polystyreen korrels worden geactiveerd met Sulfo-SMPB. De maleïmide reageert met vrije cysteines te koppelen eiwitten directioneel aan kralen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
   1. Bereiding van reagentia:
      1. Bereid PBS (100 mM natriumfosfaat, 150 mM NaCl, pH 7,0) en autoclaaf.
      2. Bereid een 100x stock (0,5 M of 287 mg / ml in PBS) van TCEP (tris (2-carboxyethyl) fosfine) onmiddellijk voor gebruik.
      3. Bereid een 5x voorraad (10 mM en 4,58 mg / ml in dH ₂ O) van Sulfo-SMPB onmiddellijk voor gebruik.
      4. Bereid een 10x voorraad (500 mM of 88 mg / ml in PBS, pH 7,0) van cysteïne onmiddellijk voor gebruik.
   2. Kraal activering:
      1. Meng de parelsuspensie door voorzichtig omkeren en breng de vereiste hoeveelheid kralensuspensie (bijvoorbeeld 12 ml) in een steriele 1,5 ml buis die 1 ml steriel PBS, pH 7,0.
      2. Voorzichtig pipet op en neer naar de kralen en pellet wassen door centrifugeren in een microcentrifuge (2 min bij 16.000 xg).
      3. Verwijder de bovenstaande vloeistof met een pipet en gooi zorgvuldig. Resuspendeer de pellet in bead 1 ml verse steriele PBS en herhaal de wasstap. Resuspendeer de pellet in 0,8 kraal ml PBS.
      4. Voeg 200 ml vers bereide 10 mM sulfo-SMPB tot een uiteindelijke concent gevenrantsoen van 2 mM.
      5. Incubeer de kraal suspensie 1 uur bij 25 ° C op een roterend wiel.
   3. Eiwit reductie:
      1. Tijdens de incubatietijd van de activeringsstap, bereidt het eiwit de volgende koppelingsstap zodat deze direct kan worden toegevoegd aan de geactiveerde korrels.
         Noot: Hoewel reductiestap is niet altijd vereist voor GST (glutathion S-transferase) fusie-eiwitten, is het raadzaam om een ​​hoog koppeling efficiëntie.
         1. Controleer de eiwitconcentratie, en aanpassen aan de uiteindelijke concentratie die nodig is voor de koppelingsreactie. Opmerking: 6 mM eiwit in PBS en een volume van 1 ml worden gewoonlijk gebruikt.
         2. Voeg TCEP voorraad tot een uiteindelijke concentratie van 5 mM. Incubeer de oplossing gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
            Opmerking: Het reactiemengsel kan direct worden gebruikt voor de volgende koppelingsreactie.
         3. Bewaar een kleine hoeveelheid (enkele ml) van de eiwitoplossing te bepalen welke pro eiwit concentratie en de berekening van de koppeling efficiëntie (zie punt 2).
   4. Eiwit koppelingsstap:
      1. Pellet de geactiveerde kralen door centrifugering (2 min, 16.000 xg in een microcentrifuge) en was de pellet één keer in 1 ml verse steriele PBS.
      2. Resuspendeer de pellet in de bereide eiwitoplossing (bijvoorbeeld 1 ml) om de gewenste eiwitconcentratie geven.
         Opmerking: De proteïneconcentratie tijdens de koppelingsstap is afhankelijk van de gemiddelde koppelrendement (zie hoofdstuk 2 voor bepaling van de koppelingsefficiëntie) en de gewenste koppeling dichtheid (zoals berekend 1.1.4.3). Het rendement is ongeveer 85% en de gewenste eindconcentratie 5 mM in 10x kralensuspensie, zodat proteïneconcentratie tijdens de koppelingsstap moet ongeveer 6 mM.
      3. Bereken de dichtheid koppeling met de volgende formule:
         jpg "/> waarbij
         ρ _c koppeling dichtheid [aantal eiwitmoleculen / nm ^2],
         eiwit conc proteïneconcentratie [mg / ml],
         eiwit _Mw eiwit moleculair gewicht [Da]
         kraal conc kraal concentratie [aantal kralen / L]
         d kraal diameter [nm ^2]
         Getal van Avogadro
      4. Met de koppeling dichtheid gemiddelde ligand afstand te berekenen:
         
