Experimentele benaderingen om te studeren mitochondriale lokalisatie en functie van een nucleair celcyclus Kinase, Cdk1

Summary

Hier schetsen we hoe we de mitochondriale lokalisatie van een (celcyclus) kinase kunnen bestuderen, en hoe we de sub-mitochondriale locatie evenals potentiële mitochondriale substraten/doelen kunnen bepalen. Gedwongen expressie van eiwitten in de mitochondriën biedt een nuttige tool voor het bestuderen van de functionele consequenties van de mitochondriale lokalisatie van een eiwit van belang.

Abstract

Hoewel mitochondriën hun eigen transcriptionele machinerie bezitten, wordt slechts 1% van de mitochondriale eiwitten gesynthetiseerd binnen het orgaan. De nucleair gecodeerde eiwitten worden in mitochondriën getransporteerd, geleid door hun mitochondriale doelwitsequenties (MTS); echter, een meerderheid van de mitochondriale gelokaliseerde eiwitten mist een identificeerbare MTS. Niettemin biedt het feit dat MTS eiwitten kan instrueren om de mitochondriën binnen te gaan een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van mitochondriale functies van normaal nucleaire en/of cytoplasmatische eiwitten. We hebben recent de celcycluskinase CyclinB1/Cdk1 complex in de mitochondriën geïdentificeerd. Om de mitochondriale functies van dit complex specifiek te bestuderen, waren mitochondriale overexpressie en knock-down van dit complex essentieel zonder interferentie met zijn nucleaire of cytoplasmatische functies. Door CyclinB1/Cdk1 te labelen met MTS, konden we mitochondriale overexpressie van dit complex bereiken om zowel zijn mitochondriale doelen als functies te bestuderen. Door dominant-negatief Cdk1 met MTS te labelen, werd remming van Cdk1-activiteit bereikt, met name in de mitochondriën. Potentiële mitochondriale doelen van het CyclinB1/Cdk1 complex werden geïdentificeerd met behulp van een gel-gebaseerde proteomics aanpak. In tegenstelling tot traditionele 2D gel-analyse, gebruikten we 2-dimensionale verschilgel-elektroforese (2D-DIGE) technologie gevolgd door fosfoproteïnestering om differentieel gefosforyleerde eiwitten in mitochondriale Cdk1 expressiecellen fluorescentielabel te geven. Identificatie van fosfoproteïne vlekken die veranderd waren in wild type versus dominant-negatief Cdk1 dragende mitochondriën onthulde de identiteit van mitochondriale doelen van Cdk1. Ten slotte, om het effect van CyclinB1/Cdk1 mitochondriale lokalisatie in celcyclus progressie te bepalen, werd een celproliferatie assay gebruikt met behulp van een synthetisch thymidine analoog EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) om de cellen te monitoren terwijl ze door de celcyclus gaan en hun DNA repliceren. Alles bij elkaar hebben we een verscheidenheid aan benaderingen gedemonstreerd die beschikbaar zijn om mitochondriale lokalisatie en activiteit van een celcycluskinase te bestuderen. Dit zijn geavanceerde, maar gemakkelijk te volgen methoden die nuttig zullen zijn voor veel celbiologie onderzoekers.

Introduction

In zoogdieren, celcyclus progressie afhankelijk sterk geordende gebeurtenissen gecontroleerd door cyclinen en cycline-afhankelijke kinasen (Cdks) ^1. Via haar cytoplasma, nucleaire en centrosomal lokalisatie, CyclinB1 / Cdk1 is in staat om verschillende gebeurtenissen in mitose zoals nucleaire envelop afbraak en centrosome scheiding ² synchroniseren. CyclinB1 / Cdk1 mitotische cellen beschermt tegen apoptose ³ en bevordert mitochondriale splitsing, een kritische stap voor een gelijke verdeling van mitochondriën de nieuw gevormde dochtercellen ^4.

In prolifererende zoogdiercellen wordt mitochondriale ATP gegenereerd via oxidatieve fosforylering (OXPHOS) machines (elektronentransportketen), dat bestaat uit 5 multi-subunit complexen; complex I - complex V (CI-CV). Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH): ubiquinone oxidoreductase of complex I (CI) is de grootste en minst begrepen van de vijf complexen ^5. Het complex consists van 45 subeenheden, 14 hiervan vormen de katalytische kern. Eenmaal geassembleerd, het complex uit van een L-vormige structuur met een arm uitsteekt in de matrix en de andere arm ingebed in het binnenste membraan ^6,7. Mutaties in CI subeenheden zijn de oorzaak van verschillende mitochondriale aandoeningen ^8. Een functioneel efficiënt CI in OXPHOS vereist niet alleen algemene mitochondriale respiratie ^9, maar ook voor een succesvolle celcyclusprogressie ^10. Het ontrafelen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan het functioneren van deze membraangebonden enzymcomplex in gezondheid en ziekte kan de ontwikkeling van nieuwe diagnostische procedures en geavanceerde therapeutische strategieën mogelijk te maken. In een recente studie, hebben wij gevonden dat de CyclinB1 / Cdk1 complex verplaatst zich in mitochondria in de (Gap 2) G2 / (mitose) M fase en fosforyleert CI subeenheden mitochondriale energieproductie verbeteren, potentieel verhoogde energiebehoefte van cellen tijdens cel offset ¹¹ cyclus. Hier sho wewcase experimentele werkwijzen en strategieën die kunnen worden gebruikt om mitochondriale translocatie van andere nucleaire / cytoplasmatische kinasen bestuderen hun mitochondriale substraten en functionele gevolgen van de mitochondriale lokalisatie middels CyclinB1 / Cdk1 als voorbeeld.

