Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Porphyromonas gingivalis als modelorganisme voor het beoordelen van Interactie van anaërobe bacteriën met gastheercellen

25.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53408

⸱

17 december 2015

 , 
1Philips Institute for Oral Health Research, Virginia Commonwealth University, 2Department of Microbiology and Immunology, Virginia Commonwealth University, 3Department of Biochemistry, Virginia Commonwealth University

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel presenteert twee protocollen: een om anaërobe bacteriën te meten die succesvol kunnen binnendringen en overleven in de gastheer, en de andere om anaërobe bacteriën te visualiseren die interageren met gastheercellen. Dit onderzoek kan worden toegepast op elke cultiveerbare anaëroob en elk type eukaryotische cel.

Samenvatting

Anaërobe bacteriën ver overtreffen aeroben in vele menselijke niches zoals de darm, mond en vagina. Bovendien, anaërobe infecties komen vaak voor en vaak van inheemse afkomst. Het vermogen van enkele anaerobe pathogenen humane cellen binnen te dringen geeft hen aanpassingsmaatregelen aangeboren immuniteit ontsnappen alsook gastheercel gedrag moduleren. Echter, zodat de anaërobe bacteriën staan ​​tijdens experimenteel onderzoek van de gebeurtenissen kan problemen opleveren. Porphyromonas gingivalis, een Gram-negatieve anaërobe, kan binnenvallen een verscheidenheid van eukaryote niet-fagocytische cellen. Dit artikel schetst hoe succesvol de cultuur en beoordelen van het vermogen van P. gingivalis aan humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) binnendringen. Twee protocollen werden ontwikkeld: een voor bacteriën die met succes kunnen binnendringen en overleven in de gastheer, en andere bacteriën interactie met gastheercellen visualiseren meten. Deze technieken vereisen het gebruik van een AnaeRobic kamer leveren P. gingivalis met een anaërobe omgeving voor optimale groei.

Het eerste protocol is gebaseerd op het antibioticum bescherming assay, die grotendeels gebruikt om de invasie van gastheercellen door bacteriën te bestuderen. Echter, het antibioticum bescherming assay beperkt; alleen intracellulaire bacteriën die gekweekt zijn na behandeling met antibiotica en gastheer cellysis worden gemeten. Om alle bacteriën interactie met gastheercellen, zowel levende en dode beoordelen, ontwikkelden we een protocol dat fluorescentie microscopie gebruikt om gastheer-pathogeen interactie te onderzoeken. Bacteriën worden fluorescent gelabeld met 2 ', 7'-bis- (2-carboxyethyl) -5- (en-6) -carboxyfluorescein acetoxymethylester (BCECF-AM) en gebruikt om eukaryotische cellen te infecteren onder anaërobe omstandigheden. Na bevestiging met paraformaldehyde en permeabilisatie met 0,2% Triton X-100, worden gastheercellen gelabeld met TRITC phalloidin en DAPI naar de cel cytoskelet en de kern respectievelijk labelen. Meerdere images genomen op verschillende brandpunten (Z-stack) worden verkregen voor tijdelijke ruimtelijke visualisatie van bacteriën. Methoden in deze studie kan worden toegepast op elke landbouwgrond anaerobe en eukaryotische celtype.

Inleiding

Anaërobe bacteriën koloniseren vrijwel alle oppervlakken van het menselijk lichaam. Hoewel overwegend in de flora van de darm en urogenitalis waar zuurstof concentraties laag bestaan ​​ze ook bij hoge niveaus op de huid, mond, neus en keel 1. Anaërobe bacteriën zijn een veelvoorkomende oorzaak van endogene infecties en worden vaak geïsoleerd van zieke sites. Vanwege hun veeleisende aard, anaërobe moeilijk te isoleren en cultuur. Studies met anaërobe bacteriën moet gebeuren onder strikte voorwaarden. Moderne anaërobe kweektechnieken kunnen de onderzoekers om de anaërobe instellingen die nodig zijn om veel anaërobe laboratoriumstammen of klinische isolaten 2,3 studeren na te bootsen.

Pathogene anaërobe bacteriën hebben een dynamische relatie en co-evolutie met de gastheer cellen waarin zij wonen ontwikkeld. De meeste anaëroben zijn gevoelig voor doding door de gastheer immuunreactie voordat infectilende niveaus. Echter, sommige pathogene bacteriën mechanismen ontsnappen of ontwrichting van de gastheer immuunreactie ontwikkeld. Zij doen dit doel via mechanismen zoals ontwijking van immuunherkenning, neutralisatie van immuunmediatoren, verandering van celgemedieerde immuniteit, invasie van gastheercellen en wijziging van immune signalering 4. Porphyromonas gingivalis, een Gram-negatieve anaerobe betrokken bij zowel orale als extraorale ziekten, is een voorbeeld van een zeer geschikt bacterieel pathogeen kunnen veroorzaken pathogene veranderingen in de ontvangende 5-7.

