Methodenartikel

Optimalisatie van de wond Scratch Assay om veranderingen in muizen mesenchymale Stromal Cell Migratie Detect Na Schade door Oplosbare sigarettenrook Extract

DOI:

10.3791/53414

⸱

3 december 2015

 ,  ,  , 
1Department of Biology, College of the Holy Cross

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het vermogen om te migreren is een belangrijke functie van veel verschillende celtypen, inclusief mesenchymale stromale cellen (MSC's). Het kwantificeren van veranderingen in migratievermogen na schade is echter een uitdaging. Dit protocol beschrijft een eenvoudig aanpasbare migratietest die rigoureuze statistiek gebruikt om veranderingen in het migratievermogen van MSC's na schade te kwantificeren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celmigratie is essentieel voor veel fysiologische en pathologische processen, waaronder weefselontwikkeling, reparatie en regeneratie, kankermetastasen en ontstekingsreacties. Gezien de huidige interesse in de rol van mesenchymale stromale cellen bij het mediëren van weefselreparatie, zijn we geïnteresseerd in het kwantificeren van het migratievermogen van deze cellen en het begrijpen hoe het migratievermogen kan veranderen na schade. Optimalisatie van een rigoureus kwantitatief migratie-assay dat zowel gemakkelijk aan te passen als kosteneffectief is om uit te voeren, is de sleutel tot het beantwoorden van vragen over veranderingen in celmigratie als reactie op verschillende stimuli. Huidige methoden voor het kwantificeren van celmigratie, inclusief scratch assays, trans-well migratie-assays (Boyden kamers), micropillar arrays en cel-uitsluitingszone-assays, hebben een reeks beperkingen in reproduceerbaarheid, aanpasbaarheid, kwantificering en kosteneffectiviteit. Ondanks het prominente gebruik, wordt de scratch assay geconfronteerd met problemen met betrekking tot reproduceerbaarheid die verband houden met schade aan de celmicro-omgeving, belemmeringen voor celmigratie, invloed van naburige senescerende cellen en celproliferatie, evenals een gebrek aan rigoureuze kwantificering. De hier beschreven geoptimaliseerde scratch assay toont robuuste resultaten, meetbare en beeldgebaseerde analysemogelijkheden, kosteneffectiviteit en aanpasbaarheid aan andere toepassingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celmigratie is sterk gecoördineerde en essentieel voor vele fysiologische processen zoals weefselontwikkeling, herstel en regeneratie, alsook pathologische processen zoals kanker metastase en arteriosclerose 1. Inzicht in celmigratie is bijzonder relevant voor nieuwe therapieën gebruikt om beschadigde weefsels te herstellen en te behandelen pathologische aandoeningen, waaronder celtransplantatie technologieën en kunstmatige weefsel enten 2. Gezien de huidige interesse in de rol van mesenchymale stromale cellen (MSC's) bij het ​​mediëren van weefselherstel 3, kwantificeren het trekkende vermogen van deze cellen met behulp van een test die is rigoureus kwantificeerbaar, flexibele en kosteneffectieve van belang. Belangrijk is dat dergelijke test voldoende gevoelig relatief subtiele veranderingen in de cellulaire trekkende capaciteit sporen na schade. De huidige methoden voor het kwantificeren van cel migratie, waaronder scratch assays, trans-en migratie assays (Boyden chAmbers), micropillar arrays, en mobiele uitsluiting zone assays beschikken over een reeks van beperkingen in de reproduceerbaarheid, aanpasbaarheid, kwantificering en kosten-effectiviteit 1,4,5. De geoptimaliseerde scratch test hier beschreven toont robuuste resultaten, meetbare en image-based analysemogelijkheden, kosteneffectiviteit en aanpassingsvermogen aan andere toepassingen.