      5. Incubeer de eiwit-bead suspensie 2 uur bij 25 ° C op een roterend wiel.
         Opmerking: Sommigeeiwitten niet stabiel bij kamertemperatuur. In deze gevallen kan de reactie worden uitgevoerd bij 4 ° CO / N uitgevoerd.
      6. Deactiveren resterende geactiveerde groepen op de parels door het toevoegen van cysteine ​​voorraad tot een uiteindelijke concentratie van 50 mM en incubeer de suspensie gedurende 30 min bij 25 ° C op een roterend wiel. Pellet de kralen door centrifugering (2 min, 16.000 xg in een microcentrifuge).
      7. Houd de bovenstaande vloeistof voor de bepaling van de eiwitconcentratie en de berekening van de koppeling efficiëntie (zie punt 2).
      8. Was de kraal pellet tweemaal met 1 ml PBS en resuspendeer in 1 ml verse PBS aan het eindproduct.
         Opmerking: De bovenstaande protocol kenmerkend geeft 1 ml proteïne gekoppelde, bij een eindconcentratie van 5 mM eiwit, dat kan worden gebruikt als een 10x voorraad voor volgende experimenten (zie sectie 3).
      9. Om door te gaan naar deel 3 van het protocol, met 100 ml / ml van de kraal voorraad, of bij een uiteindelijke concentratie van 500 nM eiwit. Opmerking: Een goed uitgangspunt voor deze procedure wordt 2 x 10 ¹² parels / ml, resulterend in een gemiddelde koppeling dichtheid van 3 x 10 ^-4 proteïnen / ² nm of een gemiddelde afstand van 57 nm op een kraal van 2 mm diameter.
2. Thiol-carboxy richtkoppel
   Opmerking: Dit protocol is geschikt voor het koppelen van cysteine-bevattende eiwitten te carboxyl gefunctionaliseerd polystyreen korrels. De carboxylgroep wordt eerst geactiveerd met 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) / N-hydroxysuccinimide (NHS), amine gemodificeerd en vervolgens verknoopt via sulfo-SMPB (figuur 2).
   
   Figuur 2. Cross-linking strategie voor directionele thiol-carboxyl koppeling van eiwitten aan polymeerpareltjes. Gecarboxyleerde polystyreen korrels worden eerst geactiveerd met EDC en NHS gemodificeerd met een semi-stabiele NHS-ester. Daaropvolgende amine-koppeling van ethylenediamine resulteert in een vrije aminegroep, die reageert met Sulfo-SMPB. Maleïmide geactiveerde kralen kan vervolgens reageren met vrije cysteines te koppelen eiwitten directioneel aan kralen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
   1. Bereiding van reagentia:
      1. Bereid PBS (100 mM natriumfosfaat, 150 mM NaCl, pH 7,0) en autoclaaf.
      2. Bereid een 100x stock (0,5 M of 287 mg / ml in PBS) van TCEP onmiddellijk voor gebruik.
      3. Bereid een 10x voorraad (20 mM, of 4 mg / ml in PBS) EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) onmiddellijk voor gebruik.
      4. Bereid een 10x voorraad (50 mM, of 6 mg / ml in PBS) NHS (N-hydroxysuccinimide) onmiddellijk voor gebruik.
      5. Bereid een 5x voorraad (10 mM en 4,58 mg / ml in dH ₂ O) van Sulfo-SMPB onmiddellijk voor gebruik.
      6. Bereid een 10x voorraad (500 mM of 88 mg / ml in PBS, pH 7,0) van cysteïne onmiddellijk before gebruik.
   2. Kraal activering:
      1. Meng kralensuspensie door voorzichtig omkeren en breng de vereiste hoeveelheid kralensuspensie (bijvoorbeeld 12 ml) in een steriele 1,5 ml buis die 1 ml steriel PBS, pH 7,0.
      2. Voorzichtig pipet op en neer naar de kralen en pellet wassen door centrifugeren in een microcentrifuge (2 min bij 16.000 xg).
      3. Verwijder de bovenstaande vloeistof met een pipet en gooi zorgvuldig.
      4. Resuspendeer de pellet in bead 1 ml verse steriele PBS en herhaal de wasstap.
      5. Resuspendeer de pellet in 0,8 kraal ml PBS.
      6. Voeg 100 ml van 10x EDC voorraad (2 mM uiteindelijke concentratie) en onmiddellijk 100 ml 10x NHS voorraad-oplossing (5 mM uiteindelijke concentratie) naar de kraal schorsing.
      7. Incubeer de parelsuspensie gedurende 30 min bij 25 ° C op een roterend wiel.
      8. Was korrels eenmaal in 1 ml PBS en resuspendeer in 0,8 ml vers steriel PBS.
      9. Voeg 200 ml ethyleendiamine, en meerderUbate de kraal suspensie 1 uur bij 25 ° C op een roterend wiel.
      10. Was parels eenmaal met 1 ml PBS en resuspendeer de kralen in 0,8 ml vers PBS.
      11. Gaan van punt 1.1.2.4 (kraal activering met Sulfo-SMPB) zoals beschreven in paragraaf 1.1.2 en volg de rest van de in paragraaf 1.1 (thiol-amine-directionele koppeling) beschreven protocol. Voeren eiwit voorbereiding en eiwitkoppeling stappen op een wijze identiek aan die in paragraaf 1.1 beschreven.
          Opmerking: De typische koppelrendement met dit protocol iets lager in vergelijking met sectie 1.1, dus de aanvankelijke eiwitconcentratie te passen om dezelfde koppeling dichtheid te bereiken (circa 75%.).