Zakken van biofilm plaque ontstaan ​​uit diepe spleten gevormd tussen de tanden en tandvlees mucosale weefsel anaërobe bacteriën die worden beschermd tegen zuurstof 8 haven. Deze periodontale pockets dienen als niche voor diverse anaerobe pathogenen, zoals P. gingivalis 9. P. gingivalis is een hoeksteen pathogeen dat in staat verbouwening de mondelinge microbiële gemeenschap op manieren die de ontwikkeling en progressie van parodontale aandoeningen 10 te bevorderen. Het produceert een groot aantal virulentiefactoren die actief zijn tegen een breed spectrum van gastheer- en voorziet in mechanismen voor ontwijking van afweer 11. Het kan ook invasie epitheel, endotheel, fibroblasten, en periodontale ligament cellen in vitro en in vivo 14/12 15. Door het effectief invasie van gastheercellen, P. gingivalis kunnen gastheer immuniteit te ontsnappen. Effectieve invasie van gastheercellen mogelijk maakt niet alleen de bacterie afweer van de gastheer ontsnappen, maar ook dient als reservoir voor toekomstige herinfectie en verandert de gastheercel. Studies van de moleculaire mechanismen betrokken bij adhesie en internalisatie van de bacterie door gastheercellen nodig. Onderzoek in verschillende laboratoria is gericht op het begrijpen van de moleculaire geassocieerd met internalisatie P. gingivalis door de gastheercellenalsook de mechanismen te onderdrukken en kapen de immuunrespons en overleven de vijandige gastheer afweermechanismen.

Er zijn vele assays kan identificeren en karakteriseren van pathogenen die in staat binnendringende gastheercellen. In vitro studies met anaerobe pathogenen vormen vele experimentele problemen voor de onderzoeker vooral omdat het moeilijk studies die afhankelijk volumineuze instrumenten in afwezigheid van zuurstof uitgevoerd. Dit wordt verergerd door het feit dat eukaryote cellen zuurstof nodig om te groeien en moet dus apart worden bereid in weefselkweek incubator. Een manier om dergelijke obstakels te vermijden is om het onderzoek te verrichten onder atmosferische zuurstof, maar dat de groei van anaerobe bacteriën onmogelijk maken. Een andere methode zou zijn om hitte gedode bacteriën gebruiken om te infecteren en studie gastheer-cel interacties. Echter, verschillen bestaan ​​tussen de warmte gedood en levensvatbare bacteriën die de relevantie van de gastheer-pathogeen interacti verminderenon 16. Het staat centraal in levende bacteriën met ongewijzigde expressie interactie met gastheercellen te bestuderen; derhalve werkwijzen voor het kweken van P. gingivalis in een anaërobe omgeving worden gegeven. Ook zijn twee eenvoudige rendabele protocollen aangetoond voor het beoordelen van het vermogen van P. gingivalis worden geïnternaliseerd door humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC). Het eerste protocol is gebaseerd op het populaire antibioticum bescherming assay. Hoewel de test eenvoudig worden overwegingen bij het gebruik van anaerobe microorganismen gegeven. Het tweede protocol vereist het gebruik van een fluorescerende scanning microscoop te visualiseren interactie en geïnternaliseerd P. gingivalis. Elke test heeft zijn beperkingen en voordelen die zullen worden besproken zijn de onderzoeker een schets voor het bestuderen van het invasieve karakter van anaërobe bacteriën. Hoewel de huidige manuscript bestudeert P. gingivalis en HUVECs, kunnen deze protocollen worden gebruikt voor vele andere anaërobe bacteriën enzoals voor andere typen gastheercellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De volgende protocollen werkwijzen voor het kweken en bestuderen van de invasie door anaërobe species, blz beschrijven gingivalis; evenwel deze protocollen worden gebruikt voor een aantal anaerobe pathogenen. Hoewel HUVECs gebruikt, kan dit protocol worden gebruikt voor andere eukaryote cellen zowel immune als niet-immune.

1. Anaërobe Chamber gebruik en onderhoud

Opmerking: P. gingivalis is een anaerobe gevoelig voor normale niveaus van zuurstof aangetroffen in omgevingslucht. Een gecontroleerde anaëroob milieu is essentieel voor de kweek van P. gingivalis.

