Een veelzijdige muizenmodel van Subcortical White Matter Stroke voor de Studie van axonale degeneratie en White Matter Neurobiologie

Samenvatting

Hier presenteren we de methodologie voor het produceren van een focaal beroerte in muiswitte stof door lokale injectie van een irreversibele endotheel nitric oxide synthase (eNOS) remmer (L-Nio). Er worden twee stereotactische variaties, retrograad neurologisch traceren en verse weefsellabelling en dissectie gepresenteerd die de potentiële toepassingen van deze techniek uitbreiden.

Samenvatting

Stroke invloed witte stof kan oplopen tot 25% van de klinische beroerte presentaties, gebeurt in stilte tegen tarieven die 5-10 keer groter kunnen zijn, en draagt ​​aanzienlijk bij aan de ontwikkeling van vasculaire dementie. Er zijn maar weinig modellen van focale witte stof beroerte bestaan ​​en dit gebrek aan geschikte modellen heeft inzicht in de neurobiologische mechanismen die betrokken zijn in blessuretijd respons en herstel na dit type van een beroerte belemmerd. De belangrijkste beperking van andere subcorticale beroerte modellen is dat ze het infarct tot de witte stof niet focaal beperken of zijn in de eerste plaats zijn gevalideerd in niet-muizen soorten. Dit beperkt de mogelijkheid om de grote verscheidenheid van murine onderzoeksinstrumenten toepassing op neurobiologie witte massa beroerte bestuderen. Hier presenteren we een methode voor de betrouwbare productie van een focale beroerte bij muizen witte stof met een lokale injectie van een irreversibele inhibitor eNOS. We hebben ook verschillende varianten te presenteren over de algemene protocol waaronder twee unieke stereotactischevariaties retrograde neuronale tracing, alsmede labeling vers weefsel dissectie en de mogelijke toepassingen van deze techniek uit te breiden. Deze variaties mogelijk voor meerdere benaderingen voor de neurobiologische effecten van deze gemeenschappelijke en onderbestudeert vorm van een beroerte te analyseren.

Inleiding

Een beroerte die de subcorticale witte stof aantast, is een veelvoorkomende klinische entiteit en is goed voor maximaal 25% van de klinische beroertes per jaar in de VS ¹. Ischemische schade aan de witte stof komt ook stilzwijgend voor in een aanzienlijk hoger tempo en draagt bij aan de ontwikkeling van vasculaire dementie ^2,3. Momenteel hebben patiënten met deze vorm van cerebrale ischemie weinig, zo niet geen behandelingsmogelijkheden. Ondanks het klinische belang van deze ziekte, bestaan er weinig klinisch relevante diermodellen ^4,5.

Het doel van dit protocol is om een focaal ischemische laesie in de witte stof van muizen te produceren. Dit muismodel van een menselijke ziekte maakt de specifieke studie van de reactie van axonen op een beroerte mogelijk en hoe de cellulaire elementen van de witte stof, namelijk oligodendrocyten en astrocyten samen met axonen, reageren en herstellen na een beroerte.

Eerdere rapporten beschreven een model van subcorticale wittestofberoerte met behulp van endotheline-1 (ET-1) ⁶ dat vergelijkbaar is met het hier beschreven model. Er zijn verschillende belangrijke wijzigingen in het experimentele protocol aangebracht, waardoor de potentiële toepassingen van dit model zijn uitgebreid ^7,8. Dit protocol biedt een betrouwbare en aanpasbare strategie om een focaal beroerte in de witte stof van muizen te produceren.

De belangrijkste voordelen van dit model zijn het gebruik van een chemische endotheliale stikstofmonoxidesynthase (eNOS) remmer N(5)-(1)-iminoethyl-L-ornithine HCl (L-Nio) ⁹ zonder bekende paracriene effecten op de cellulaire elementen van de witte stof, wat een complicatie was bij modellen die endotheline-1 gebruikten ¹⁰. Bovendien maakt het stereotactische targeten van de witte stof in de muis het gebruik van elke verscheidenheid aan transgene of knockout-stammen mogelijk, waardoor de beschikbare hulpmiddelen om het effect van een beroerte op de witte stof van de hersenen te bepalen, enorm worden uitgebreid. Hier worden twee variaties op deze techniek beschreven en demonstreren enkele van de aanvullende variaties die kunnen worden gebruikt om het begrip van axonale en wittestofschade en herstel na een beroerte te verbeteren.