2. Bepaling van koppelingsefficiëntie

Opmerking: Om eiwitconcentratie te bepalen, gebruiken Bradford reagens ¹⁰ en colorimetrische assays als volgt:

1. Voorzichtig omkeren Bradford reagens naar e NSure homogeniteit van het reagens.
2. Met behulp van een 10 mg / ml BSA voorraadoplossing bereiden eiwitstandaarden die concentraties van 0,1 tot 1,5 mg / ml BSA in buffer.
3. Voeg 250 ml van Bradford reagens aan putjes van een 96-wells plaat. Bereid genoeg putten voor alle monsters, eiwit standaarden en negatieve controles (alleen buffer).
4. Voeg 5 ml eiwitmonster (eiwitstandaarden of buffer, de negatieve controle) aan het reagens in de 96-well plaat.
5. Incubeer de plaat op een orbitale schudder bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
6. Meet de absorptie bij 595 nm met behulp van een plaat lezer.
7. Genereren van een standaard curve van BSA concentratie versus A595 nm en dit gebruiken om eiwit-concentraties bepalen in de initiële en supernatant monsters.
8. Bereken de concentratie van proteïne gekoppelde als volgt:
   
9. Bereken de koppeling efficiëntie:
   00eq4.jpg "/>

3. Gebruik van Bead-gekoppelde adhesinen in competitietesten

1. Voorbereiding:
   1. Seed 1 ml per putje van Hela cellen bij een concentratie van 150.000 cellen / ml in een 24-wells plaat de dag voor de competitieve test, zodat de cellen ongeveer 80% confluentie bereiken vóór het begin van het experiment.
   2. Het opzetten van elke experimentele conditie in drievoud. Onder meer putten voor negatieve controles (geen bacteriën toegevoegd tijdens concurrentie assays), positieve controles (controle kralen gekoppeld aan fusion-tag alleen toegevoegd tijdens concurrentie assays) en lysis controles (voor cytotoxiciteit experimenten).
   3. Inoculeer 5 ml marine LB (MLB) cultuur met een verse kolonie van V. parahaemolyticus en te groeien O / N bij 30 ° C, schudden.
   4. Bereid voldoende kraal gekoppeld MAM, zoals beschreven in hoofdstuk 1 (koppeling). Zorg voor 100 ml van 10x kraal voorraad per putje.
2. Competitietest:
   1. Op de dag van de competition experiment, het meten van de OD _{600 van de} bacteriecultuur.
   2. Bereid infectie media door verdunning bacterieculturen in kleurloze DMEM zonder toevoegingen, voorverwarmd tot 37 ° C, bevattende 10% v / v kralensuspensie (hetzij adhesine-gekoppelde of controle korrels), een MOI van 10. bereiden 1 ml geven / goed en 10-20% overmaat volume per monster. Opmerking: Om de hierboven vermelde voorwaarden (24-well plaat, V. parahaemolyticus, MOI 10), de nodige volume O / N kweek wordt toegevoegd per putje (ml / ml) wordt berekend als 3 / OD ₆₀₀ van de kweek. Zo wordt 1 ml van infectiemedium bevatten typisch 100 ml kralensuspensie, enkele ml bacteriekweek en worden aan 1 ml met kleurloze, niet aangevulde DMEM.
   3. Verwijder oude medium uit de putjes en spoel gekweekte HeLa cellen door toevoeging van 1 ml steriel PBS voorverwarmd tot 37 ° C aan elk putje.
   4. Verwijder PBS en voeg 1 ml van de infectie medium per well. Ook het opzetten van de controles, door het toevoegen van oplossingen containing controlekorrels en bacteriën (positieve controle) of adhesine kralen en geen bacteriën (negatieve controles) of DMEM met 0,1% Triton X-100 (lysis control, alleen nodig voor cytotoxiciteit metingen).
   5. Incubeer de plaat in een weefselkweek incubator bij 37 ° C voor de gewenste tijdsduur (bijvoorbeeld 4 uur op cytotoxiciteit metingen of 1 uur voor hechting metingen).
      Opmerking: Zowel bacteriële hechting en cytotoxiciteit op gastheercellen kunnen worden gebruikt als read-outs voor de effectiviteit van remming. Wanneer de tijdstippen van cytotoxiciteit en adhesie afmetingen samenvallen, kunnen beide testen worden uitgevoerd met monsters van dezelfde put, aangezien cytotoxiciteit wordt bepaald volgens de kweeksupernatant en hechting assays monsters afkomstig uit het resterende cellaag.