De vaststelling dat de CyclinB1 / Cdk1 complex verplaatst zich in mitochondria als dat nodig was voor de studies van de mitochondriën-specifieke overexpressie en knock-down van dit complex. Mitochondriën-specifieke expressie van eiwitten te bereiken, kan men een mitochondria doelsequentie (MTS) toevoegen aan de N-terminus van het eiwit van belang. Mitochondriën targeting sequenties kan de sortering van de mitochondriale eiwitten in de mitochondria welke gewoonlijk ¹² verblijven. We hebben een 87 base mitochondria targeting sequentie afgeleid van de voorloper van de menselijke cytochroom c oxidase subunit 8A (COX8) gebruikt en gekloond het in Green Fluorescent Protein (GFP) gemerkte CyclinB1 of Red FluorescentEiwit (RFP) gemerkte Cdk1 bevattende plasmiden in frame. Deze methode liet ons toe om te richten CyclinB1 en Cdk1 in de mitochondriën, in het bijzonder het veranderen van de mitochondriale expressie van deze eiwitten zonder dat hun nucleaire zwembad. Door fluorescent tagging deze eiwitten, waren we in staat om hun lokalisatie in real time te volgen. Zo hebben we MTS geïntroduceerd in een plasmide dat RFP-tag dominant negatief Cdk1, wat ons toeliet om specifiek knock down het mitochondriale expressie en functies van Cdk1. Het is essentieel om onderscheid te maken tussen mitochondriale en nucleaire functies van de kinasen die dubbele lokalisaties zoals Cdk1 hebben. Techniek MTS in de N-terminale van deze tweevoudige functionaliteit kinasen biedt een goede strategie die gemakkelijk toe te passen en effectief.

Aangezien Cdk1 is een celcyclus kinase is essentieel voor de voortgang van de celcyclus te bepalen wanneer Cdk1 wordt vertaald in mitochondria. Hiervoor hebben we een nieuwe metho gebruiktd gehalte aan DNA in cellen te volgen. Traditionele werkwijzen omvatten het gebruik BrdU (bromodeoxyuridine), een synthetisch analoog van thymidine, die wordt opgenomen in de nieuw gesynthetiseerde DNA tijdens de S fase van de celcyclus te vervangen thymidine. Vervolgens de cellen die actief replicerend hun DNA kan worden gedetecteerd met behulp van anti-BrdU-antilichamen. Een nadeel van deze werkwijze is dat het denaturatie van DNA toegankelijk voor de BrdU antilichaam verschaffen door scherp methoden zoals zuur of warmtebehandeling, hetgeen kan leiden tot onverenigbaarheid tussen resultaten ^13,14. Als alternatief hebben we gebruik gemaakt van een soortgelijke benadering van het actief delende cellen met een andere thymidine analogon EDU controleren. Edu-detectie vereist geen agressieve DNA denaturatie een zacht reinigingsmiddel behandeling kan de detectie reagens om toegang te krijgen tot de EDU in nieuw gesynthetiseerde DNA. De EDE methode heeft bewezen betrouwbare, consistente en potentieel voor high-throughput analyse ¹⁵ zijn.

Tenslotte, to bepalen de mitochondriale substraten Cdk1, gebruikten we een proteomics tool genaamd 2D-DIGE, die is een verbeterde versie van de klassieke twee-dimensionale gelelektroforese. Tweedimensionale elektroforese scheidt proteïnen op basis van hun iso-elektrisch punt in de eerste dimensie en het molecuulgewicht in de tweede. Aangezien post-translationele modificaties als fosforylatie beïnvloeden het isoelektrisch punt en het molecuulgewicht van de eiwitten, kan 2D gels verschillen tussen fosforylatie status van eiwitten in verschillende monsters te detecteren. De grootte (stippellijn intensiteit) eiwit vlekken verandert met het expressieniveau van eiwitten, waardoor kwantitatieve vergelijking tussen meerdere monsters. Met behulp van deze methode, waren we in staat om de gefosforyleerde eiwitten te onderscheiden in wild-type versus mutant-mitochondriën gerichte Cdk1 tot expressie brengen. De specifieke eiwit plekken die toonde in het wild-type, maar ontbraken in de mitochondriën gerichte mutant Cdk1 voorbereiding werden geïsoleerd engeïdentificeerd met behulp van massaspectrometrie.

In traditionele 2D-gels worden trifenylmethaankleurstoffen gebruikt om de eiwitten zichtbaar op de gel. 2D-DIGE gebruikt fluorescent eiwit labels met minimaal effect op proteïne elektroforetische mobiliteit. Ander eiwit monsters kunnen worden gelabeld met verschillende fluorescente kleurstoffen, gemengd en gescheiden door de identieke gels, waardoor de co-elektroforese van meerdere monsters op één gel ^16. Dit minimaliseert de gel naar gel variaties wat een kritiek probleem in gel-gebaseerde proteomics onderzoek.

