Water in olie emulsies: Een nieuw systeem voor het samenstellen van water-oplosbare-Chlorophyll bindende eiwitten met Pigmenten Hydrofobe

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft een eenvoudige en high-throughput werkwijze voor het samenstellen in water oplosbare eiwitten met hydrofobe pigmenten die is gebaseerd op water-in-olie-emulsies. We tonen de effectiviteit van de werkwijze voor de assemblage van natieve chlorofyl vier varianten van recombinant water oplosbare chlorofyl-bindende eiwitten (WSCPs) van Brassica planten tot expressie gebracht in E. coli.

Samenvatting

Chlorofyl (Chls) en bacteriochlorofylen (BChls) zijn de primaire co-factoren die fotosynthetische licht oogsten en elektron transport uit te voeren. Hun functionaliteit kritisch afhankelijk van hun specifieke organisatie in grote en ingewikkelde multisubunit transmembraaneiwit complexen. Om te begrijpen op moleculair niveau hoe deze complexen vergemakkelijken zonne-energie conversie, is het essentieel om eiwit-pigment en pigment pigment-interacties en hun effect op opgewonden dynamiek begrijpen. Een manier van het verkrijgen van een dergelijk begrip is door de aanleg en het bestuderen van complexen van Chls met eenvoudige water oplosbare recombinante eiwitten. Echter, waarin de lipofiele Chls en BChls in water oplosbare eiwitten is moeilijk. Bovendien is er geen algemene methode, die kan worden gebruikt voor montage van in water oplosbare eiwitten met hydrofobe pigmenten. Hier tonen we een eenvoudige en high throughput systeem op basis van water-in-olie emulsies, die mogelijk maakt assembly van in water oplosbare eiwitten met hydrofobe Chls. De nieuwe werkwijze werd gevalideerd door het samenvoegen van recombinant versies van de in water oplosbare chlorofyl bindingeiwit Brassicaceae planten (WSCP) met een Chl. We tonen de succesvolle montage van Chl een met behulp van ruwe lysaten van WSCP uitdrukken E. coli cellen, die kunnen worden gebruikt voor het ontwikkelen van een genetische screen voor nieuwe wateroplosbare Chl-bindende eiwitten en voor studies van Chl-eiwit interacties en assemblageprocessen.

Inleiding

Hydrofobe pigmenten zoals chlorofyl (Chls), bacteriochlorofylen (BChls) en carotenoïden zijn de primaire co-factoren in fotosynthetische reactie centra en lichte harvesting eiwitten die elektronentransport, en licht energie op te vangen en de overdracht uit te voeren. Het reactiemengsel centra en de meeste van de Chl-bindende light harvesting complexen transmembraan eiwitten. De Fenna-Matthews-Olson (FMO) eiwit van niet-oxygenic fotosynthetische groene zwavel bacteriën ^1,2, en de peridinin-Chl eiwit (PCP) van dinoflagellaten ³ zijn uitzonderlijke voorbeelden van water oplosbare licht harvesting eiwitten. De in water oplosbare chlorofyl bindende eiwitten (WSCPs) van Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae en Amaranthaceae installaties ^{4, 5} zijn een uniek voorbeeld, maar in tegenstelling tot FMO en PCP, deze zijn niet betrokken in light harvesting of in een van de primaire fotosynthetische reactie , en hun precieze physiological functies zijn nog onduidelijk ^5-8. Hun hoge Chl-bindingsaffiniteit hebben geleid tot een voorgestelde functie als tijdelijke dragers van Chls Chl en derivaten ^9,10. Als alternatief werd de hypothese dat WSCP speelt een rol in het wegvangen Chls in beschadigde cellen en beschermt tegen Chl-geïnduceerde oxidatieve schade ^7,11-13. Recenter werd gesuggereerd dat WSCP functioneert als een proteaseremmer en speelt een rol bij herbivore weerstand en reguleert celdood bij bloemontwikkeling ^14. WSCPs worden onderverdeeld in twee hoofdklassen volgens hun fotofysische eigenschappen. De eerste klasse (klasse I, bijv. Uit Chenopodium album) kan photoconversion ondergaan bij belichting. II WSCPs van Brassica planten, die niet photoconversion ^5,10 ondergaan, worden verder onderverdeeld in klasse IIa (bijv., Uit Brassica oleracea, Raphanus sativus) en IIb (bijv., Van Lepidium virginicum ). De structuur van de klasse IIb WSCP van Lepidium virginicum werd opgelost door röntgenkristallografie bij 2,0 Å resolutie ^8. Het openbaart een symmetrische homotetrameer waarin het eiwit subeenheden vormen een hydrofobe kern. Elke subeenheid bindt één Chl die resulteert in een strakke regeling van vier dicht opeengepakte Chls binnen core.This eenvoudige all Chl opstelling maakt WSCPs een nuttig model voor het bestuderen binding en assemblage van Chl-eiwitcomplexen, en de effecten van aangrenzende Chls en eiwit omgevingen op de spectrale en elektronische eigenschappen van individuele Chls. Bovendien kan het sjablonen voor het construeren van kunstmatige Chl-bindende eiwitten die kunnen worden gebruikt voor lichte oogsten modules in kunstmatige fotosynthetische nicatieapparatuur.