3. Cytotoxiciteit metingen:
   1. Bij bepaalde tijdstippen (bv 4 uur na infectie), verwijder drie keer 200 ml van elke 24-well en transfer naareen 96-wells plaat.
   2. Spin 96-well platen bij 1500 xg, 5 min en overdracht 100 ml van elk putje in een verse 96-well plaat. Voeg 100 ml van het medium tijdens Infectieproeven verse putjes van de 96-well plaat in drievoud (deze worden gebruikt als blanco's).
   3. Voer de lactaat dehydrogenase (LDH) afgifte assay met een LDH cytotoxiciteit detectiekit en de instructies van de fabrikant.
      1. Kort Bereken de hoeveelheid reagentia die nodig in stappen van 25 (bijvoorbeeld als 62 monsters te meten, maakt genoeg reagens mix voor 75 enzovoort).
      2. Bijvoorbeeld, voor 100 monsters, meng 11,25 ml reagens A met 250 ul reagens B. omkeren, niet vortex schuimvorming te voorkomen.
      3. Doe het mengsel in een reservoir te kunnen pipet met meerdere kanalen pipet. Voeg 100 ul reagens mengsel aan elk monster.
      4. Incubeer plaat bij kamertemperatuur en lees absorptie bij 490 nm op een plaatlezer bij 10, 20, 30 min.
      5. Analyseer de gegevensset waarbij de absorptie van de lysis controlemonster is hoog, maar nog steeds binnen het lineaire bereik van de plaatlezer (typisch 2-3 absorptie-eenheden).
      6. Express resultaten% cytotoxiciteit, volgens de formule voor de conversie:
         
4. Meting van de bacteriële hechting:
   1. Bij bepaalde tijdstippen (bijvoorbeeld 1 uur na infectie), verwijder media uit de cel laag.
   2. Grondig de cellaag met steriel, voorverwarmd PBS (minstens 3-4 wasbeurten van 1 ml PBS elk) aan een niet-aangesloten cellen te verwijderen.
   3. Lyse gastheercellen door toevoeging van 1 ml van een steriele 1% v / v Triton X-100-oplossing in PBS per well. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 5 min.
   4. Pipetteer elk monster en neer meerdere malen alvorens de inhoud van elk putje met 1,5 ml buisjes scheiden. Bereid 10-voudige seriële verdunningen van monstersin steriele PBS (bv gebruiken 100 ml monster en 900 ml PBS).
   5. Plaat 100 ml van elk monster op MLB agar en verspreiden met behulp van een cel spreader. Optimaliseren die verdunningen aan plaat afhankelijk van de bacteriestammen en tijdstip. Opmerking: Voor de beschreven experimentele opstelling, 10 ⁵ of 10 ^6-voudige verdunningen geven een geschikt aantal CFU's.
   6. Incubeer de platen bij 37 ° CO / N en sommen bacteriën door kolonie telling.

Resultaten

De V. parahaemolyticus adhesin MAM7 bevat zeven tandem zoogdiercellijnen binnenkomst (MCE) domeinen betrokken bij de erkenning van gastheer oppervlak receptoren. We gebruikten polystyreen korrels gekoppelde recombinante gezuiverde fragmenten omvat ofwel zeven tandem MCE domeinen (MAM7) of alleen de eerste MCE domein (MAM1) om het vermogen van deze materialen om te concurreren met V. testen parahaemolyticus gastheer voor celbinding en de resulterende werkzaamheid van deze stoffen hechting remmers. Hela-cellen werden geïnfecteerd met V. parahaemolyticus stam POR1 en cytotoxiciteit gevolg van in vitro infectie geëvalueerd na 4 uur (figuur 3). Behandeling van Hela cellen met 0,1% Triton X-100 (positieve lysiscontrole) resulteerde in volledige cellysis, ongeïnfecteerde cellen weergegeven zeer lage niveaus van cytotoxiciteit. In vitro infectie van onbehandelde cellen met POR1 resulteerde in zeer hoge cellyse en dit werd geremd door MAM7-coupled beads maar niet MAM1-gekoppelde of GST-gekoppelde controlekorrels (figuur 3).