  1. Hier, onderhouden van een aangeduid als anaërobe gemengd gas (80% N2, 10% H2, 10% CO 2) in een vinyl anaërobe kamer (figuur 1A) kunstmatige atmosfeer. Gebruik een luchtsluis (Figuur 1B) voor het overbrengen van items uit het laboratorium omgeving naar de anaërobe kamer. De luchtsluis werkt handmatig, twijs zuivering met N 2 gas vóór de invoering van de gemengde anaerobe gas.
  2. Gebruik een waterstofsulfide verwijderingskolom (figuur 1C) voor onderhoudsvrije verwijdering van de ongewenste waterstofsulfide. Plaats een ontvochtiger binnen de kamer H 2 O door de katalysator te verwijderen en aërosolen dat de verspreiding van verontreiniging tegengegaan.
    Opmerking: Waterstofsulfide is een natuurlijk bijproduct van vele anaërobe bacteriën en ophoping is giftig voor bacteriën en kunnen leiden tot beschadiging van de elektronica en de levensduur van de katalysator te verminderen.
  3. Gebruik een ventilatorkast atmosfeer van de ruimte te circuleren door een palladiumkatalysator, die zuurstof in aanwezigheid van waterstof (figuur 1D) verwijdert.
    Opmerking: Een recirculerende atmosfeer (HEPA) verwijdert zwevende verontreinigingen met een grootte van 0,22 pm of groter.
  4. Cultuur anaërobe bacteriën in een 37 ° C incubator die zich binnen de anaërobekamer. Gebruik standaard aseptische technieken bij het werken in de anaërobe kamer.

figure-protocol-1
Figuur 1. Anaerobe vinyl kamer en zijn componenten. (A) A vinyl anaerobe kamer volledig afgesloten van zuurstof voorziet werkruimte twee personen tegelijk (32 in x 78 in). Het bevat een incubator ingesteld op 37 ° C (opnieuw midden). (B) een luchtsluis wordt gebruikt voor de overdracht van voorwerpen uit de laboratoriummilieu de anaërobe kamer. Afgebeeld is een automatische luchtsluis bediend door een controller die kan worden geprogrammeerd om de vacuüm- en ontluchtingsprocedures nodig om een ​​anaerobe omgeving te creëren automatisch uit te voeren. (C) A waterstofsulfide verwijderingskolom biedt onderhoudsvrije hoge capaciteit verwijdering van ongewenst waterstofsulfide. (D) Twee katalysator fan dozengeplaatst in de anaerobe kamer om circuleren atmosfeer van de kamer door middel palladiumkatalysator, die in aanwezigheid van waterstof, zuurstof verwijdert. De anaërobe kamer is opgezet volgens de instructies van de fabrikant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Voorbereiding van anaërobe bacteriën

Opmerking: P. gingivalis is aerotolerant en kunnen worden opgeslagen in aërobe omstandigheden, maar het zal niet groeien in aanwezigheid van zuurstof op een hoger niveau dan 6% 17,18. Een anaerobe kamer is noodzakelijk voor een goede kweek van P. gingivalis en andere anaërobe soorten (Figuur 1). Goede opleiding en onderwijs op anaerobe kamer gebruik is vereist voordat het werken met microanaerobes 19.

  1. Equilibreer alle vloeibare media en borden met de anaërobe Conditionen ten minste 12 uur vóór het experiment om resterende zuurstof te verwijderen.
  2. Transfer P. gingivalis van -80 ° C vriezer anaërobe kamer, laat ontdooien.
  3. Streak P. gingivalis op trypticasesoja bloed agar platen (TSA II met 5% schapen bloed). Wikkel platen in parafilm en opslag bij 37 ° C onder anaërobe incubator gedurende 4-7 dagen.
  4. Te enten P. gingivalis in 3 ml brain hart infusie (BHI) bouillon aangevuld met hemine en menadion, een verrijkt niet-selectieve vloeibare media voor het kweken van anaerobe en veeleisende micro-organismen, met steriele loops.
    Opmerking: Voor de lange termijn opslag, meng bacterieculturen opgesteld BHI met glycerol of DMSO (10-20% uiteindelijke concentratie) en plaats in een -80 ° C vriezer.
  5. Bereid een voorgerecht cultuur van P. gingivalis door een 1:10 verdunning en waardoor bacteriën groeien tot mid-log-fase.

Opmerking: De optische dichtheid van de bacriaal suspensie wordt bepaald en de bacteriële concentratie voor elke stam te onderzoeken ingesteld. Voor P. gingivalis een suspensie bij OD 660 van 0,7 komt overeen met mid-log fase en ~ 7 x 10 8 cellen / ml. Groeiomstandigheden in het protocol hierboven beschreven zijn specifiek voor P. gingivalis en moeten worden aangepast voor andere bacteriële stammen.

3. endotheelcellen Culture

Opmerking: Purchase samengevoegd primaire HUVEC plekken in basaal medium met vasculaire endotheliale groeifactoren (VEGF) bij 37 ° C in 5% CO 2 volgens de instructies van de fabrikant.