Protocol

1. Isolatie van Mitochondriën uit gekweekte cellen

1. Bereiding van isolatiebuffer Cellen (IBC) Buffer
   1. Bereid 0,1 M Tris / MOPS (tris (hydroxymethyl) aminomethaan / 3- (N -morpholino) propaansulfonzuur): Los 12,1 g Tris in 800 ml gedestilleerd water, breng de pH op 7,4 met behulp MOPS poeder, gedestilleerd water tot een totaalvolume volume van 1 L en bewaar bij 4 ^° C.
   2. Bereid 0,1 M EGTA (ethyleenglycol bis (2-aminoethylether) tetra-azijnzuur) / Tris: Los 38,1 g EGTA in 800 ml gedestilleerd water, breng de pH op 7,4 met behulp Tris poeder, gedestilleerd water tot een totaalvolume van 1 L en bewaren bij 4 ^° C
   3. Bereid 1 M Sucrose: Los 34,23 g sucrose in 100 ml gedestilleerd water, maken 20 ml porties en bewaar bij -20 ^o C.
   4. Bereid IB _c buffer: Bereid 100 ml IB _c buffer door het toevoegen van 10 ml 0,1 M Tris / MOPS en 1 ml 0,1 M EGTA / Tris tot 20 ml, Van 1 M sucrose. Voeg gedestilleerd water tot een totaal volume van 100 ml. Pas de pH tot 7,4.
2. Bereiding van Cell Lysis Buffer
   1. Bereid de lysis buffer bevattende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA (ethyleen diamino-azijnzuur), 1 mM EGTA, 1% Triton-X-100, 2,5 mM natriumpyrofosfaat, 1 mM β- glycerofosfaat, 1 mM natriumorthovanadaat. Voeg proteaseremmers 1 ug / ml leupeptine en 1 mM PMSF (fenylmethylsulfonylfluoride) vlak voor gebruik.
3. Isolatie van Mitochondriën
   1. Oogst 3 x 10 ⁷ cellen met ijskoude 1x PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing), pH 7,4 en centrifugeer cellen bij 600 g gedurende 10 min bij 4 ^° C Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 5 ml ijskoude IB _c buffer.
   2. Homogeniseren van de cellen met behulp van een glas / glasvlies molen voor ongeveer 10 min. Breng de homogenaat om een ​​15 ml buis en centrifugeer bij 600 xg gedurende 10 min bij 4 ^o C. Voor functionele mitochondria, gebruiken glas / Teflon koppeling want het is minder schadelijk voor de mitochondriën dan het glas / glasvlies molen.
   3. Verzamel de bovenstaande vloeistof tot 1,5 ml en centrifugeer bij 7000 xg gedurende 10 min bij 4 ^° C Breng de bovenstaande om een ​​1,5 ml tube en opslaan als cytosoleiwit.
   4. Was de pellet (mitochondria) tweemaal met 200 ul ijskoude IB _c buffer en centrifugeer bij 7000 xg gedurende 10 min bij 4 ^° C
   5. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in de cellysis buffer en gebruik onmiddellijk of bewaar bij -80 ^° C voor toekomstig gebruik. Als functionele mitochondriën nodig zijn, resuspendeer de pellet in de resterende buffer na het weggooien van het supernatant. Verdunnen van het mitochondriale fractie verder kan leiden tot het verlies van functie van mitochondriën. Op te slaan op het ijs en het gebruik van de voorbereiding in 1-3 uur voor het beste resultaat.
   6. Ultrasone trillingen de geresuspendeerde pellet dertig 3-sec bursts perijsbad, centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 5 min en het supernatant opslaan als mitochondriale fractie.

2. Co-immunokleuring van Cdk1, CyclinB1 en COXIV, een mitochondriale Resident Protein

1. Kweek 5 x 10 ⁴ cellen op dekglaasjes in platen met 24 putjes O / N of tot 70% confluentie. Zuig het medium en was de cellen tweemaal met 500 ul ijskoude 1 x PBS, pH 7,4.
2. Fix cellen met 500 ul ijskoude 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Zuig het fixeeroplossing en was de cellen met 500 ul 1 x PBS 3 keer 5 min elk onder zacht schudden bij kamertemperatuur.
3. Permeabilize de cellen met 0,2% Triton X-100 in 500 pi PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verstuif de oplossing en was de cellen 3 keer, 5 minuten elk met 500 pi PBS. Voeg de blokkerende oplossing (500 pl, 1% BSA (runderserumalbumine) in PBS met 1% Tween 20) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
4. Verdun het primaire antilichamen 1: 250 (v: v) in 5001; l van het blokkeren oplossing en incubeer de cellen met de gewenste primaire antilichamen opgewekt in verschillende soorten kruis signalering te voorkomen (CyclinB1 (muis) en COXIV (konijn) of Cdk1 (muis) en COXIV (konijn) bij kamertemperatuur gedurende 30 - 60 min of O / N bij 4 ^° C.
5. Was de dekglaasjes met 500 gl 1 x PBS 3 keer, 5 minuten elk en vervolgens geïncubeerd met secundair antilichaam verdund 1: 1000 in 500 pl blokkeeroplossing bij kamertemperatuur gedurende 1 uur gevolgd door wassen met 500 pl PBS 3 keer, 5 minuten elk.
6. Monteer de dekglaasjes met 20 ul van anti-fade montage oplossing en sluit de dia's met nagellak. Het imago van de dia's met behulp van een fluorescentiemicroscoop meteen of houden in het donker bij 4 ^° C gedurende 1 - 2 weken.

3. natriumcarbonaat Winning van Intact Mitochondriën

1. Grow ongeveer 20 x 10 ⁷ cellen, oogst, een keer wassen met PBS en te isoleren mitochondria zoals beschreven in hoofdstuk 1. Divide mitochondriale isolaten in twee parts voor de laatste centrifugeren naar de mitochondriën (vóór stap 1.3.4) pellet; opslaan half te gebruiken als de totale mitochondria (stap 3,2), gebruik de andere helft voor natriumcarbonaat extractie (volgt 3,3-3,6) om oplosbare en membraangebonden eiwitten te scheiden.
2. Lyse de totale mitochondria pellet met 30 pl cellysis buffer en bewaar het lysaat bij -80 ^° C tot gebruik in immunoblotting.
3. Voeg 250 ul van 0,1 M Na ₂ CO ₃ (natriumcarbonaat), pH 11,0, de andere helft van de mitochondriale pellet en incubeer op ijs gedurende 30 min.
4. Centrifugeren bij 100.000 xg gedurende 20 min. Verzamel de supernatant en ga verder met stap 3.5. Lyse de pellet middels 30 pl cellysis buffer en ultrasone trillingen zoals in stap 1.3.6. Bewaar bij -80 ^° C tot gebruik in immunoblotting.
5. Voeg een gelijk volume van 20% vers gemaakte trichloorazijnzuur (TCA) aan het supernatant om de eiwitten neerslaan en houden op ijs gedurende 30 min.
6. CENTRIFUGE bij 15.000 xg gedurende 10 min. Verwijder het supernatant, los de pellet in 80 pl cellysis buffer en bewaar bij -80 ^° C tot gebruik in immunoblotting.