Scratch assays werden gebruikt in verschillende capaciteiten voor celmigratie en proliferatie onder verschillende experimentele condities 5 evalueren. De bepaling houdt in het enten van de aangewezen cellen groeien ze of nabij confluentie voltooien en krassen op de resulterende monolaag met een steriele naald of een pipet tip 6. Analyse wordt meestal uitgevoerd door vergelijking van de breedte van de kras over meerdere tijdstippen op willekeurig gekozen plaatsen 7-9. Ondanks zijn prominente gebruik wordt de scratch test verstoord door problemen met reproduceerbaarheid en kwantificering. Variabiliteit ingenereren van de kras niet alleen verandert de micro-omgeving van de cellen, maar ook celmigratie belemmeren door beschadiging van het plaatoppervlak en de onderliggende extracellulaire matrix 5. Assays worden vaak uitgevoerd in 7-12 uur, maar voor cellijnen weergeven langzamere migratie en langere testtijden, proliferatie wordt een verstorende variabele 7,10. Ten slotte kan verouderde cellen gegenereerd door het krassen procesfactoren die interfereren met de extracellulaire signalering nodig is om het verschil in de monolaag 1 vrijgeven. Het optimaliseren van de scratch test vereist creëren van een consistente kloof die niet interfereert met de oppervlakte-eigenschappen, het minimaliseren assay tijdsduur en het voorkomen van ongewenste celdood tijdens de manipulatie. De stop gebaseerde test is een optimalisatie van een cel verboden zone assay. Deze test maakt gebruik van een stop in het midden van de put die celgroei uitsluit, maar laat de cellen worden geplateerd om de centrale verboden zone.Om migratie te beoordelen, wordt de stop verwijderd, en de daaruit voortvloeiende uitsluiting zone biedt een oppervlak voor de migratie te voorkomen. Echter, deze test moeilijk te passen of aan te passen 10 en voor sommige toepassingen, kan deze techniek ook hoge kosten.

In tegenstelling tot nul assays en derivaten daarvan, trans-well migratie assays (of Boyden kamer assays) beoordelen migratie door het kwantificeren van het aantal cellen die van de ene kamer door een microporeus filter membraan, in een kamer die chemotactische 8,11, 12. Deze techniek heeft nut beperkt hechtende cellen zoals MSCs omdat na migratie door het poreuze membraan, de cellen hechten aan de membraanzijde blootgesteld aan de chemotactische middelen en kan moeilijk nauwkeurig te kwantificeren. Terwijl de test is in staat om een driedimensionale migratiepatronen onderzoeken de beperkte cel typen waarvoor zij kan celmigratie grens zijn nut nauwkeurig kwantificeren 10. Een ander alternatief nul assays maakt gebruik van een micro-pijlers array, die cellulaire motiliteit gemeten door een driedimensionale ruimte met behulp van het vermogen van cellen te vervormen en migreren in de array als een surrogaat. Polydimethlysiloxane (PDMS) elastomeren genezen over een precieze vorm en behandeld met ozon en fibronectine produceert een homogene en niet-afbreekbare micro-omgeving. Afstand micro-pijlers kan ook worden gevarieerd als nodig is om het vermogen van cellen om de matrix 4 voer te meten. De mal wordt gecreëerd door diepe reactief ion etsen van siliciumschijven een negatieve versie van de high-aspect-ratio-array 13 te creëren. Terwijl de test wordt versterkt door de aanpasbaarheid, vermogen modelleren driedimensionale migratie en analyse door directe visualisatie van migrerende cellen, moeilijk maken micro-pijlers arrays economisch belemmert het wijdverbreide gebruik.