  1. Zaad HUVECs in T-75 flessen van 2,5 x 10 5 cellen / fles in 15 ml VEGF media.
    Opmerking: Controleer levensvatbaarheid via een 1: 1 verdunning met 4,0% trypan blauw. Cellen met een gecompromitteerd membraan trypaanblauw behouden, zullen gezonde cellen met intacte membranen wit verschijnen wanneer bekeken onder een binoculair lichtmicroscoop. Count 100 cellen zorgen dat meer dan 80% van de cellen levensvatbaar 20.
  2. Vervang de media om de 2 dagen met voorverwarmde verse VEGF media tot cellen te bereiken ~ 80% confluentie.
  3. Was de cellen eenmaal met PBS voorverwarmd. Bevrijden cellen van de T75 kolf door incubatie met 2 ml trypsine-EDTA (0,25%) gedurende 5 min gevolgd door 2 ml trypsine neutraliserende oplossing.
  4. Verzamel gesuspendeerd HUVEC's in een 50 ml conische buis. Spoel eventuele extra cellen van T-75 kolven met PBS en overbrengen naar 50 ml conische buizen.
  5. Centrifugeer cellen bij 200 xg gedurende 10 min.
  6. Verwijder supernatant, schorten cel pellet in 10 ml voorverwarmde VEGF media.
  7. Bepaal celconcentratie behulp van een hemocytometer en dergelijke cel telinrichting.
  8. Bereken hoeveelheid celsuspensie ofwel 6-well plaat (400,000 / putje) of 12-putjesplaat toevoegen dekglaasjes (50.000 / putje). HUVECs zal klaar zijn voor experimenten de volgende dag.

4. Survival Assay Invasion / Interaction(Plating)

Opmerking: Bij het uitvoeren van deze test bereiden twee 6-well platen van endotheelcellen gezaaid met 400.000 cellen / putje. Eén plaat wordt gebruikt om bacteriën bevestigd aan en geïnternaliseerd door gastheercellen te beoordelen. De andere plaat zal goed zijn voor intracellulaire bacteriën. De 6-well plaat maakt drievoud van twee monsters per experiment worden uitgevoerd. Voor een overzicht van dit protocol wordt verwezen naar de overleving assay stroomdiagram (figuur 2).

  1. Bereid anaërobe bacteriën zoals hierboven beschreven (zie punt 1) totdat ze mid-log groei (OD 660 0,5-0,7) te bereiken.
  2. Centrifugeer bij 5000 xg bacteriën gedurende 10 min.
    Opmerking: Als centrifuge buiten anaërobe kamer, dragen bacteriële monsters in een goed afgesloten buis van 15 ml, wikkel de dop met parafilm om zuurstof lekkage te voorkomen.
  3. Plaats afgedraaid P. gingivalis terug in de kamer, gooi supernatant. Was opnieuw met PBS, pellet bacteriën voordat resuspenderen in VEGF media. Suspensies bereid alle bacteriestammen worden getest bij OD 660 van 0,7 die overeenkomt met mid-log fase (~ 7 x 10 8 cellen / ml). De bacteriën zijn nu klaar voor infectie.
  4. Transfer 6-well platen met HUVECs uit weefselkweek incubator in anaërobe kamer. Verwijder de media en was driemaal met anaërobe PBS. Voeg 2 ml VEGF anaerobe medium aan elk putje en plaats de platen bij 37 ° C in anaërobe incubator gedurende 20 minuten de temperatuur op infectie evenwicht.
    Opmerking: Plaat bacteriën op bloed agar platen die gebruikt worden voor de infectie zorgen homogeen zijn en niet verontreinigd na infectie.
  5. Infect gastheercellen met bacteriën bij een multipliciteit van infectie (MOI bacteriën: host) van 100: 1.
    Opmerking: HUVEC cel aantal wordt bepaald door het uitvoeren van een trypan uitsluiting testen op een enkele ruim voor infectie. Bacteriële aantal cellen wordt bepaald via optische dichtheid (bijvoorbeeld OD van 0,5 = 5 x 10 8 cellen / ml). Bacterial concentratie wordt ingesteld op juiste MOI basis van HUVEC concentratie 21.
  6. Plaats 6-well platen met besmette HUVEC in anaërobe incubator de bacteriën te interageren met gastheercellen gedurende 30 min.
  7. Bereid saponine in BHI (1,0% w / v) in de anaërobe kamer en filtreer door een 0,2 urn filter.
  8. Overleving van zowel aangesloten en geïnternaliseerde bacteriën.
    1. Verwijder platen uit de incubator, aspireren media, wast driemaal met PBS anaërobe en voeg 2 ml gefiltreerd 1,0% saponine (bereid zoals beschreven in stap 4,8). Incubeer gedurende 15 min tot lysis gastheercel mogelijk maken.
    2. Schrapen onderkant van elk putje met celschraper. Verzamel de celmengsel uit elk putje en een 1: 1 verdunning in BHI.
    3. Overgaan tot seriële verdunningen van het monster te maken. Afhankelijk van bacteriesoorten en concentratie, stel seriële verdunningen. Begin met 1: 100 of 1: 1000 verdunningen.
    4. Plaat 200 ul van gewenste verdunning op bloed agarplaten. Wrap tHij platen parafilm en plaats in de anaërobe incubator bij 37 ° C.
    5. Na zeven dagen incubatie bij 37 ° C, verwijder de platen en tel kolonievormende eenheden (CFU's) met behulp van een lichtbak handmatig kolonies te tellen.
      Opmerking: CFU opgesomd. Voor grotere hoeveelheden CFU's kunnen beelden worden gemaakt en software kan worden gebruikt voor de telling van CFU vergemakkelijken.
  9. Overleving van geïnternaliseerde bacteriën.
    1. Verwijder platen uit de incubator. Was driemaal met PBS anaërobe en voeg 2 ml VEGF medium aangevuld met antibiotica (300 pg / ml gentamicine en 400 ug / ml metronidazol).
    2. Incubeer gedurende 1 uur. Zorg ervoor dat de antibiotica te testen, zodat ze 100% effectief is bij het ​​doden van de gewenste bacteriële stam en zorg ervoor dat ze niet gastheercellen 22,23 dringen.
    3. Zuig media, voeg 2 ml van gefilterde 1,0% saponine. Incubeer gedurende 15 min tot lysis gastheercel mogelijk maken.
    4. Schrapen onderkant van elke well met celschraper. Verzamel de cel mengsel uit elk putje en maak 1: 1 verdunning in BHI.
    5. Maak seriële verdunningen van het monster (1: 100, 1: 1000).
    6. Plaat 200 ul van gewenste verdunning op bloed agarplaten. Wikkel platen in parafilm en plaats in anaërobe incubator.
    7. Na zeven dagen incubatie bij 37 ° C platen verwijderd en tellen CFU.