4. Scheiding van Binnen en Buiten membranen van de mitochondriën (Isolatie van Mitoplasts)

1. Groeien ongeveer 20 x 10 ⁷ cellen, oogst, eenmaal wassen met PBS en isoleren mitochondria zoals in hoofdstuk 1. Scheid de mitochondriale fracties in 10 gelijke porties voor de laatste centrifugatie naar de mitochondriën (vóór stap 1.3.4) pelleteren.
2. Lossen elke pellet in 30 ul van de aangewezen concentratie hypotone sucrose buffer (1 mM EDTA, 10 mM MOPS / KOH (kaliumhydroxide), pH 7,2; sucrose concentratie variërend 25-200 mM) met of zonder 50 ug / ml trypsine ( zie tabel 1) en incubeer 30 min op ijs.
3. Voeg 3 ul van 10 mM PMSF (tot een eindconcentratie van 1 mM PMSF bereikt) aan de trypsine bevattende flacons stoppen thij trypsine digestie en incubeer op ijs gedurende 10 min.
4. Centrifugeer bij 14.000 xg bij 4 ^° C gedurende 10 minuten. Transfer supernatant naar een nieuwe buis, lyseren de pellet in 30 ul van cellysis buffer, ultrasone trillingen zoals in stap 1.3.6, en op te slaan bij -80 ^o C.

5. Bouw van Mitochondriën-gerichte GFP / RFP-tag CyclinB1 / Cdk1 Vectoren en bevestiging van hun mitochondriaal Localization

1. Kloon de mitochondria doelsequentie (MTS, afgeleid van de voorloper van menselijk cytochroom c oxidase subunit 8A (COX8) tussen nucleotiden 76-161) in frame in de N-terminus van GFP of RFP op Nhel en BamHI-plaatsen van pEGFP-N1 of pERFP -n1 vectoren onder gebruikmaking van standaard moleculaire kloneringstechnieken.
2. Bij het ontwerpen van PCR primers voor CyclinB1 en Cdk1 genen, voeg BamHI restrictie-enzym herkenningsplaatsen (vetgedrukt) aan het 5 'van de PCR primers.
   Forward Cdk1 BamH15 'CAG T GG ATC C AA TGG AAG ATT ATA CCA AAA T
   Reverse Cdk1 BamH1 5 'CTG T GG ATC C TG CAT CTT CTT AAT CTG ATT
   Forward CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CAA TGG CGC TCC GAG TCA
   Reverse CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CTG CAC CTT TGC CAC AGC C
3. Versterken de Cdk1 en CyclinB1 genen met behulp van deze primers volgende standaard technieken. Digest de PCR producten met 1 ui BamHI restrictie-enzym bij 37 ° C gedurende 2 uur. Run de digestie producten op een 1% agarosegel. Met behulp van een scheermesje, stuurde de juiste sized DNA-fragmenten uit te zuiveren en het DNA uit de gel onder toepassing van een gel extractie kit.
4. Digest 1 ug MTS-pEGFP-N1 en MTS-pERFP-N1 plasmiden met 1 ui BamHI enzym bij 37 ° C gedurende 2 uur. Voeg 1 ul van Calf-Intestinal alkalische fosfatase (CIP) gedurende 30 min bij 37 ° C. Run de digestie producten op een 1% agarosegel en zuiveren lineaire plasmiden uit gel als in stap 5,3.
5. Stel een ligatiereactie door toevoeging van 1 pi plasmide uit stap 5,4 en 5 gl Cdk1 of CyclinB1 van stap 5,3-3 ui ligase buffer, 0,5 pl T4 ligase en 20,5 ui dH ₂ O. Incubeer O / N bij 4 ° C.
6. Transformeren Escherichia coli DH5a competente cellen met 10 pl ligatiemengsel volgens standaard technieken en groeien de bacteriën op 10 mg / ml kanamycine bevattende LB-agarplaten O / N bij 37 ° C om kolonies te verkrijgen.
7. Kies uit een kolonie van O / N volwassen platen met behulp van een steriele pipet, steek de punt in een 5 ml van kanamycine-LB-bevattende buis en incubeer O / N. Isoleer het plasmide middels miniprep kits volgens het protocol van de fabrikant en de sequentie plasmide met standaardtechnieken.
8. Transfecteren exponentieel groeiende MCF10A cellen (1,5 x 10 ⁴ cellen gezaaid op 96-well platen) met MTS-Cdk1-RFP of MTS-CyclinB1-GFP plasmiden uit stap 5.7 door het bereiden van een plasmide / reagens-verhouding van 1 transfectie: 2 (w: v, 100 ng : 0,2 pl) in 100 gl serum- en antibiotica-vrij medium.
9. Incubeer de cellen in plasmide / reagens mix voor 48 uur bij 37 ° C in een _CO2 incubator met vochtregeling _(5% CO2, 95% relatieve vochtigheid).
10. Bereid 1 mM voorraadoplossing van mitochondriale rode en groene fluorescerende kleurstoffen door oplossen van 50 g poeder in 100 ul DMSO. Verdun de voorraad oplossingen 1: 400 in 1x PBS tot 2,5 uM werkende oplossingen te verkrijgen. De voorraadoplossingen kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C gedurende een jaar.
11. Meng 2 pl 2,5 uM van rode kleurstof met 98 ul kweekmedium in een 50 nM uiteindelijke concentratie te bereiden.
12. Vervang het kweekmedium CyclinB1-GFP MCF10A dragende cellen (gegenereerd in stap 5,8) met rode kleurstof bevattend medium gedurende 2 min. HerhaalDezelfde procedure met groene kleurstof voor Cdk1-RFP dragende MCF10A cellen.
13. Was tweemaal met 100 gl 1 x PBS om zich te ontdoen van de overmaat kleuroplossing krijgen, voeg 100 pl 1x PBS om de 96-well plaat.
14. Visualiseren mitochondria en CyclinB1-GFP (excitatie bij 488 nm en emissie bij 494-536 nm) en Cdk1-RFP (excitatie bij 560 nm en emissie bij 565-620 nm) op 96-well platen onder fluorescentiemicroscoop 40x vergroting.