Figuur 3. Karakterisering van Vibrio parahaemolyticus geïnduceerde cytotoxiciteit in epitheliale cellen tijdens concurrentie assays. Cellen werden behandeld met V. parahaemolyticus (Vp), aangeduid met (+) of geen bacteriën (-) in de aanwezigheid van verschillende concurrerende entiteiten (comp.) zoals aangegeven. Deze omvatten ofwel geen comp. (-), MAM7 beads (MAM7), MAM1 beads (MAM1) of GST controlekorrels (GST). Als controles werden cellen behandeld ofwel met Triton X-100 (triton, lysiscontrole) of linker-geïnfecteerde (uninf). LDH-afgifte na 4 uur werd gemeten zoals beschreven in hoofdstuk 3, en de resultaten genormaliseerd naar Triton controles (100%) en blanco's (0%), zoals hierboven beschreven. De resultaten zijn gemiddelden ± SEM van drievoudige experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Opsomming van V. parahaemolyticus gevoegd bij onbehandelde HeLa-cellen, of cellen geïncubeerd met MAM7-, MAM1- of GST controlekorrels, bleek dat MAM7-korrels maar niet MAM1- of GST controlekorrels outcompete V. parahaemolyticus voor bevestiging aan celoppervlakreceptoren (figuur 4) te ontvangen.

Figuur 4. Karakterisatie van bacteriële hechting in competitie-experimenten. HeLa-cellen werden geïnfecteerd met V. parahaemolyticus POR2 (Vp +), in afwezigheid (-) of aanwezigheid van concurrerende entiteiten als volgt: MAM7 beads (MAM7), MAM1 beads (MAM1) of GST controlekorrels (GST) (comp.). Bacteriële hechting werd gemeten na 1 uur, zoals beschreven in paragraaf 3. De resultaten zijn gemiddelden ± SEM van drievoudige experimenten. Middelen (vlnr in CFU / ml) zijn 2,3010 ^6, 1,5310 ^{5, 6} 2,0510, 2,1210 ^6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Adhesinen gekoppeld met fluorofoor gemerkte korrels resulteren in de vorming van materialen die bacteriële hechting aan gastheercellen nabootsen en zijn krachtige instrumenten voor cellulaire beeldvorming (figuur 5). Met behulp van MAM7 gekoppelde fluorescerende blauwe kralen, wij gekenmerkt het proces van MAM7-gemedieerde hechting aan epitheelcellen. Bevestiging van MAM7 aan gastheercellen geleid actine herschikkingen en de vorming van stressvezels, die co-zichtbaar gemaakt rhodamine-phalloidin kleur wordt F-actine (Figuur 5B) was.