Rigoureuze studies van natief WSCPs niet haalbaar omdat de complexen gezuiverd uit planten een heterogeen mengsel van tetrameren met verschillende combinaties van een Chl bevatten altijden Chl b ^9. Aldus wordt een werkwijze voor het assembleren van recombinant tot expressie WSCPs met Chls in vitro vereist. Dit wordt uitgedaagd door de verwaarloosbare wateroplosbaarheid van Chls waardoor het onmogelijk om het complex in vitro assembleren door eenvoudig mengen van het wateroplosbare apoproteins met pigmenten in waterige oplossingen. In vitro assemblage door mengen van de apoproteïnen met thylakoïdmembranen ¹⁵ werd aangetoond, maar deze methode wordt beperkt tot de natieve Chls in de thylakoiden. Schmidt et al. rapporteerde over het monteren van een aantal Chl en BChl derivaten met WSCP van bloemkool (CaWSCP) door recombinant expressie brengen van een histidine-tag eiwit in E. coli immobiliseren deze op een Ni-affiniteitskolom en invoering Chl derivaten opgelost in ¹¹ detergentia. Succesvol reconstitutie van recombinant WSCPs van A. thaliana ^6, en spruitjes (BoWSCP), Japans wilde radijs (RshWSCP) eend Virginia pepperweed (LvWSCP) op een dergelijke manier werden ook gemeld.

Hier presenteren we een nieuwe, algemene, eenvoudige werkwijze voor het assembleren Chls met WSCP die geen tagging vereist of immobiliseren van de eiwitten. Het berust op het bereiden van emulsies van de waterige oplossingen van de wateroplosbare apoproteïnen in minerale olie. De eiwitten worden aldus ingekapseld in water-in-olie (W / O) microdruppeltjes met zeer hoog oppervlak volumeverhouding ^16. De hydrofobe cofactoren worden vervolgens opgelost in de olie en worden gemakkelijk geïntroduceerd in de druppeltjes van de oliefase. We rapporteren volgens de werkwijze voor het samenstellen van verschillende varianten van WSCP apoproteïnen recombinant tot expressie gebracht in E. coli met Chl a. We tonen het samenstel uit ruw lysaat van WSCP overexpressie bacteriën die kunnen worden gebruikt als een screening voor de ontwikkeling van nieuwe Chl eiwitten.