6. Identificatie van differentieel Gefosforyleerd eiwitten via 2D-DIGE

1. monstervoorbereiding
   1. Mitochondria isoleren en lyseren mitochondriale fracties als in stap 1,3. Voeg een gelijk volume van 20% TCA (trichloorazijnzuur in water) aan elk monster en vortex gedurende 15 seconden. Incubeer de monsters op ijs gedurende 30 min de eiwitten neer te slaan uit de oplossing.
   2. Centrifugeer monsters bij 9300 xg bij 4 ° C gedurende 5 minuten, verwijder supernatant en voeg 60 ul koude aceton (100%) gevolgd doorcentrifugering bij 9300 xg bij 4 ° C gedurende 5 minuten.
   3. Herhaal de aceton wash (stap 6.1.2) nog een keer, verwijder supernatant en resuspendeer de monsters in 50 ul DIGE etikettering buffer (7 M ureum, 2 M thioureum, 4% CHAPS, 30 mM Tris, pH 8,5).
2. Bereid de fluorescente kleurstoffen
   1. Bereid voorraadoplossing: Los kleurstoffen (5 nmol) in 5 pl vers dimethylformamide (DMF) tot een uiteindelijke concentratie van 1 nmol / pl. Bewaar de voorraad kleurstofoplossing bij -20 ^° C tot gebruik gedurende enkele maanden.
   2. Bereid werkoplossing: Laat kleurstoffen om bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Verdun 1 pi kleurstof met 4 pi DMF tot een uiteindelijke concentratie van 200 pmol / ul. Houd op het ijs tijdens het gebruik. Opmerking: De werkoplossing kan bij -20 ^° C gedurende 3 weken houdbaar.
3. Label Eiwitten
   1. Meng 1 pl werken kleurstofoplossing per 12,5 ug eiwit. Opschalen als dat nodig is. Voor samengevoegde normen, toe te voegen 61, l Cy2 werkoplossing 300 ug eiwit samengevoegd.
   2. Vortex gedurende 30 seconden en centrifugeer bij 4 ° C gedurende 30 sec bij 12.000 x g. Incubeer op ijs in het donker gedurende 30 min. Stop de labeling door het toevoegen van 1 pi 10 mM lysine per 1 ui werkoplossing gebruikt. Meng goed en incubeer op ijs in het donker gedurende 10 min.
   3. Pool individueel gelabelde monsters en meng met rehydratie buffer (7 M ureum, 2 M thioureum, 4% CHAPS, 1,2% destreak, 1% pharmalytes, broomfenolblauw). Het totale volume wordt 125 pi.
   4. Vortex monsters voor 30 seconden en laat monsters om bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Belasting 125 pl monsters op 7 cm pH 4-9, isoelektrisch focusseren (IEF) strips.
4. Eerste dimensie elektroforese
   1. Plaats de strip houders (doodskisten) op de elektrode plaat, zorg ervoor dat de strip houders zijn volledig schoon en droog. Pipet 125 ul monsters in een doodskist, het verspreiden van gelijkmatig over de hele kist.
   2. Met behulp van tweezers, pak de IEF strip, verwijder voorzichtig de plastic beschermhoes, en plaats het (gel kant naar beneden) in de kist / rehydratie buffer. Vermijd luchtbellen. Langzaam vult kist (1 - 1,5 ml) met minerale olie en leg de kist beslaat op de doodskisten.
   3. Begin isoelektrisch focusseren volgens het protocol dat in tabel 2:
      Let op: Als de run is voltooid, kan de strips in plastic buizen worden opgeslagen bij -80 ^° C of direct overgegaan op equilibratie en de tweede dimensie.
5. Tweede dimensie - natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE)
   1. evenwicht
      1. Ontdooi SDS equilibratiebuffer (8 ml per strip, 6 M ureum, 30% glycerol, 2% SDS). Weeg dithiothreitol (DTT; 10 mg DTT per 1 ml SDS-equilibratiebuffer). DTT lossen in 4 ml SDS-equilibratiebuffer.
      2. Weeg IAA (joodacetamide, 25 mg IAA per 1 ml SDS-equilibratiebuffer).Los de IAA in 4 ml SDS-equilibratiebuffer.
      3. Smelt 1 ml afdichting agarose oplossing in een waterbad voor later gebruik.
      4. Als de stroken werden bevroren, zodat zij volledig ontdooien. Plaats strips gel kant naar boven in de reswelling lade. Voeg 4 ml SDS-equilibratiebuffer met DTT aan elke strook en incubeer gedurende 15 minuten onder zacht schudden.
      5. Giet alle SDS-equilibratiebuffer met DTT. Voeg 4 ml SDS-equilibratiebuffer met IAA elke strip en incubeer gedurende 15 minuten onder zacht schudden. Na het in evenwicht brengen met de IAA buffer, giet van de SDS equilibratiebuffer.
   2. SDS-PAGE
      1. Uitpakken mini gels, verwijder dan de kam en spoel de gel en de putten met DDH ₂ O. Verwijder de witte tape aan de onderkant van de gel voordat u. Oriënteren de strip op de gel correct, gel oriëntatie is van cruciaal belang voor spot snijden.
      2. Plaats de gel plat op teller met het plaatje en gel bovenkant naar experimenter. Leg de strip op de grote plaat met anodische uiteinde (++ eindigen met de barcode) naar de linkerkant van de gel. Met behulp van een liniaal, duw langzaam de strook neer op gel oppervlak. Vermijd luchtbellen tussen de strip en de gel. Zet de gel in een glazen plaat staan.
      3. Voeg 1 ml thermosealbekken agarose oplossing voor het openen van de cassette. Zorg ervoor dat alle luchtbellen worden geperst met behulp van een platte liniaal. Bouw de opstelling en laat de gel op een constante 125 V gedurende 90 min.
      4. Wanneer de gel klaar is met het uitvoeren, plaatst u de gel op een biomoleculaire imager met 2 ml DDH ₂ O en scan de gel in fluorescentie overname mode met 635 nm excitatie laser en 665 nm emissie filter.
   3. fosfoproteïne kleuring
      1. Bevestig de gel met 50% methanol en 10% azijnzuur mengsel (10 ml) gedurende 30 minuten tweemaal. Was met 10 ml water gedurende 10 minuten en driemaal vlek met 10 ml fosfoproteïne vlek voor 60-90 min, gevolgd doorontkleuren met 10 ml destain oplossing 30 min driemaal.
      2. Wassen met 10 ml water 5 min tweemaal en het imago van de gel met een laser gel scanner bij 532 nm / 560 nm excitatie / emissie.
   4. Eiwitvertering en Identificatie
      1. Accijns alle differentieel tot expressie gebrachte eiwit spots van de gel in putjes microplaat met behulp van een robot spot-picker volgens de specificaties van de fabrikant, en voeg 100 mM ammoniumbicarbonaat (2 ml) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om de gel stukken destain. Dehydrateren met 2 ml 100% acetonitril twee keer wassen en drogen in een vacuüm concentrator voor 30 min.
      2. Hydrateren de gelstukken met 100 pl 13 ng / pl gemodificeerde varkens trypsine in 50 mM ammonium bicarbonaat gedurende 16 uur bij 37 ° C. Verzamel de bovenstaande vloeistof en de eiwitten verder extract met 100 ui 5% trifluorazijnzuur in 50% acetonitril gedurende 30 min.
      3. Concentreer de peptiden tot aan 5 pl van vacuümcentrifuge concentterbestuurder en analyseren met MALDI - Time of Flight - tandem massaspectrometrie analyse (MALDI TOF-MS / MS) ^17.