De geoptimaliseerde scratch test beschreven in dit protocol zorgt voor een efficiënte, cost-effectieve methode voor het produceren van consistente krassen die kunnen worden geanalyseerd met vrij beschikbare software. In plaats van eenvoudige breedte metingen over de scratch voor en na celmigratie, de software stelt de gebruiker in staat om totale scratch gebieden te bepalen vóór en na de migratie. Deze vooruitgang beperkt de kwestie van het proberen om te bepalen waar de kras de breedte metingen moeten worden genomen, en of de breedte van de kras is uniform langs zijn totale lengte. Bovendien is een zorgvuldige optimalisatie van celaantallen, celconfluentie en het type en de mate van schade toegebracht aan de cellen behandeld om verdere optimalisatie van de assay.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: Voor deze studie, long mesenchymale stromacellen (LR-MSC's) vanaf het distale longweefsel werden geïsoleerd hetzij op basis van hun expressie van celoppervlak merkers (CD45 negatieve, CD31 neg, Sca-1 hoog EpCAM neg) 14,15 behulp explant out-groei van 16, of met behulp van enzymatische vertering 17. Hechtende LR-MSC's werden gekweekt in DMEM met hoge glucose en geen glutamine, 15% FBS, 1 x antibioticum / antimycoticum en 2 mM glutamine (voortaan compleet medium) en geïncubeerd bij 37 ° C, 5% CO2. LR-MSCs werden 3-4 keer gepasseerd om een ​​populatie van cellen te verzekeren relatief homogene groei kenmerken van de migratie assay.

1. Het voorbereiden van een Confluent Monolayer

  1. Om MSCs van standaard 100 mm kweekschalen los, wassen cellen met 10 ml 37 ° C voorverwarmde PBS, zuig het PBS en voeg 4 ml trypsine (0,25%). Incubeer 3-5 min in een 37 ° C incubator. Zuig de cells in een conische buis, voeg gelijk volume compleet medium en centrifugeer bij 300 g gedurende 5 min om pellet de cellen af.
    Opmerking: Langere incubatie in trypsine kan het celoppervlak receptoren veranderen en mogelijk invloed migratie.
  2. Zuig media en resuspendeer cellen in verse volledige media. Tellen cellen, met uitzondering van dode cellen met behulp van trypan blauw exclusie en plaat 500.000 mesenchymale stromale cellen in 4 ml van volledig medium op een 60 mm celkweek schaal.
    Opmerking: Afhankelijk van de bron van de cellen, kunnen tests noodzakelijk zijn om het optimale aantal cellen nodig te bepalen.
  3. Incubeer de cellen tot platen 90% confluent optimale celhechting en proliferatie, gewoonlijk 48-72 uur voor MSCs.
    Opmerking: 100% samenvloeiing is niet aan te raden, omdat veel verankering-afhankelijke cellen ervaring contact inhibitie, die hun trekkende capaciteit kunnen veranderen. Platen met minder dan 80% confluentie leiden tot onbruikbare's omdat de beeldanalyse software gap interpreterens tussen cellen als deel van de omtrek van de kras (zie figuur 1D).
  4. Nadat de cellen 90% samenvloeiing hebben bereikt, schade aan de cellen afhankelijk van de toepassing. Tot cel schade na blootstelling aan oplosbare sigarettenrook extract (CSE) te beoordelen, het genereren van 100% CSE door het tekenen van de rook van 1 Universiteit van Kentucky onderzoek sigaret (3R4F) tot en met 25 ml van complete media in een Büchner kolf meer dan 2 min 18.
  5. Incubeer de cellen gedurende 24 uur in 4 ml 1-4% CSE verdund in volledige media. Na incubatie was de cellen tweemaal met 4 ml warme steriele PBS alvorens te vervangen door 4 ml vers compleet medium.
    Opmerking: Beschadiging cellen met hoge concentraties van sigarettenrook extract (> 5%) kunnen aanzienlijk verminderen samenvloeiing.