figure-protocol-2
Figuur 2. Schematische weergave van een protocol dat wordt gebruikt voor de overleving van anaërobe bacteriën met eukaryotische cellen. Beide assays voor een totaal bacteriële overleving en de overleving van geïnternaliseerde bacteriën kunnen tegelijkertijd worden uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. internalisering van bacteriën in Host CeLLS (Fluorescent Microscopy)

Opmerking: P. gingivalis wordt gelabeld met 2 ', 7'-bis- (2-carboxyethyl) -5- (en-6) -Carboxyfluorescein, acetoxymethylester (BCECF-AM). BCECF-AM is een niet-fluorescente membraan-permeabel kleurstof; de omzetting fluoresceïne BCECF via de werking van intracellulaire esterasen kan cellevensvatbaarheid aangeven. P. gingivalis is gelabeld met BCECF-AM kleurstof en vervolgens gebruikt om eukaryotische cellen te infecteren. Na infectie worden de cellen gefixeerd en gemerkt met DAPI en TRITC-falloïdine. De DAPI kleuring gebruikt om eukaryotische celkern vlek ook etiketteren bacteriële cel nucleus, waarbij een tegenmaatregel voor niet-levensvatbare bacteriën die niet metabolisch splitsen BCECF-AM identificatie levert. Gastheercellen worden gemarkeerd met TRITC-phalloidin, een rode kleurstof actine.