7. In Vitro Kinase Assay

1. Voorbereiding van de ondergrond
   1. Subkloon Complex I (CI) subeenheden (NDUFV1, NDUFV3, NDUFS2, NDUFB6 en NDUFA12), waarvan wordt vastgesteld dat differentieel gefosforyleerde Cdk1 doelstellingen in pGEX-5X-1 vector glutathion-S-transferase (GST) gemerkte genereren bacteriële expressieplasmiden ^11. Zuiveren CI subeenheden met behulp van de hoge affiniteit glutathion kolommen de onderstaande protocol.
      1. Cultuur GST-gelabeld BI subunit bevattende Escherichia coli-stam BL-21 in Luria-Bertani (LB) bouillon met 50 ug / ml ampicilline in een schudinrichting bij 37 ^° C totdat een optische dichtheid (OD) van 0,6 werd bereikt. Voeg isopropyl-BD-thio-galactopyranoside (IPTG) aan de cultusure bij een uiteindelijke concentratie van 0,1 mM, en incubeer gedurende nog 3 uur.
      2. Centrifugeer bij 600 xg gedurende 10 minuten om de bacteriën te verzamelen en resuspendeer in 5 ml van 1 x PBS-buffer met 5 mM DTT, 1 x proteinase inhibitor cocktail, en 0,1% lysozym. Lyseren de cellen door sonicatie gedurende twintig 5 s uitbarstingen, en verwijder de celresten door centrifugatie bij 600 xg gedurende 10 min.
      3. Verzamel de bovenstaande vloeistof en incubeer met glutathion-agarose 4B korrels bij een volumeverhouding van 4: 1 (supernatant: bead) gedurende 1 uur bij KT.
      4. Elueer het GST-fusie-eiwitten van de bolletjes met 3 ml glutathion elutiebuffer (10 mM gereduceerd glutathion in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) en met de geëlueerde eiwitten dialyse moleculair poreus membraan buizen (molecuulgewicht cut-off 12 -14 kiloDalton) met 1 x PBS / 1 mM EDTA. Bewaar het gezuiverde eiwitten bij - 80 ^o C.
2. CDK1 Kinasetest
   1. Voorafgaand aan het starten van het kinase kontay, ingesteld verwarmingsblokken tot 30 ° C en 100 ° C. Dooi commerciële CyclinB1 / Cdk1 enzymcomplex en substraten op ijs.
   2. Bereid het reactiemengsel op ijs. Sinds ³² P ATP isotoop is betrokken, de voorbereiding van alle reactiemengsels in 1,5 ml monster buizen met schroefdop met een O-ring om de verspreiding van radioactiviteit te voorkomen.
      Let op: Volg de regels radioactieve materiaal bescherming. Gebruik een 8 mm dik plexiglas afscherming en werken in ieder geval op een armlengte. Veeg de besmette gebied met water.
   3. Bereid een 30 pl reactiebuffer bevattende 1 x Cdk1 buffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, 1 mM EGTA, 0,01% Brij 35, pH 7,5), 0,6 mM koud ATP, 0,1 uCi ^32P ATP, 2 eenheden van CyclinB1 / Cdk1 en 6 ug substraat eiwit. Zet het volume op 30 pi met DDH ₂ O. Voor positieve controlereactie, vervang het substraat met 0,01 mM histon H1, een bekende CyclinB1 / Cdk1 substraat.
      1. Bij negatieve control reacties (1) vervangen van het substraat met enige GST eiwit en (2) vervangen substraat met 0,01 mM histon H1 + 0,5 pM RO-3306, een selectieve remmer Cdk1.
   4. Goed mengen met een pipet en centrifuge om alle vloeistof bodem van de buis te brengen, waarbij het risico besmetting. Incubeer bij 30 ° C gedurende 60 minuten.
   5. Voeg 6 pl 5x SDS monsterbuffer om de reactie te stoppen en denatureren bij 100 ^° C gedurende 10 minuten. Run monsters op 10% SDS-PAGE gel bij 160 V gedurende 2 uur, of totdat kleurstoffront is het einde van de gel bereikte. Transfer gel op een chromatografie papier en wikkel met plasticfolie.
      Let op: Alle vloeistof in contact komt met radio-isotopen moet als radioactief afval worden behandeld en afgevoerd in een 5-liter poly mandefles door de milieu en gezondheid en veiligheid diensten per institutionele richtlijnen.
   6. Maak de gel aan röntgenfilm gedurende 1 dag of tot 1 week bij -20 ^° C afhankelijk van de specifieke activiteit van de radio-isotoop gebruikten het enzym.