Protocol

Het gebruik van dieren in dit protocol is uitgevoerd in overeenstemming met de procedures die door de University of California Los Angeles Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd.

Let op: Begin met het identificeren van de doelgroep muizen bevolking. In eerdere studies hebben alleen mannelijke wildtype C57 / Bl6 muizen gebruikt echter verschillende transgene of knockout muizen kunnen ook worden gebruikt. Merk op dat stereotactische coördinaten op basis van C57 / Bl6 anatomie. Aanbevolen wordt elke gebruiker aanvankelijk lokalisatie van de slag om witte stof controleren.

1. White Matter Stroke Inductie - Mediale Hoekige Benadering

1. Eerst bereiden van een getrokken glazen pipet gebruikt 0,5 mm capillaire buis zodanig dat het distale diameter tussen 15-25 pm ^11.
2. Bereid een steriele 10 pl aliquot van L-Nio (N (5) - (1) -iminoethyl-L-ornithine HCl) en 27,4 mg / ml (130 pM) in steriele 0,9% normale zoutoplossing.
3. Pre-vul de getrokken glazen pipetmet een klein volume L-Nio (2-5 ul) door het aanbrengen van de glazen pipet buis verbonden met een vacuümleiding. Leg de pipet plat op de bank top en steek de trok uiteinde in de L-Nio-oplossing.
   1. Onder vacuüm tot minstens 2 mm van de 0,5 mm gedeelte van de pipet wordt gevuld. Schakel de stofzuiger en de pipet te trekken. Leg het opzij totdat Step 1.12.
4. Plaats de muis in een inductie kamer en induceren anesthesie van de muis met behulp van standaard 32% isofluraan stroomde door een verdamper (5 l / min ingeademd met 5 l / min zuurstof en 0,5 l / min _N2) gedurende 1 min of tot diep verdoofd. Breng de muis een stereotactische inrichting voorzien van een stereotactische microscoop. Onderhoudsdiensten anesthesie via 32% isofluraan stroomde door een verdamper (2 l / min geïnhaleerd met 5 l / min zuurstof en 0,5 l / min _N2) en een neuskegel. Controleer de diepte van de anesthesie met een teen knijpen.
5. Stel de injectie arm 36 °.
6. Affix getrokken glazen pipet houder aan het distale einde van een lage volume druk injectiesysteem en bevestig deze aan de injectie arm van de stereotactische setup.
7. Coat snorharen van de verdoofde dier met vaseline en plaats kunsttranen zalf over beide ogen. Bereid een steriele chirurgische veld door een steriele doek over het hoofd van het dier met een 5-10 cm opening over de weg. Bereid een aspetic chirurgische oppervlak door het scheren van de vacht bovenop de schedel. Reinig de hoofdhuid met afwisselend betadine en 70% in alcohol gedrenkte doekjes.
8. Maak een 1,5 cm middellijn hoofdhuid incisie met steriele fijne schaar om de schedel oppervlak bloot te leggen. Droog de schedel met een steriel wattenstaafje en met behulp van een stereotactische microscoop bij 1-3x vergroting, verwijder bovenliggende periostale weefsel met behulp van een steriele micro punt tool.
9. Markeer de Bregma als referentiepunt met behulp van een fijne punt marker.
10. Boor een 2 mm ellipitical craniotomy behulp van een steriele fijne stip chirurgische boor0; beginnend posterieur aan de Bregma en de uitbreiding naar voren net links van de middellijn. Verwijderen botfragmenten en bovenliggende zachte weefsel zodat de cerebrale cortex kan worden gevisualiseerd.
11. Houd het chirurgische veld en corticale oppervlak vochtig door intermitterend aanbrengen van druppels steriele zoutoplossing.
12. Kleef een getrokken glazen pipet om de injector arm van de stereotactische apparaat. Lijn het distale uiteinde van de pipet met de Bregma en nul de stereotactische coördinaten.
13. Vooraf de pipet om de eerste anterior / posterior (A / P) en mediale / laterale (M / L) coördinaten in tabel 1.
14. Vooraf de pipet om de corticale oppervlak en nul de dorsale / ventrale (D / V) meting.
15. Passeren langzaam de pipet in de hersenen tot aan de eerste D / V coördineren tabel 1.
16. Met behulp van een lage volume druk inspuitsysteem ingesteld op 20 psi gedurende 20 msec pulsen, injecteren 100 nl van L-Nio in de hersenen en wacht 5 min naar reflux te voorkomende pipet spoor.
    1. Gebruik een gekalibreerde dradenkruis in het oculair van de stereotactische microscoop en een vergroting van 3X.
    2. Dienovereenkomstig verplaatsen in totaal 0,100 mm ³ (lengte 0,5 mm in een 0,5 mm diameter pipet, overeenkomend met 100 nl) vanaf het getrokken glazen pipet voor elke reeks coördinaten. Door een reticule, meten en standaardiseren omdat elke ingesteld afhankelijk van de vergroting en gebruikte schalen.
    3. Voor nauwkeurige volumemeting bij elke injectie, naderen de schuine pipet met de microscoop vanaf de zijkant, zodat de lucht-vloeistof meniscus een sagittaal beeld. De meniscus moet in hetzelfde brandvlak van zowel de binnen- als buitenwand van de pipet.
17. Langzaam trekken de pipet en herhaal stappen 1.13-1.16.3 bij de tweede en derde set coördinaten in Tabel 1.
18. Na de laatste injectie, verwijder de pipet en plaats genoeg bot was om de craniotomie site te vullen. EENpproximate de randen van de wond en hoofdhuid binden dermale hechtmiddel.
19. Injecteer 0,1 ml 0,5% Marcaine in de wondranden met een steriele 30 G naald te voorkomen dat plaatselijke pijn geassocieerd met de hoofdhuid incisie voorkomen.
20. Keer terug het dier tot huisvesting en levering post-operatieve antibiotica (0,48 mg / ml co-trimoxazol, of 0,5 mg / ml Levofloxacin) in het drinkwater gedurende 5 dagen.