  1. Autoclaaf dekglaasjes. Aseptisch dekglaasjes naar 12-well plates voor het zaaien van endotheelcellen 5 x 10 4 cellen / putje. (Opgesteld dag voor experiment)
  2. Hebben endotheelcellen opgesteld op 18 mm (1,5 # dikte) ronde dekglaasjes in 12-wells platen als hierboven beschreven.
  3. Bereid anaërobe bacteriën gekweekt tot mid-log fase (OD 660 = 0,5-0,7), zoals beschreven in paragraaf 1.
  4. Was met anaërobe bacteriën 2x PBS met centrifugeren bij 5000 x g en de pellet suspenderen in PBS bij 5-7 x 10 8 cellen / ml.
  5. Voeg 20 ul van 0,2 mM BCECF-AM tot 2 ml bacteriesuspensie (5-7 x 10 8 cellen / ml) tot een eindconcentratie van BCECF-AM van 2 uM.
  6. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min in het donker.
  7. Transfer platen met endotheelcellen gezaaid op 18 mm (# 1,5 dikte) ronde dekglaasjes van weefselkweek incubator in de anaërobe kamer. Wassen met PBS en uitwisseling met anaërobe VEGF media.
    Let op: Controleer of HUVECs gezond zijn onder een lichtmicroscoop. HUVECs moet ~ 80% confluent dient morfologie vergelijkbaar met de fabrikanten.
  8. Centrifuge gelabelde bacteriën op5000 xg gedurende 10 min om resterende BCECF-AM kleurstof te verwijderen. Schorten in 2 ml anaërobe VEGF media.
  9. Infect gastheercellen met gemerkte bacteriën bij MOI van 100: 1 (bacteriën: host).
  10. Incubeer in anaërobe kamer bij 37 ° C gedurende 30 min.
  11. Na infectie wassen cellen met PBS driemaal en fixeer vers bereide 4,0% paraformaldehyde gedurende 10 min.
    Opmerking: Na de vaststelling van de cellen, kan experiment buiten de anaerobe kamer worden uitgevoerd.
  12. Coverslips wassen met PBS driemaal.
  13. Voeg 1 ml 0,2% Triton X-100 gedurende 10 min.
  14. Coverslips wassen met PBS driemaal.
  15. Voeg 50 ul van TRITC phalloidin (50 ug / ml) dekglaasjes tot 45 min.
  16. Was coverslips drie keer, te verwijderen uit de 12-well plaat en plaats op een dia met soft-set montage medium met DAPI. Verzegeling van de zijkanten met nagellak.
    Opmerking: Dia's kunnen worden opgeslagen voor een paar maanden in het donker. Vermijd blootstelling aan licht van de foto's bleken te voorkomen.
  17. Bekijk slidesmet behulp van een confocale microscoop.
    1. Hier, gebruik een 34 kanaals spectraal-systeem (32-kanaals array detector en twee side PMT detectoren, plus een verzonden licht detector) geconfigureerd rond een AxioObserver (omgekeerde) staan ​​met een gemotoriseerde XY podium. Het systeem heeft vijf lasers: blauw diode (405 nm), multi-line Argon (458, 488, 514 nm), groene diode (561 nm), rood HeNe (633 nm) en een 440 nm gepulste laser. Voorzie een Fluorescence Lifetime Imaging-systeem met 2 hybride GaAsP detectoren (voor FRET-FLIM).
    2. Detecteren fluorescentie van DAPI en TRITC in een kanaal met behulp van een dual-band filter met golflengten van 340-380 nm en 540-560 nm en een emissie filter van 435-485 nm en 570-590 nm respectievelijk. Detecteren fluorescentie van BCECF-AM gebruik van een filter met excitatie golflengte van 440-500 nm en een emissie filter van 510-590 nm.
      Opmerking: Controles voor BCECF-AM moet worden gedaan op elke bacteriestam worden bestudeerd om de juiste etikettering van levende bacteriën te garanderen. Valideren eerste dat nonviable bacteriën zijn DAPI-positieve en BCECF-negatief. Tweede, ervoor te zorgen dat levende bacteriën BCECF-AM kan metaboliseren in fluoresceïne BCECF. Variabele concentraties van de bacteriën of BCECF-AM kleurstof kan getest moeten worden voor een optimale labeling.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Protocollen hierboven beschreven werden toegepast in de studie van gastheer-pathogeen interactie tussen P. gingivalis en endotheelcellen. P. gingivalis W83 en P. gingivalis V3150 die een deletie van PG0228 werden gebruikt in de studie. De PG0228 is voorspeld een eiwit dat de niveaus van RNA en eiwitten kunnen veranderen, die uiteindelijk kunnen beïnvloeden interactie van P. coderen gingivalis met gastheercellen. Om het effect van PG0228 op P. onderzoeken gingival...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Alle bovengenoemde werkwijzen kunnen worden gebruikt om specifieke assays voor de interactie van anaërobe bacteriën met eukaryotische cellen te beoordelen ontwerpen. Echter, er zijn verschillende overwegingen bij de experimenten te doen dalen. Ten eerste zijn de microbiële stammen worden gebruikt in een studie.

Het is cruciaal bij de vergelijking van twee stammen zowel het overleven assay en microscopisch onderzoek dat ze op vergelijkbare groeifasen en bereiken soortgelijke celconcentraties ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We willen Dr. Hiroshi Miyazaki, Dr. Scott Henderson, Dr. Todd Kitten, Dr. Justin Hutcherson, Dr. Catherine Jauregui en Collin R. Berry bedanken. Dit werk werd ondersteund door NIH NIDCR-subsidies R01DE016124, R01DE018039 en R01DE023304 aan J.P. Lewis.