Protocol

1. Voorbereiding Chl a Stock Solutions

1. Kritische stap: Voer alle stappen van chlorofyl voorbereiding in een chemische kap, onder groen licht (520 nm) of in het donker om photodamage een minimum te beperken. Voeg altijd stikstof of argon voor het bevriezen van de pigmenten voor opslag. Zorg ervoor dat alle oplosmiddelen zijn analytische kwaliteit.
2. Weeg ongeveer 5 mg gelyofiliseerde Spirulina platensis cellen of andere cellen die slechts cyanobacterie Chl een in thylakoïdmembranen doppen en met een mortier en stamper.
3. Laad gebroken cellen op een glazen kolom en was met ongeveer 50-100 ml 100% aceton om carotenoïden te verwijderen. Gooi de geëlueerde oranje / groene fractie.
   Opmerking: Als de oranje fractie niet wordt geëlueerd met 100 ml aceton blijven de cellen te wassen met aceton tot de groene fractie begint te elueren.
4. Exchange aceton met 100% methanol en laat de groene fractie die een Chl. Het volume geëlueerd fraction kan variëren tussen 50-100 ml. In het begin, de geëlueerde fractie een donkergroene kleur, die verandert in lichtgroen eind elutie. Wanneer de kleur geëlueerde fractie verandert in lichtgroen stopt de elutie.
5. Damp de methanol met een rotatieverdamper totdat het extract volledig droog. Heeft warmte niet van toepassing zijn op de oplossing; waarborgen dat de verdamper waterbad temperatuur niet boven 30 ° C.
   Opmerking: De tijd van verdamping is afhankelijk van de hoeveelheid methanol fractie verdampt en variabel tussen 10-60 min. Het is belangrijk om het extract drogen.
6. Lossen de pigmenten van de droge stof in een klein volume diethylether (ongeveer 5-10 ml) en gefiltreerd door watten. Zorg ervoor dat de pigmenten volledig voordat filtering worden opgelost in ether.
7. Damp de diethylether totdat de pigmenten zijn volledig droog (10-30 min).
   Opmerking: De droge pigmenten kan worden gespoeld met en onder stikstof of argon gehouden op -20 ° C, in het donker totdat zij worden verwerkt.
8. Los de droge pigmenten in het kleinst mogelijke volume van 100% methanol (ongeveer 1 ml), zelfs indien niet alles volledig is gesuspendeerd. Voeg 4 ml aceton aan de oplossing en veeg het glas voorzichtig om de pigmenten volledig op te lossen.
9. Met een Pasteur-pipet, plaatst het monster voorzichtig op een kolom van DEAE SEPHAROSE geëquilibreerd in 100% aceton.
10. Elueer carotenoïden (een oranje-gele band) met 100% aceton. Dan, elueren Chl een (groene band) met 3: 1 v / v aceton / methanol mengsel.
    Opmerking: Het volume aceton en aceton / methanolmengsel is ongeveer gelijk aan de hoeveelheid DEAE SEPHAROSE geladen op de kolom.
11. Verifiëren Chl een zuiverheid dunnelaagchromatografie onder toepassing van een 68: 25: 5: 2 dichloormethaan / n-hexaan / isopropanol / methanol (v / v) mengsel als elutiemiddel ^17.
12. Damp het oplosmiddel met een rotatieverdamper totdat de Chl een volledig droog (10-60 min).
    Opmerking: De droge Chl a kan worden gespoeld met stikstof of argon en onder argonatmosfeer opgeslagen bij -20 ° C in het donker.
13. Bereid Chl een voorraadoplossing door het opnieuw oplossen van het droge Chl een in 2-4 ml 100% ethanol.
    Noot: De extinctiecoëfficiënt van Chl een bij 663 nm 74.400 cm ^{-1 -1} M (83,3 cm ^-1 (mg / ml) ^-1) in ethanol. Een typische stockoplossing moet een OD van 1860 overeenkomend met een concentratie van 25 mM (23 mg / ml) zijn. Toevoegen van 20 ui van deze voorraad tot een emulsie die 5 ml organische fase, en 1 mg WSCP in 1 ml waterige fase resulteert in een mengsel met 10-voudige molaire overmaat van Chl a vs. WSCP.

2. Voorbereiden Organische fase van de emulsie

Opmerking: De organische fase van de emulsie bestaat uit minerale olie die 4,5% (v / v) Span 80 en 0,4% (v / v) Tween 80.

1. Weeg in een 50 ml buis 0,2 g Tween 80, 1,8 g Span 80 en 38 g minerale olie. Meng goed alle componenten en afkoelen op ijs.
   Opmerking: De organische fase kan in 4 ° C worden bewaard tot een week.

3. bereiding van de waterige fase van de emulsie

Opmerking: De waterfase van de emulsie kan zijn samengesteld uit ofwel gezuiverd WSCP of ruwe extract van bacteriën tot overexpressie WSCP.

1. Het voorbereiden van een waterige fase die gezuiverde WSCP.
   1. Kweek E. coli BL21 bacteriën bevattende WSCP plasmide ¹² in 1 liter LB-medium bij 37 ° C tot OD van 0,3-0,6.
   2. Induceren eiwitexpressie door toevoeging van 1 mM IPTG. Na inductie bacteriën groeien bij 30 ° C gedurende 12-16 uur.
   3. Oogst bacteriën door centrifugeren bij 5000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
   4. Los de pellet in bindingsbuffer en ultrasone trillingen op ijs (30 sec op 15 sec off, vijf keer). Gebruik 10 ml buffer voor de pellet verkregen door centrifugeren van 250 mlLB-medium met overexpressie van het eiwit.
      Opmerking: Afhankelijk van de zuiveringswerkwijze kan het bindende buffer samengesteld uit 100 mM fosfaatbuffer, pH 7,2 of 50 mM Tris, pH 7,5, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA.
   5. Spin down het cellysaat bij 12.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C.
   6. Zuiver WSCP door affiniteitschromatografie. Afhankelijk van het label gefuseerd aan WSCP, zuiveren recombinante eiwitten onder toepassing van de geschikte commercieel verkrijgbare affiniteitschromatografie voor eiwitzuivering volgende instructies van de fabrikant.
   7. Voor emulsiebereiding Gebruik gezuiverd WSCP in 50 mM fosfaatbuffer, pH 7,8. Zorg ervoor dat de uiteindelijke eiwit bedrag dat wordt gebruikt voor de oplossing is 0,5-1,0 mg per 1 ml buffer.
2. Het voorbereiden van een waterige fase die ruwe bacteriële lysaat met WSCP.
   1. Kweek E. coli BL21 cellen bevattende plasmide dat WSCP in 250 ml LB-medium bij 37 ° C tot OD 0,3-0,6.
   2. Induceren eiwit expressie met1 mM IPTG en groei van bacteriën overnacht bij 30 ° C.
   3. Oogst bacteriecellen door centrifugeren bij 5000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
   4. Los het pellet in 1-2 ml 50 mM natriumfosfaatbuffer pH 7,8, ultrasone trillingen (30 sec op, 15 seconden af, drie keer) en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C.
   5. Bereid de waterfase van de emulsie door mengen 0,125 ml supernatant met 0,875 ml van 50 mM natriumfosfaatbuffer pH 7,8.