2. White Matter Stroke Inductie - posterior Hoekige Benadering

1. Voer de stappen 1,1-1,12 als in de mediale schuine benadering protocol, behalve aanpassen van de injectie arm van de stereotactische setup tot 45 graden georiënteerd anterior naar posterior.
2. Vooraf de pipet om de eerste A / P en M / L coördinaten in tabel 2.
3. Compleet resterende stappen 1,14-1,20 als in de laterale schuine benadering protocol.

3. Retrograde neuronale Labeling

1. Bereid een steriele 10pl aliquot van L-Nio bij 54,8 mg / ml in 0,9% normale zoutoplossing.
2. Bereid een steriele hoeveelheid van 20% Fluororuby (of 20% gebiotinyleerde dextraan amine of 2% Fluorogold) in 0,9% normale zoutoplossing.
3. Verdun samen 1: 1 voor eindconcentraties van 27,4 mg / ml L-Nio en 10% Fluororuby.
4. Voer de slag protocol zoals hierboven beschreven in stappen 1,3-1,23.
5. Visualiseer de native fluorescerende tracer in het weefsel sectie door perfusie fixatie, cryosectioning en microscopie zoals eerder beschreven ^8.

4. Weefsel bewerken voor Immunofluorescentie

1. Bij een geschikte post-slaginterval variërend van 3 uur tot 14 dagen na een beroerte, euthanaseren muizen via isofluraan overdosis of lokale IACUC goedgekeurde procedure.
2. Open de borstholte met behulp van schuine schaar en plaats een 23 G vlinder naald in de linker hartkamer.
3. Plaats een kleine snede in de rechterboezem met behulp van fijne schaar om een ​​uitstroom spoor voor de perfusiefluïdum mogelijk te maken.
4. Transcardially perfuseren met 30-40 ml koude met fosfaat gebufferde zoutoplossing gevolgd door 30-40 ml koude 4% paraformaldehyde met een snelheid van 10 ml / min bij kamertemperatuur.
5. Onthoofden de muis en verwijder de hersenen met behulp van steriele schaar om de schedel naar achteren te openen en dan verwijder voorzichtig de bovenliggende schedel met een spatel, zet de hersenen in koud 4% PFA gedurende 24 uur, en vervolgens over te dragen aan 30% sucrose in PBS gedurende 48 uur .
6. Bereid veertig micron zwevende gedeelten met een cryostaat en voeren verwerking antilichaam zoals eerder beschreven ^6-8. In deze studie, gebruikt u de volgende antilichamen: konijn anti-neurofilament 200 (1: 500 verdunning); konijn anti-vimentine (1: 500); geit anti-GFAP (1: 500); konijn anti-Iba-1 (1: 1000).