Microscopie werd uitgevoerd in de VCU Afdeling Anatomie en Neurobiologie Microscopie Faciliteit, ondersteund, deels, met financiering van NIH-NINDS Centrum kern-subsidie (5P30NS047463).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Vinyl Anaerobic Chamber-Type BCoy Laboratory ProductsModel 2000 incubator 
TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep BloodBBL221261
Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor PoolLifeLine TechnologyFC-0044
VascuLife VEGF Medium Complete KitLifeLine TechnologyLL-0003
TrypKitLifeLineLL-0013
SaponinRiedel-de Haen16109
Gentamicin Sulfate SaltSigma-AldrichG-1264
MetronidazoleSigma-AldrichM-3761
BCECF-AMLifeTechnologiesB1150
TRITC Phalloidin Sigma-AldrichP1951
18 mm Circular CoverslipsElectron Microscopy Sciences72222-01
VectaShield Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200

Referenties

  1. Hentges, D. J. The Anaerobic Microflora of the Human Body. Clin. Infect. Dis. 16 (4), S175-S180 (1993).
  2. Willis, A. T. Anaerobic bacteriology: clinical and laboratory practice. , (2014).
  3. Wren, M. W., Baldwin, A. W., Eldon, C. P., Sanderson, P. J. The anaerobic culture of clinical specimens: a 14-month study. J. Med. Microbiol. 10 (1), 49-61 (1977).
  4. Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41 (3), 188-202 (2008).
  5. Mayrand, D., Holt, S. C. Biology of asaccharolytic black-pigmented Bacteroides species. Microbiol. Rev. 52 (1), 134-152 (1988).
  6. Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Life below the gum line: pathogenic mechanisms of Porphyromonas gingivalis. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (4), 1244-1263 (1998).
  7. Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Microbial etiological agents of destructive periodontal diseases. Periodontol. 2000. 5 (1), 78-111 (1994).
  8. Listgarten, M. A. Structure of the microbial flora associated with periodontal health and disease in man. A light and electron microscopic study. J. Periodontol. 47 (1), 1-18 (1976).
  9. Ximénez-Fyvie, L. A., Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Comparison of the microbiota of supra- and subgingival plaque in health and periodontitis. J. Clin. Periodontol. 27 (9), 648-657 (2000).
  10. Darveau, R. P., Hajishengallis, G., Curtis, M. A. Porphyromonas gingivalis as a potential community activist for disease. J. Dent. Res. 91 (9), 816-820 (2012).
  11. Holt, S. C., Kesavalu, L., Walker, S., Genco, C. A. Virulence factors of Porphyromonas gingivalis. Periodontol. 2000. 20 (1), 168-238 (1999).
  12. Lamont, R. J., Yilmaz, öZ. In or out: the invasiveness of oral bacteria. Periodontol. 2000. 30 (1), 61-69 (2002).
  13. Lamont, R. J., et al. Porphyromonas gingivalis invasion of gingival epithelial cells. Infect. Immun. 63 (10), 3878-3885 (1995).
  14. Belton, C. M., Izutsu, K. T., Goodwin, P. C., Park, Y., Lamont, R. J. Fluorescence image analysis of the association between Porphyromonas gingivalis and gingival epithelial cells. Cell. Microbiol. 1 (3), 215-223 (1999).
  15. Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
  16. Kaufmann, S. H. Immunity to intracellular bacteria. Annu. Rev. Immunol. 11 (1), 129-163 (1993).
  17. Diaz, P., Rogers, A. The effect of oxygen on the growth and physiology of Porphyromonas gingivalis. Oral Microbiol. Immunol. 19 (2), 88-94 (2004).
  18. Lewis, J. P., Iyer, D., Anaya-Bergman, C. Adaptation of Porphyromonas gingivalis to microaerophilic conditions involves increased consumption of formate and reduced utilization of lactate. Microbiology. 155, 3758-3774 (2009).
  19. Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. J. Vis. Exp. (79), e50787(2013).
  20. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. , (2001).
  21. Koch, A. L., Crandall, M. Photometric measurement of bacterial growth. The American Biology Teacher. 30 (6), 481-485 (1968).
  22. Wikins, T. D., Holdeman, L. V., Abramson, I. J., Moore, W. E. Standardized single-disc method for antibiotic susceptibility testing of anaerobic bacteria Antimicrob. Agents Chemother. 1 (6), 451-459 (1972).
  23. Bauer, A. W., Kirby, W. M., Sherris, J. C., Turck, M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45 (4), 493-496 (1966).
  24. Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. J. Clin. Invest. 52 (7), 1673-1679 (1973).
  25. Menzies, B. E., Kourteva, I. Internalization of Staphylococcus aureus by endothelial cells induces apoptosis. Infect. Immun. 66 (12), 5994-5998 (1998).