_upload / 53.400 / 53400fig5.jpg "/>
Figuur 5. Voorbereiding en gebruik van fluorofoor gelabeld biomimetische kralen voor imaging doeleinden. (A) De schorsing van fluorescerende blauwe biomimetische kralen (rechts buis, 10x voorraad) en buffer controle (links buis). (B) Bevestiging van MAM7 gekoppelde kralen Hela cellen resulteert in actine herschikkingen en de vorming van stress vezels. Hechting van fluorescerende blauwe kralen en de daaruit voortvloeiende actine stress-vezels (rood, gekleurd met rhodamine-phalloidin) werden afgebeeld door microscopie. Bar, 10 urn. Beelden in panel B werden aangepast van Lim et al. ¹ en gereproduceerd onder de Creative Commons Attribution-licentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Hierin beschrijven we twee protocollen die kunnen worden gebruikt voor het koppelen-thiol bevattende eiwitten aan amine- of carboxylaat gemodificeerde polystyreen korrels resp. Vanwege het gemak van de procedure, thiol-amine koppeling de voorkeur, maar afhankelijk van de gewenste korrel specificatie (diameter, fluorescentie-eigenschappen), kunnen gebruik maken van amine-gefunctionaliseerde kralen niet mogelijk en hebben daarom onder een protocol dat de carboxylaat om te zetten - in een amine-eenheid aan de onderzoeker de grootst mogelijke flexibiliteit in de keuze van de steiger te geven. Hoewel beide thiol-amine en thiol-carboxyl koppeling voor ieder cysteine ​​bevattende eiwitten, richtkoppel (dwz immobilisatie van het eiwit per zijn N-terminus, nabootsen oppervlakte elkaar) is een eiwit zonder cysteïneresten, die wordt geproduceerd als een GST-fusie eiwit, of dat bevat een enkel terminale cysteïnerest ingevoerd door plaatsgerichte mutagenese. Indien meerdere reactieve cysteïnen zijn opgenomenbinnen het eiwit, zal dit leiden tot willekeurige immobilisatie welk eiwit functie kunnen belemmeren. Veel bacteriële adhesinen niet cysteïnes van nature bevatten. Voor anderen, kunnen deze worden verwijderd door plaatsgerichte mutagenese, hoewel dit uitgebreide testen zou ervoor moeten zorgen natieve structuur en functie blijven in de mutant. Om GST-fusie-eiwitten, kunnen gezuiverd GST-tag gekoppeld aan korrels worden gebruikt als een geschikte negatieve controle. Het gebruik ontkoppeld parels als controle dient te worden vermeden, omdat deze vaak een hogere neiging tot samenklonteren en hechten aan cellen niet-specifiek. Een vereenvoudigde versie van het protocol 1.2., Met alleen EDC, kunnen worden gebruikt voor het koppelen van eiwitten aan carboxyl gefunctionaliseerd polymeer korrels, maar in dit geval koppeling gebeurt via primaire amines in eiwitten en daarom niet voor directionele koppeling.

TCEP als reductiemiddel mag niet worden vervangen door andere in de handel verkrijgbaar en algemeen gebruikte reductiemiddelen, zoals dithiothreitol (DTT) of 2-mercaptoethanol (BME), de thiolen daarin vervatte zal concurreren met eiwitten koppeling in de thiol-maleimide koppelingsstap. PBS worden vervangen door andere buffers, maar met de volgende overwegingen: Buffers mogen geen primaire aminen bevatten (dus Tris-bevattende buffers zijn niet geschikt). Het gebruik van buffers met een zeer laag (<10 mm) zoutconcentraties leidt tot klonteren kraal en moet ook worden vermeden. Eiwitzuiverheid is ook een belangrijke factor om te overwegen bij deze procedure en hoogwaardige gegevens plaatsvindt, dient zuivere eiwitten worden gebruikt. We routinematig zuiveren eiwitten in meerdere stappen, waaronder ten minste een affiniteitszuivering en gelfiltratiestap, maar in sommige gevallen ionenuitwisselingschromatografie is uitgevoerd als een derde stap. Ten gevolge van de zuiverheid van eiwitten voor koppeling is gewoonlijk 90% of hoger, zoals beoordeeld met SDS-PAGE.

Het wordt aanbevolen om eiwitconcentraties zowel de initiële reactiemengsel bepalen alsmede the supernatant na voltooiing van de reactie. Dit zal helpen om de schijnbare concentratie-bead gekoppelde eiwitten, en dus koppeling dichtheid ervan te bepalen. Bepaling van beide waarden ook berekening van het koppelrendement toestaan. Dit kan rekening worden gehouden bij het bereiden van de aanvankelijke eiwitoplossing in volgende reacties om de gewenste eindconcentratie en de koppeling dichtheid te bereiken. Bradford-reagens is bijzonder geschikt voor de bepaling van proteïneconcentratie vóór en na de koppelingsreactie, aangezien geen van de stoffen in de reactie interfereert met de kleurstof complexvorming in de gebruikte concentraties. Als lagere eiwitconcentraties moeten worden gebruikt, kan deze werkwijze moeten worden vervangen door een gevoeligere detectie werkwijze is echter aandacht worden besteed aan het feit zij verenigbaar met de stoffen in de koppelingsreactie worden. Het wordt ook aanbevolen om vers bereide reagentia te gebruiken en te hanteren gepoederde reagentia met zorg (bijvoorbeeld winkelin een afgesloten houder en gebruik silicapareltjes, de reagentia tekening vocht) omdat de kwaliteit van de reagentia zal beïnvloeden koppelrendement voorkomen. Als de koppeling efficiëntie is lager dan verwacht, onder andere mogelijke oplossingen verhogen de eerste kraal en eiwit concentraties. Bij hogere concentraties worden gebruikt, de concentratie van koppelingsmiddelen in evenredigheid worden verhoogd om voldoende molaire overmaat te verkrijgen. Kraal / eiwitconcentraties wijzigen meestal een betere stap optimalisatie plaats toenemende reactietijden. Aangezien de protocollen voor kraal koppeling zijn lang, we meestal bereiden een grote partij van het materiaal. Aliquots van de suspensie kan worden snel bevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -20 ° C gedurende enkele maanden. Ontdooide monsters mag niet worden ingevroren en moeten bij 4 ° C bewaard en binnen 1-2 dagen. Dit zal echter variëren met de aard en de stabiliteit van het eiwit gebruikt moet worden getest op een kleine partij aanvankelijk.