8. Plaatsgerichte mutagenese te dominant negatief Cdk1 (D146N) genereren

1. Ontwerp mutagenese primers; twee primers, complementair aan elkaar gemaakt met het mutante plaats (G worden vervangen door een nucleotide coderen voor N in plaats van D aminozuren) geflankeerd door 20 basen aan elke zijde ^11.
2. Bereid een 50 pl polymerase-kettingreactie (PCR) mengsel dat 1 x reactiebuffer, 2,5 mM dNTP's, 10 pM primers (voorwaartse en achterwaartse), 40 ng van het template, en DDH ₂ O. Voeg 2,5 U van DNA polymerase in het reactiemengsel.
3. Voer de volgende PCR-programma: 95 ° C 3 min, 95 ° C, 30 sec, 55 ° C 30 min, 68 ° C 6 min; 16 cycli (Opmerking: 68 ° C incubatietijd wordt bepaald door de grootte van de DNA 1 min / kb vereist voor DNA ≤ 10 kb Voor grotere DNA, 2 min / kb plus 10 seconden per cyclus..). Volg van 68 ° C 7 min en houden op 4 ° C tot gebruik.
4. Toevoegen2 pl Dpn I restrictie-enzym (10 U / pl) en 5,7 pi Dpn I buffer, goed mengen met zachte tik met de vinger en incubeer de reactie bij 37 ^° C gedurende 1 uur.
5. Breng 10 pl Dpn I-behandelde PCR-producten in 50 pl DH5a competente cellen voor transformatie. Incubeer op ijs gedurende 30 min, gevolgd door 45 sec warmteschok bij 42 ^° C en 5 min op ijs. Voeg 500 gl LB en schud bij 37 ^° C gedurende 1 uur voor het uitplaten op LB-agarplaten. Incubate O / N bij 37 ^o C.
6. Kies een kolonie van de O / N gekweekt agarplaten met een steriele gele pipetpunt, vallen de punt in een buis met 5 ml LB en groeien O / N in een 37 ^° C schudinrichting. Isoleer plasmide onder toepassing van een miniprep kit en sequencen het plasmide de mutatie te bevestigen volgens het protocol van de fabrikant.

9. Vaststelling van de celcyclus fase lengtes met Edu Incorporation Assay

1. Cell Sorting
   1. Transfect 2 x 10 ⁵ cellen met aangegeven vectoren (MTS-GFP / RFP, MTS-CyclinB1-GFP / Cdk1-wt-RFP of MTS-Cdk1-dn-RFP) in een 6-wells plaat met 1: 2 (w: v , 2,5 pg: 5 pl) verhouding van DNA: transfectiereagens mengsel bereid in 2,5 ml serum en antibiotica vrije cultuur media voor 48 uur. Levende soort cellen die stabiel de uiting van de GFP-tag Cdk1 en RFP-tag CyclinB1 eiwitten via flowcytometer.
      1. Was de cellen met 1 x PBS, voeg 100 ul van trypsine in de schaal en incubeer bij 37 ^° C gedurende 5 minuten. Voeg 2 ml kweekmedium om de cellen te verzamelen en ze door een 70 urn filter om een ​​enkele celsuspensie te genereren. Was de enkele celsuspensie met 500 ul van 1% foetaal kalfsserum in PBS (FCS / PBS) voordat ze op flowcytometer.
      2. Stel de sortering parameters volgende vastgestelde protocollen ¹⁸ venstertijd voor dubbele positieve cellen gekleurd met zowel GFP en RFP. Verzamel de gesorteerde cellen die uit de cytometer in een buis containing celkweekmedium en het gebruik van deze cellen voor de analyse van de voortgang van de celcyclus met Edu pulse-chase etikettering als in protocol 9.2.
2. Meting van de lengte van de celcyclus Met behulp van de EDU Labeling flowcytometrie Assay
   1. Zaad gesorteerd cellen in 6-well platen bij een dichtheid van 2,5 x 10 ⁵ cellen per well en cultuur O / N bij 37 ^° C in een _CO2 incubator. Voeg EDU aan het kweekmedium in een eindconcentratie van 25 uM. Incubeer bij 37 ^° C in een _CO2 incubator gedurende 1 uur.
   2. Was de cellen met 1% BSA in 500 pi PBS en verzamelen in een 1,5 ml buis bij 2 uur intervallen voor een totaal van 10 - 12 uur.
   3. Centrifugeer cellen bij 350 g gedurende 5 min, gooi het supernatant. Los de pellet door het toevoegen van 100 pl fixeeroplossing (geleverd door de fabrikant in de labeling kit EDU) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en meng.
   4. Was de cellen met 1 ml van 1% BSA in PBS driemaal. Bevestig decellen opnieuw met 0,5 ml van 70% ethanol O / N bij 4 ^oC
      Opmerking: Ethanol bevestiging is kritisch voor de interne GFP / RFP fluorescentie doven door de recombinant-gemerkt eiwit expressie.
   5. Centrifugeer de cellen opnieuw bij 350 xg gedurende 5 minuten en was het pellet met 1 ml van 1% BSA in PBS keer. Resuspendeer de cellen in 1 ml buffer permeabilisatie (0,1% Triton-X-100, 1% BSA, 0,2 mg / ml RNase A in PBS) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
   6. Was de cellen met 1 ml van 1% BSA in PBS keer. Voeg 0,5 ml van de reactie cocktail in elke buis en meng goed. Incubeer reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker.
   7. Wassen met 1 ml van 1% BSA in PBS en eenmaal vlek DNA met 50 ug / ml propidiumjodide (PI) in 1 ml van 1% BSA in PBS.
   8. Analyseer de cellen door flowcytometrie om de EDU-positieve populatie volgen. Present scatter dot plot van EDU-gelabelde cellen gekleurd voor DNA-gehalte (PI kleuring, X-as) en Edu (Alexa 647 kleuring, Y-as).
      1. Gebruik APC-kanaal voor Alexa647-Edu met behulp van een 670/30 band pass filter met alle licht aanwezig op minder dan 685 nm raken van dat filter; en phycoerythrin (PE) kanaal voor PI met een 581/15 band pass filter voor het met al licht aanwezig minder dan 600 nm raken van dat filter.
      2. Plaats de eerste buis met cellen in de flowcytometrie en gebruik een standaard gating strategie voor de acquisitie: Plot FSC-Area X SSC-omgeving voor morfologie, gevolgd door PI (PE kanaal) X Alexa647-edu (APC kanaal) voor mobiele kleuring. Record gegevens voor alle buizen één voor één het verwerven van 10.000 gebeurtenissen per monster.
      3. Bepaal de celcyclus faseverdeling van de cellen en fase lengtes met een flow cytometrie gegevensanalyse software volgens vastgestelde protocollen ^11,30.