2. Het creëren van de Scratch

  1. In een steriele omgeving, verwijder dan het deksel van de 60 mm plaat van beschadigde MSC's, en leggen een rechte rand (bijvoorbeeld een gesteriliseerde kunststof liniaal) across de bovenrand van de plaat. Zonder het verwijderen van de media, een steriele 200 ul pipet tip geleid door de steriele straight-edge om 03:59 parallelle krassen over de plaat van ongeveer 5 mm van elkaar en 50 mm lang.
    Opmerking: Een rechte rand minimaliseert de hoeveelheid rotatie-aanpassingen die nodig zijn om de plaat wanneer het op de microscoop podium. Het is noodzakelijk dat de krassen verschijnen volledig verticale (of horizontale) op het scherm. Het genereren van meerdere krassen op een 60 mm plaat neemt niet weg micro zodanig dat celmigratie (data niet getoond) treft, maar kan ook voor andere celtypen. Het gebruik van kleinere putjes wordt niet aanbevolen aangezien de variabiliteit van groeiende cellen nabij de rand van de put wordt meer uitgesproken en kunnen uniform generatie krassen beïnvloeden.
  2. Zuig het medium en voorzichtig wassen van de platen met 2 ml voorverwarmde compleet medium aan cellen voorkomen hechten aan het midden van de kras en naar cel verwijderens die zijn losgemaakt door het krassen. Vervangen door 4 ml vers compleet medium.
  3. Met behulp van een steriele permanent marker, labelen elke kras 1-4 aan de onderzijde van de plaat op de locatie die niet zal bemoeien met de beeldvorming van de krassen.
    Opmerking: Het is belangrijk dat beelden van dezelfde nul vergeleken vóór en na de migratie, omdat er variatie scratch breedte kan worden.

3. Rekening Eerste Beelden van de Scratch

Opmerking: Als de scratch test wordt uitgevoerd op meerdere platen, wordt aanbevolen dat de eerste beelden van de krassen op een enkele plaat worden genomen voordat krassen worden gemaakt op de volgende plaat.

  1. Gebruik een omgekeerde fase contrast microscoop met een camera nodig zijn om de beelden voor analyse te genereren.
  2. Plaats de cultuur plaat op de microscoop, en gebruik de laag vermogen doelstelling (10X) op peil te lokaliseren # 1. Als condensatie op het deksel van de cultuur plaat een duidelijk imag belemmerte van de cellen, gebruik maken van een verwarmd podium set tot 37 ° C.
  3. Houd de kras volledig horizontaal en in het midden van het gezichtsveld verkrijgen zoveel als nodig is om beelden omvatten 90% van de lengte van de kras is. Verkrijgen beelden van de verschillende delen van de kras met geen overlap tussen de beelden.
    Opmerking: De lichtbreking aan de randen van de kweekschaal overbelicht afbeeldingen, waardoor ze onmogelijk te analyseren. Daarom niet beelden te nemen van de eerste en de laatste 5% van de lengte van de scratch's.
  4. Afbeeldingen vanaf elke kras in een aparte map.
  5. Herhaal stap 3,2-3,4 voor krassen 2, 3 en 4.
  6. Terugkeer platen in de incubator onmiddellijk na de eerste imaging. Laat cellen migreren 4-7 uur.
    Opmerking: 7 uur is optimaal bij de beoordeling van MSC's beschadigd met CSE. Incuberen van de cellen gedurende meer dan 7 uur wordt niet aanbevolen omdat celproliferatie kan fungeren als een verstorende variabele celmigratie (zie optionele opmerking 8,2 hieronder).
4. Het analyseren van Initial Scratch Afbeeldingen

  1. Download ImageJ en installeer de Wound Healing Tool plugin (zie de tabel van Materialen / Equipment).
  2. Open het beeldbestand in ImageJ, klik op "Process" en "Find Edges" om de cellen rond de scratch voor de Wound Healing Tool om de scratch gebied (Figuur 2B) te berekenen markeren. Vervolgens klikt u op "Beeld", "aanpassen", "Color Threshold" en in het dropdown menu label "Threshold Kleur" verander de waarde naar "B & W."
  3. In het menu "Color Threshold", passen zowel helderheid drempel schuifjes tot een optimaal contrast tussen de nul en cel voorzijde wordt bereikt. Met het oog op de grootste bereik wanneer het proberen om het contrast in het beeld te creëren, beweegt de onderste schuif helemaal naar rechts (volledig zwart beeld), en daarna pas de bovenste schuifknop om maximaal contrast te genereren.
  4. Langzaam aan te passen de top brightness schuifregelaar van links naar rechts totdat het beeld verschijnt netjes de contour van de scratch (figuur 2C). Zodra de randen van de kras zijn geïdentificeerd, klikt u op "More Tools" in de werkbalk ImageJ, selecteer "MRI_Wound_Healing_Tool" uit het dropdown menu, en druk op de "M" knop (die zal verschijnen in de werkbalk ImageJ) om de scratch gebied markeren en de output van de berekende gebied in een resultaten pop-out-venster (Figuur 2D).
  5. Kopieer en plak alle nummers uit de resultaten (Figuur 2E) in een Excel-spreadsheet. Zorg ervoor dat u de gegevens van individuele krassen scheiden.