Bead-gekoppelde adhesinen kunnen worden gebruikt voor vele toepassingen, zoals hieronder besproken. Dit protocol beschreef een test die vaak wordt gebruikt om de remming van bacteriële binding en pathogeen-bemiddelde cytotoxiciteit op gastheercellen te meten. De bepaling wordt gewoonlijk uitgevoerd om het vermogen van bead gekoppeld MAMs competitief remmen infectie van Hela epitheelcellen van de zee voedsel overgedragen pathogenen Vibrio parahaemolyticus meten met behulp van een afname in bacteriële hechting aan gastheercellen of verlaagde cytotoxiciteit als read-out . In beide gevallen, voorbereiding en competitie assays volgens hetzelfde protocol. Afhankelijk van de uitlezing verschillende stammen van V. parahaemolyticus worden gebruikt: de cytotoxische stam POR1 wordt gebruikt voor metingen cytotoxiciteit, terwijl de niet-cytotoxische stam POR2 wordt gebruikt voor het meten van bacteriële hechting, omdat celdood en cel losraken compromitteert de procedure voor het kwantificeren van bacteriën gehecht.

Aanvankelijk comperentie experimenten werden opgezet als een stapsgewijze protocol waarbij gastheercellen eerst werden gepreïncubeerd met kralen voorafgaand aan de toevoeging van bacteriën. Voor V. parahaemolyticus en de kraal specificaties die (2 urn korrels gekoppeld aan MAM7), zowel kralen en bacteriën worden toegevoegd tegelijk ongewijzigd in het resulterende cytotoxiciteit. Ie, in deze experimentele opstelling, parels verdringen bacteriën gastheercel binding. Afhankelijk van de bacteriesoort en rilgeometrie gebruikt, kunnen er goede redenen zijn voor het behoud van de kraal hechting en bacteriële infecties als twee afzonderlijke stappen. Bijvoorbeeld, cellen met niet-beweeglijke bacteriën infecteren, worden de platen gecentrifugeerd gewoonlijk na toevoeging van de infectie media. Toch moet centrifugeren platen bevattende korrel suspensies worden vermeden, aangezien dit leidt tot een zeer ongelijkmatige verdeling van de kralen op de cellaag. Als kleinere deeltjesgrootten worden gebruikt, parels langer te vestigen op het celoppervlak, waarbij sufficient tijd zou moeten worden toegestaan ​​voor kraal bevestiging voorafgaand aan de infectie. Als bacteriële adhesie wordt gebruikt als uitlezen moeten de monsters worden genomen op tijdstippen waarbij gastheercellen niet significant aangetast door het infecterende stam, als cellen loslaten en lysis kan de kwantificering van de bijgevoegde bacteriën compromitteren.

In plaats van het opsommen van bacteriële adhesie door verdunning plating, kunnen monsters alternatief worden verwerkt voor beeldvorming (Figuur 5). In dit geval moet weefselkweek cellen gezaaid op glazen dekglaasjes, in plaats van rechtstreeks in putten. Bovendien kunnen fluorescerende kralen en bacteriën tot expressie van een fluorescerend eiwit worden gebruikt, samen met een infectie-specifieke gastheercel markers. Bijvoorbeeld worden gewoonlijk afgebeeld competitie-experimenten met fluorescerende rhodamine red-phalloidin de gastheercellen 'actine cytoskelet vlekken en morfologische veranderingen als gevolg van infectie, beoordeelt samen met fluorescerende kralen en blauwe fluorescerendegroen (GFP-expressie of SYTO18 gekleurd) bacteriën.