5. Weefsel bewerken voor eiwit of RNA Analyse

1. Bij een geschikte post-slaginterval variërend van 3 uur tot 14 dagen na een beroerte, euthanaseren via isofluraan overdosis of lokale IACUC goedgekeurde procedure.
2. onthoofden demuis en verwijder de hersenen met behulp van steriele schaar om de schedel naar achteren te openen en dan verwijder voorzichtig de bovenliggende schedel met een spatel.
3. Plaats een steriele spatel 4 mm aan de voorzijde van de hersenen naar de olfactorische knobbel en optische zenuwen verbreken. Til de hersenen uit de calvarium en plaats in ijskoude dissectie buffer (1x Hank's Balanced Salt Solution, 25 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 35 mM glucose, 4 mM natriumbicarbonaat en 0,01 mg / ml cyclohexamide).
4. Met behulp van een brain blok en steriele nieuwe scheermesjes, voor te bereiden 2-3 mm platen met de beroerte en plaats in koud dissectie buffer.
5. Onder een microscoop ontleden, identificeren van de witte stof onderliggende motorische cortex in de geïnjecteerde halfrond. Bij langere intervallen na een beroerte, kan de regio visueel worden geïdentificeerd door focale necrose en myeline bleekheid.
   Opmerking: Bij eerdere post-stroke tussenpozen injectie van L-Nio gemengd met 1 pi 10% Fast Green visuele identificatie van de slag kan toelaten ( Figuur 4A).
6. Onder begeleiding van een dissectie microscoop en met behulp van een frisse scalpel zorgvuldig ontleden de regio van witte stof die de slag, die door beide Fast Green etikettering of verlies weefsel. Verwijder bovenliggende cortex en onderliggend striatum wens.

Resultaten

Met behulp van het model gepresenteerd, kan de witte stof onderliggende voorpoot sensomotorische cortex betrouwbaar kan worden gericht. Dit chemisch geïnduceerde focale beroertemodel produceert axonale en myeline verlies astrocytose en microgliose (figuur 1), zoals typisch waargenomen in menselijke lacunaire infarcten. Via drie injecties, wordt een klinisch bruikbaar model vastgesteld met vroege stoornissen op motorische taken voorpoot ⁷ en een kleine maar sig...

Discussie

Een aantal eerdere modellen van subcorticale beroerte zijn beschreven, waaronder focale injecties van endotheline-1 in de interne capsule, subcorticale witte stof en striatum bij de rat en de muis ^{12-14 6,15.} Recentere modellen van kleine focale beroerte hebben gebruikt cholesterol microembolieën injectie in de halsslagader ¹⁶ en fototrombotisch occlusie van een enkele doordringende arteriole ^17. Elk van deze modellen heeft zowel voor- als nadelen ^5. De hier beschre...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
L-N5-(1-Iminoethyl)ornithine, Dihydrochloride	Calbiochem	400600-20MG
Isoflurane	Phoenix Pharmaceutical, Inc.	NDC 57319-559-06
Capillary tubes	World Precision Instruments	50-821-807
Picospritzer	Parker Instrumentation	Picospritzer II
Stereotactic setup	Kent Scientific	KSC51725
Pipette puller	KOPF	Model 720
Stereomicroscope SZ51	Olympus	88-124
Fine scissors	Fine Scientific Tools	14084-08
Forceps	Harvard Apparatus	PY2 72-8547
Curved Forceps	Harvard Apparatus	PY2 72-8598
Blunt dissection tool	Fine Scientific Tools	10066-15
Drill	Dremel	8220-1/28
Drill bits	Fine Scientific Tools	19007-05
Vetbond	3M	1469SB
Marcaine	HOSPIRA	NDC 0409-1610-50
Trimethoprim-Sulfamethaxole	STI Pharmacy	NDC 54879-007-16
Fluororuby	Fluorochrome Inc	30 mg
Paraformaldehyde	Fisher	O4042-500
Sucrose	Fisher	BP220-10
Cryostat	Leica CM3050 S	14047033518
Glass slides	Fisher	12-544-7
Fast Green	Sigma	F7252-5G
Dissection microscope	Nikon	SMZ1500
23 G butterfly needle	Fisher	14-840-35
10x Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14065056
1 M HEPES-KOH, pH 7.4	Affymetrix	16924
D-Glucose	Sigma	G8270
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Cyclohexamide	Sigma	01810