4. Montage van WSCP met Chl een in Emulsion

1. Transfer 5 ml olie-oppervlakteactieve mengsel in een glazen flesje en afkoelen op ijs. Voordat pipetteren, controleren of alle componenten van de organische fase grondig gemengd en er geen fasescheiding tussen oppervlakteactieve stoffen en minerale olie.
2. Voeg 1 ml ijskoude waterige fase bereid zoals in hoofdstuk 3-5 ml organische fase.
3. Meng beide fasen met een tissue homogenisator gedurende 2 minuten bij 9500 rpm op ijs.
4. Kritische stap: Uit deze fase op, voeren alle verdere stappen onder groen licht (520 nm) om photodamage een minimum te beperken. Voeg 20 ul van 25 mM Chl een voorraad-oplossing (zie paragraaf 1.13) aan de emulsie. Verspreiden door de knop en het omkeren van de glazen flacon. Zorg ervoor dat de Chl gelijkmatig wordt verdeeld in de emulsie.
5. Incubeer de emulsie gedurende 1-2 uur op ijs in het donker.
6. Om breken de emulsie en afzonderlijke druppeltjes van de organische fase overdracht van de emulsie 1,5 ml plastic buizen en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   Opmerking: Als de assemblage succesvol is, moet de onderste waterfase een groene kleur hebben.
7. Gooi de bovenste oliefase en voeg 1 ml van minerale olie. Meng goed de minerale olie met het ingehulde emulsie door vortex of door het wegknippen van de buis grondig. Spin down het monster bij 14.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal deze stap tot een heldere meniscus het scheiden van de waterige en mijnwerkeral oliefase, zonder enige intermediaire emulsie wordt verkregen.
8. Voer deze stap in een chemische kap. Nadat de waterige en oliehoudende fasen duidelijk gescheiden, mineraal- olie en voeg 1 ml met water verzadigde diethylether. Vortex en spin neer het monster bij 14.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal deze stap twee keer.
9. Na de tweede centrifugeren, verwijder de diethylether en laat de buizen geopend voor 5-20 min in de kap.
10. Tenslotte plaatst de waterige fase die het WSCP / Chl complex op een ontzoutingskolom en elueer met buffer geschikt voor verdere experimenten.
    Opmerking: Het eiwit is stabiel in Tris buffers fosfaten in een breed pH (6,0-7,5). Het monster kan worden opgeslagen bij 4 ° C beschermd tegen licht maximaal een maand.

Resultaten

Recombinante WSCP apoproteins werden geassembleerd met Chl in een W / O-emulsies volgens de in de vorige paragraaf beschreven protocol. Het protocol werd uitgevoerd met behulp waterfasen dat hetzij zuiver WSCPs of lysaten E.coli overexpressie WSCP (figuur 1). Het protocol is eenvoudig, snel en vereist geen speciale apparatuur nodig, behalve een tissue homogenisator.

De absorptie en CD spectra...

Discussie

Ons doel was om een ​​nieuw algemeen stelsel samenstel van in water oplosbare chlorofyl-bindende eiwitten met hydrofobe pigmenten ontwikkelen. Hier wordt aangetoond dat de nieuwe reconstructie op basis van W / O-emulsie is een algemene benadering bewezen te werken voor de montage WSCP apoproteïnen van spruitjes, bloemkool, Japanse mierikswortel en Virginia pepperweed recombinant tot expressie gebracht in E. coli. Hier resultaten gepresenteerd van reconstitutie van 1 mg WSCP met 10-voudige molaire overmaat van <...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Mineral oil	Sigma	M5904
Span80	Sigma	85548
Tween80	Sigma	P8074
Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges	Bio Rad	10011164	Affiniteitschromatografie voor WSCP-zuivering met native sequentie.
His Trap HF column	GE Healthcare Life Science	17-5248-02	Affiniteitschromatografie voor WSCP-zuivering met His-tag
DEAE Sepharose Fast Flow	GE Healthcare Life Science	17-0709-01	Chromatografiemedium voor chlorophyll-zuivering