Results

Sub-mitochondriale lokalisatie van CyclinB1 en Cdk1

Natriumcarbonaat extractie wordt bepaald of een eiwit bevindt zich in de mitochondriën of op het buitenoppervlak, namelijk buitenste membraan. Zodra een proteïne blijkt te lokaliseren binnen de mitochondria, kan nadere bepaling van sub-mitochondriale lokalisatie worden gezet mitoplasting combinatie met protease vertering. Om de sub-mitochondriale lokalisatie ...

Discussion

Zoals de eiwitten die bestemd zijn voor andere subcellulaire organellen, de beoogde mitochondriale eiwitten bezitten targeting signalen in de primaire of secundaire structuur die hen direct naar het organel met behulp van uitgebreide eiwit translocatie en vouwmachines ^21,22. Mitochondriën targeting sequenties (MTS) uitsluitend verkregen van mitochondriale resident eiwitten zoals COX8 kan worden toegevoegd aan N-terminus van elke gensequentie specifieke eiwitten in de mitochondriën richten ^11,23,24....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
32P ATP	PerkinElmer	BLU002001MC
Anti-mouse secundaire antilichaam	Invitrogen	A-11003	Alexa-546 geconjugeerd
Anti-konijn secundaire antilichaam	Invitrogen	A11029	Alexa-488 geconjugeerd
ATP	Research Organics	1166A	Voor in vitro kinase assay
Cdk1 antilichaam	Cell Signaling Technology	9112
Cdk1 kinase buffer	New England Biolabs	P6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit	Life Technologies	C10337	Voor celcyclusanalyse met EdU-labeling
COX IV antilichaam	Cell Signaling Technology	4844S	Voor mitochondriale immunokleuring
Cyclin B1 antilichaam	Santa Cruz Biotech	sc-752
CyclinB1/Cdk1 enzymcomplex	New England Biolabs	P6020S	Vermijd bevriezen/ontdooien
CyDye DIGE Fluor Labeling Kit	GE Healthcare Life Sciences	25-8009-83
DIGE Gel en DIGE Buffer Kit	GE Healthcare Life Sciences	28-9480-26 AA
Dimethylformamide	Sigma Aldrich	319937	DMF
Dithiothreitol	Bio-Rad	161-0611	DTT
dNTP	EMD Millipore	71004	Voor plaatsgerichte mutagenese
Dpn I enzym	Stratagene	200519-53	Voor plaatsgerichte mutagenese
Dry Strip cover vloeistof	GE Healthcare Life Sciences	17-1335-01	Gebruikt als minerale olie
EDTA	J.T. Baker	4040-03
EGTA	Acros Organics	409910250
Eppendorf Vacufuge Concentrator	Fisher Scientific	07-748-13	Gebruikt als vacuümcentrifuge concentrator
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01	Anti-fade montageoplossing
Fortessa Flow Cytometer	BD Biosciences	649908	Voor celcyclusanalyse met EdU-labeling
Histone H1	Calbiochem	382150	Voor in vitro kinase assay
QIAquick Gel Extractie Kit	Qiagen	28704	Voor het zuiveren van DNA-fragmenten uit agarose gels
Immobiline DryStrip Gels	GE Healthcare Life Sciences	18-1016-61	IEF (iso-elektrisch focussen) strips
Geïmmobiliseerd glutathion	Thermo Scientific	15160	Glutathione-agarose kralen
Iodoacetamide	Sigma Aldrich	I1149	IAA
IPGphor 3 Iso-elektrisch Focussen Unit	GE Healthcare Life Sciences	11-0033-64	IPGphor strip houders
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranosid	RPI Corp	156000-5.0	IPTG
Leupeptine	Sigma Aldrich	L9783	Voor cellyse buffer
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668027	Transfectiereagens
Lysine	Sigma Aldrich	L5501	Voor CyDye labelen
Lysozym	EMD Chemicals	5960
Mitotracker Red/Green	Invitrogen	M7512/M7514	Mitochondriale fluorescente kleurstoffen
MOPS	EMD Chemicals	6310
pEGFP-N1	Clonetech	6085-1	GFP-expresserende vector
Pfu	Stratagene	600-255-52
pGEX-5X-1	GE Healthcare Life Sciences	28-9545-53	GST-expresserende vector
Fenylmethylsulfonylfluoride	Shelton Scientific	IB01090	PMSF
Fosfaat gebufferde zoutoplossing	Life Technologies	14040	PBS
Spectra/Por 4 dialyse slang	Spectrum Labs	132700	als poreuze membraanslang voor dialyse
Pro-Q Diamond Fosfoproteïne Gel Kleur	Life Technologies	P-33300	Voor het kleuren van fosfoproteïnen op 2D gels
Proteinase remmercocktail	Calbiochem	539134	Voor cellyse buffer
QuikChange plaatsgerichte mutagenese kit	Stratagene	200519-5
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104	MiniPrep Plasmid Isolatiekoffertje
RO-3306	Alexis Biochemicals	270-463-M001	Cdk1 remmer
Rotenone	MP Biomedicals	150154	Complex I remmer
Natriumcarbonaat	Fisher Scientific	S93359
Natriumchloride	EMD Chemicals	SX0420-5	Voor cellyse buffer
Natriumorthovanadate	MP Biomedicals	159664	Voor cellyse buffer
Natriumpyrofosfaat decahydraat	Alfa Aesar	33385	Voor cellyse buffer
Natrium β-glycerofosfaat	Alfa Aesar	L03425	Voor cellyse buffer
SpectraMax M2e	Molecular Devices	M2E	Microplaatlezer
Sucrose	Fisher Scientific	57-50-1
Weefselmolen stamper	Kimble Chase	885301-0007	Voor mitochondria isolatie
Weefselmolen buis	Kimble Chase	885303-0007	Voor mitochondria isolatie
Trichloroazijnzuur oplossing	Sigma Aldrich	T0699	TCA
Tris	MP Biomedicals	103133
Triton-x-100	Teknova	T1105
Trypsine	Calbiochem	650211
Typhoon Imager	GE Healthcare Life Sciences	28-9558-09	Laser gel scanner voor 2D-DIGE
Ubiquinon	Sigma Aldrich	C7956