Een reeks kraal gekoppelde adhesinen, waaronder Staphylococcus aureus FnBPA, Streptococcus pyogenes F1 FUD en Vibrio parahaemolyticus MAM, zijn gebruikt als biomimetische materialen hechting, hechting remmen en de bijdrage van hechting te bestuderen pathogeen gemedieerde cytotoxiciteit ^{1, 7, 8.} Een van de voordelen van deze benadering is het gemak van het zichtbaar maken van hechting gebeurtenissen, aangezien de polymeerpareltjes als steigers zijn beschikbaar in een groot aantal kleuren (bijvoorbeeld blauw, fluorescerend rood, blauw, groen, oranje). Aldus directe labeling eiwit, die kunnen interfereren met de functie, kan worden vermeden. Bovendien vloerkoppeling bootst de multivalente weergave van adhesinen op het bacteriële oppervlak, hetgeen aansluit bij een fysiologisch relevante conformatie vergeleken met oplosbare eiwitten.

Vergeleken met studies met intacte bacteriën of bacteriAl mutanten, de kraal benadering omzeilt problemen van bacteriegroei. Bijvoorbeeld langere termijn (bijvoorbeeld, O / N) studie van bacteriële adhesie aan cellen onder toepassing van intacte bacteriën systeem vaak aangetast door verschijnselen begeleidende bacteriegroei - aanzuren van het groeimedium en een tekort aan nutriënten negatieve invloed gastheercellen en bacteriële replicatie uiteindelijk compromissen beeldkwaliteit.

Meer recent is het gebruik van gekoppelde bead adhesinen uitgebreid gebruik ervan als instrumenten voor affiniteit zuiveringen van gastheer cellulaire factoren betrokken bij signaleringsprocessen stroomafwaarts van bacteriële hechting omvatten. V. parahaemolyticus MAM7, via binding aan fosfatide zuren in het gastheercelmembraan, triggers RhoA activatie en actine herschikkingen ^{1, 3.-MAM} gekoppelde korrels worden gebruikt voor het zuiveren en identificeren van eiwitten betrokken bij de signalering platforms gemonteerd gevolg van MAM-gastheercel verbindend. Sinds kralen kangemakkelijk van het supernatant gescheiden door een korte centrifugatie stap, en het eiwit van belang wordt covalent gekoppeld, is dit een goede methode voor de scheiding van verontreinigende proteïnen te bereiken en te verrijken relevant eiwitcomplexen, die kan worden gebruikt voor verdere toepassingen zoals proteomics of Western blotting.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagents
Tris(2-carboxyethyl)fosfine (TCEP)	Sigma	646547	Gevaar; corrosief kan worden gekocht als oplossing of vers bereid
Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleïmidofenyl)butyraat (Sulfo-SMPB)	Fisher	PN22317	Gevaar; toxisch
L-cysteïne	Sigma	30089	Gevaar; toxisch
Latexkorrels, amine-gemodificeerd polystyreen, fluorescerend blauw - waterige suspensie, 2,0 μm gemiddelde deeltjesgrootte	Sigma	L0280	schadelijk; er is een reeks alternatieve deeltjesgrootten en kleuren beschikbaar
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC)	Thermo scientific	22980
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Thermo scientific	24500
Carboxylaat-gemodificeerde polystyreenkorrels	Sigma	CLB9	schadelijk; er is een reeks alternatieve deeltjesgrootten en kleuren beschikbaar
Ethyleendiamine	Sigma	E26266	Gevaar; ontvlambaar, corrosief, toxisch, sensibiliserend
Rundserumalbumine (BSA)	Promega	W3841
Bradford-reagens	Sigma	B6916	Gevaar; corrosief en toxisch
Dulbecco’s Gemodificeerd Eagle’s Medium - hoge glucose - Met 4.500 mg/L glucose en natriumbicarbonaat, zonder L-glutamine, natriumpyruvaat en fenolrood, vloeibaar, sterieel gefilterd, geschikt voor celkweek	Sigma	D1145	voor infectie-experimenten
DMEM	Sigma	D6429	voor het onderhouden van gekweekte gastheercellen
Fetaal rundserum, hitte-inactivering	Sigma	F9665	supplement voor weefselkweekmedium
Penicilline-Streptomycine - Oplossing gestabiliseerd, met 10.000 eenheden penicilline en 10 mg streptomycine/mL, sterieel gefilterd, BioReagent, geschikt voor celkweek	Sigma	F9665	supplement voor weefselkweekmedium
PBS	Sigma	D8537
LDH Cytotoxiciteitsdetectiekit	Takara	MK401
Plastic
reagensbehouders (25ml)	SLS	F267660
24-wells platen	Greiner	662160
96-wells platen	Greiner	655182
Uitgerusting
haemocytometer
microcentrifuge
plate reader
weefselkweekfaciliteiten
multikanaals pipette