5. Met Final Beelden van de Scratch

  1. Nadat de cellen zijn gemigreerd (4-7 uur) Herhaal stap 3,2-3,4. Afbeelding de platen in de volgorde waarin ze werden bekrast zodat cellen op elke plaat evenveel tijd te migreren hebben gehad.
    Opmerking: De cellen kunnen worden afgebeeld op verschillende tijdstippen, afhankelijk van de Sensiteit voor zowel temperatuur als pH-veranderingen. Als alternatief kan live cell imaging gebruikt om de cellen te volgen in real-time als ze migreren.

6. Het analyseren van Final Scratch Afbeeldingen

  1. Herhaal stap 4,2-4,5 voor de uiteindelijke scratch beelden.

7. Berekening van de Scratch gebied van migratie Kwantificeer

  1. Bereken het gemiddelde pre-migratie gebied door het middelen van de beginstrook waarden van de respectievelijke krassen.
  2. Bereken de totale migratie door het aftrekken van de uiteindelijke migratie oppervlak per beeld, berekend in stap 6, de gemiddelde pre-migratie gebied (stap 7,1). Genereer een lijst met waarden voor elke kras die de verandering in de migratie.
  3. Verzamel de gegevens van meerdere krassen van dezelfde testgroep (alle borden en al krassen cellen blootgesteld aan 0% CSE). Gebruik een variantie analyse test om de verschillen tussen de experimentele groepen te analyseren.
  4. Als de cellen langzaam migrerenen vereisen een langere incubatietijd na krabben (meer dan 10-12 uur), voeren een BrdU incorporatie assay of EDU 19 om te bepalen of cellen zij enige proliferatie tijdens de periode waarin de assay migratie optreedt. Kies een migratie assay tijd om significante celproliferatie te voorkomen.

8. Optioneel

  1. Om te beoordelen of significant celsenescentie optreedt als gevolg van het krassen procedure, voert een senescentie-geassocieerde beta-galactosidase test op een proefplaat op vooraf bepaalde tijdstippen na 19 krabben.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De scratch assays hier gepresenteerde werden uitgevoerd met muizen long inwoner mesenchymale stromale cellen (LR-MSC) en geïsoleerd zoals genoemd in het protocol toelichting. De LR-MSC's werden geënt bij een dichtheid van 500.000 cellen in een 60 mm weefselkweekplaat en gekweekt tot 90% confluentie in 48 uur. Om schade te genereren, 4% CSE (hierboven beschreven) werd geïncubeerd met de cellen gedurende 24 uur na de initiële zaaien maar vóór de scratch test. Voor elke test werd de scratch gegenereerd met behulp van e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier beschreven protocol voorziet in een kwantitatief robuuste, gestandaardiseerde methode om te presteren en scratch testen analyseren. Eenvoudige scratch testen worden routinematig gebruikt in veel verschillende gebieden van onderzoek om cellulaire migratie te onderzoeken. Echter, van oudsher de kras test is een gestandaardiseerde set-up en kwantificering protocol, wat heeft geleid tot problemen met reproduceerbaarheid 7,10 ontbrak. Veel van de wijzigingen en optimalisaties voor de verbetering van de scr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zijn de andere leden van het lab dankbaar voor hun technische assistentie bij het ontwikkelen van de CSE-schadetest, en hun ondersteuning en advies tijdens de ontwikkeling van deze test. Bovendien zijn we de Holy Cross Fenwick Scholar Committee dankbaar voor hun ondersteuning van Nicholas Cormier, en het Holy Cross College Honors programma voor hun ondersteuning van Alexander Yeo.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DMEM (high glucose, no added glutamine)Life Technologies31053-036
Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyCloneFisher ScientificSH3091002
Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone Fisher ScientificSV3007901
Glutamine, 200 mM, Thermo Scientific HyCloneFisher ScientificSH3003401
TypeLE cell dissociation reagentLife Technologies12563-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone Fisher ScientificSH3002802
Falcon standard 60 mm tissue culture dishesFisher Scientific08-772B
Fisherbrand Sterile 200 μl pipet tipsFisher Scientific02-707-502
Inverted light microscope with camera attachmentVariable
ImageJ software http://imagej.nih.gov/ij/
MRI_Wound_Healing pluginhttp://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool
Statistical analysis softwareMicrosoft Excel