  26. Naito, M., et al. Determination of the genome sequence of Porphyromonas gingivalis strain ATCC 33277 and genomic comparison with strain W83 revealed extensive genome rearrangements in P. gingivalis. DNA Res. 15 (4), 215-225 (2008).
  27. Goebel, W., Kuhn, M. Bacterial replication in the host cell cytosol. Curr. Opin. Microbiol. 3 (1), 49-53 (2000).
  28. Gospodarowicz, D. III C. Extracellular matrix and control of proliferation of vascular endothelial cells. J. Clin. Invest. 65 (6), 1351-1364 (1980).
  29. DeQuach, J. A., et al. Simple and high yielding method for preparing tissue specific extracellular matrix coatings for cell culture. PloS One. 5 (9), e13039(2010).
  30. Sellers, J. R., Cook, S., Goldmacher, V. S. A cytotoxicity assay utilizing a fluorescent dye that determines accurate surviving fractions of cells. J. Immunol. Methods. 172 (2), 255-264 (1994).
  31. Van Veen, H. W., et al. Generation of a proton motive force by the excretion of metal-phosphate in the polyphosphate-accumulating Acinetobacter johnsonii strain 210A. J. Biol. Chem. 269 (47), 29509-29514 (1994).
  32. Jackson, V. N., Halestrap, A. P. The kinetics, substrate, and inhibitor specificity of the monocarboxylate (lactate) transporter of rat liver cells determined using the fluorescent intracellular pH indicator, 2',7'-bis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein. J. Biol. Chem. 271 (2), 861-868 (1996).
  33. He, J., et al. Role of Porphyromonas gingivalis FeoB2 in metal uptake and oxidative stress protection. Infect. Immun. 74 (7), 4214-4223 (2006).
  34. Anaya-Bergman, C., et al. Porphyromonas gingivalis ferrous iron transporter FeoB1 influences sensitivity to oxidative stress. Infect. Immun. 78 (2), 688-696 (2010).
  35. Ueshima, J., et al. Purification, gene cloning, gene expression, and mutants of Dps from the obligate anaerobe Porphyromonas gingivalis. Infect. Immun. 71 (3), 1170-1178 (2003).
  36. Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. JoVE. (79), (2013).
  37. Cordes, T., Maiser, A., Steinhauer, C., Schermelleh, L., Tinnefeld, P. Mechanisms and advancement of antifading agents for fluorescence microscopy and single-molecule spectroscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (14), 6699-6709 (2011).
  38. Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. , (2010).
  39. Gursoy, U., Könönen, E., Uitto, V. Prevotella intermedia ATCC 25611 targets host cell lamellipodia in epithelial cell adhesion and invasion. Oral Microbiol. Immunol. 24 (4), 304-309 (2009).
  40. Sengupta, D., et al. Interaction of Prevotella intermedia strain 17 leucine-rich repeat domain protein AdpF with eukaryotic cells promotes bacterial internalization. Infect. Immun. 82 (6), 2637-2648 (2014).
  41. Reyes, L., Herrera, D., Kozarov, E., Roldán, S., Progulske-Fox, A. Periodontal bacterial invasion and infection: contribution to atherosclerotic pathology. J. Clin. Periodontol. 40, S30-S50 (2013).
  42. Grant, M. M., et al. Oxygen tension modulates the cytokine response of oral epithelium to periodontal bacteria. J. Clin. Periodontol. 37 (12), 1039-1048 (2010).
  43. Biedermann, A., Kriebel, K., Kreikemeyer, B., Lang, H. Interactions of Anaerobic Bacteria with Dental Stem Cells: An In Vitro Study. PloS One. 9 (11), e110616(2014).
  44. Kriebel, K., Biedermann, A., Kreikemeyer, B., Lang, H. Anaerobic Co-Culture of Mesenchymal Stem Cells and Anaerobic Pathogens-A New In Vitro Model System. PloS One. 8 (11), e78226(2013).
  45. Peyyala, R., Kirakodu, S. S., Novak, K. F., Ebersole, J. L. Oral microbial biofilm stimulation of epithelial cell responses. Cytokine. 58 (1), 65-72 (2012).
  46. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gòmez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosens Bioelectro. 63, 218-231 (2015).
  47. Iyer, D., et al. AdpC is a Prevotella intermedia 17 leucine-rich repeat internalin-like protein. Infect. Immun. 78 (6), 2385-2396 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Interactie met gastheercelantibioticum protectie assayfluorescentiemicroscopieanaerobe kamerHUVEC infectieBCECF AM labelingCFU tellingconfocale microscopie
Porphyromonas gingivalis als modelorganisme voor het beoordelen van Interactie van anaërobe bacteriën met gastheercellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.