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gough, W., Hulkower, K. I., Lynch, R., et al. A quantitative, facile, and high-throughput image-based cell migration method is a robust alternative to the scratch assay. J. Biomol. Screen. 16 (2), 155-163 (2011).
  2. Ridley, A. J., Schwartz, M. A., Burridge, K., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2013).
  3. Sharma, R. R., Pollock, K., Hubel, A., McKenna, D. Mesenchymal stem or stromal cells: a review of clinical applications and manufacturing practices. Transfusion. 54 (5), 1418-1437 (2014).
  4. Booth-Gauthier, E. A., Du, V., Ghibaudo, M., et al. Hutchinson-Gilford progeria syndrome alters nuclear shape and reduces cell motility in three dimensional model substrates. Integr. Biol. (Camb). 5 (3), 569-577 (2013).
  5. Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (6), 1554-1559 (2004).
  6. Pinco, K. A., He, W., Yang, J. T. Alpha4beta1 Integrin Regulates Lamellipodia Protrusion Via a Focal Complex/focal Adhesion-Independent Mechanism. Mol. Biol. Cell. 13 (9), 3203-3217 (2002).
  7. Fronza, M., Heinzmann, B., Hamburger, M., Laufer, S., Merfort, I. Determination of the wound healing effect of Calendula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts. J. Ethnopharmacol. 126 (3), 463-467 (2009).
  8. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J. Vis. Exp. (88), (2014).
  9. Walter, M. N., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: an in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Exp. Cell Res. 316 (7), 1271-1281 (2010).
  10. Goetsch, K. P., Niesler, C. U. Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis. Anal. Biochem. 411 (1), 158-160 (2011).
  11. Chung, C. A., Chen, C. Y. The effect of cell sedimentation on measuring chondrocyte population migration using a Boyden chamber. J. Theor. Biol. 261 (4), 610-625 (2009).
  12. Fabbri, M., Bianchi, E., Fumagalli, L., Pardi, R. Regulation of lymphocyte traffic by adhesion molecules. Inflamm. Res. 48 (5), 239-246 (1999).
  13. Saez, A., Ghibaudo, M., Buguin, A., Silberzan, P., Ladoux, B. Rigidity-driven growth and migration of epithelial cells on microstructured anisotropic substrates. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (20), 8281-8286 (2007).
  14. Paxson, J. A., Gruntman, A. M., Davis, A. M., et al. Age Dependence of Lung Mesenchymal Stromal Cell Dynamics Following Pneumonectomy. Stem Cells Dev. 22 (24), 3214-3225 (2013).
  15. McQualter, J. L., Brouard, N., Williams, B., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27 (3), 623-633 (2009).
  16. Hoffman, A. M., Paxson, J. A., Mazan, M. R., et al. Lung-Derived Mesenchymal Stromal Cell Post-Transplantation Survival, Persistence, Paracrine Expression, and Repair of Elastase-Injured Lung. Stem Cells Dev. 20 (10), 1779-1792 (2011).
  17. Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells. PLoS One. 9 (12), e115963(2014).
  18. Chen, L., Ge, Q., Tjin, G., et al. Effects of cigarette smoke extract on human airway smooth muscle cells in COPD. Eur. Respir. J. 44 (3), 634-646 (2014).
  19. Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods Mol. Biol. 371, 21-31 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Mesenchymale stromale cellenImage J analysemurine long MSC sconfluentie optimalisatiekwantitatieve migratiemeting van het krasoppervlakregeneratieve biologie van de long

Gerelateerde artikelen