Ex Vivo Cultuur van Chick Cerebellaire Slices en Ruimtelijk Gerichte Elektroporatie van Korrel cel precursoren

Samenvatting

Cerebellaire granule uitwendige laag is de plaats van de grootste doorvoer versterking in de zich ontwikkelende hersenen. Hier presenteren we een protocol voor genetische modificatie om deze laag te richten op het hoogtepunt van proliferatie via ex vivo elektroporatie en cultuur van cerebellaire plakjes uit embryonale dag 14 kippenembryo's.

Samenvatting

Cerebellaire granule uitwendige laag (EGL) is de plaats van de grootste doorvoer versterking in de zich ontwikkelende hersenen en een uitstekend model voor het bestuderen van neuronale proliferatie en differentiatie. Bovendien zijn evolutionaire modificaties van de proliferatieve capaciteit belast de intense beleving van cerebellaire grootte in de amnioten geweest, waardoor het cerebellum een ​​uitstekend model voor evo-devo studies van de gewervelde hersenen. De constituerende cellen van EGL, cerebellaire granule voorlopers, ook een belangrijke cel van oorsprong vormen voor medulloblastoom, de meest voorkomende pediatrische neuronale tumor. Na doorvoer amplificatie granule precursoren migreren radiaal in de interne granulaire laag van het cerebellum, waar zij de grootste neuronale populatie in het volwassen hersenen. In kuiken, de piek van EGL proliferatie optreedt aan het einde van de tweede week van de zwangerschap. Om genetische modificatie om deze laag te richten opde piek van proliferatie, hebben we een werkwijze voor genetische manipulatie door middel van ex vivo elektroporatie van cerebellum segmenten uit embryonale dag 14 kippenembryo's ontwikkeld. Deze werkwijze herhaalt verscheidene belangrijke aspecten van in vivo granule neuron ontwikkeling en zal bruikbaar zijn bij het ​​genereren van een grondig begrip van cerebellaire granule celproliferatie en differentiatie en dus van cerebellum ontwikkeling, groei en ziekte.

Inleiding

Het cerebellum zit aan het voorste uiteinde van de achterhersenen en is verantwoordelijk voor de integratie van sensorische en motorische verwerking in de volwassen hersenen en regulering hogere cognitieve processen ^1. In zoogdieren en vogels, bezit een uitgebreid morfologie en zwaar gelaagde, een resultaat van uitgebreid doorvoer amplificatie van progenitors in ontwikkeling die produceert dan de helft van de neuronen in de volwassen hersenen. Het cerebellum is een onderwerp van onderzoek geweest neurobiologists eeuwenlang en in de moleculaire tijdperk is ook veel aandacht gekregen. Dit heeft niet alleen zijn inherent interessant biologie, maar ook op het ....

Protocol

Let op: Alle experimenten werden uitgevoerd met overeenstemming met het King's College in Londen, Verenigd Koninkrijk en het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken richtlijnen verzorging van dieren.

1. Dissectie van e14 kleine hersenen

1. Broeden eieren bruin bevruchte kippeneieren bij 38 ° C tot embryonale Dag 14.
2. Met behulp van ei schaar onthoofden kippenembryo in ovo en verwijder het hoofd naar een petrischaal met ijskoude PBS (Figuur 1A).
3. Met behulp van standaard tang, maak insnijdingen achter elk oog helemaal door het weefsel, het verwijderen van de ogen en bovenkaak. Een tw....

Resultaten

Dit gedeelte illustreert voorbeelden van resultaten die kunnen worden verkregen met behulp van slice elektroporatie en cultuur van cerebellum uit embryonale dag 14 chick. De ontleding van het cerebellum is geïllustreerd in figuur 1 en elektroporatie kamer ingesteld is weergegeven in figuur 2. We tonen aan dat het mogelijk is cultuur cerebellaire schijfjes, die de structuur en cellulaire morfologie (figuur 3A) behoude.......

Discussie

Het protocol hier gemeld beschrijft een methode voor het ontleden, elektroporeren en het kweken van plakjes embryonale Dag 14 cerebellum van het kuiken. Dit protocol maakt targeting van elektroporatie kleine focale gebieden van de EGL, inclusief geïsoleerde targeting van individuele cerebellaire lobben. Het maakt genetische analyse en weergave met een hoge resolutie te bereiken, en tegen lage kosten in vergelijking met bestaande technieken bij knaagdieren ^43-47. Dergelijke analyse is momenteel niet mogelijk <.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
McIlwain tissue chopper	Mickle Laboratory Engineering Ltd		Snij op 300 μm voor de beste resultaten.
Basal Medium Eagle (Gibco)	Life Technologies	41010-026
L-glutamine	Sigma	G7513
penicilline/streptomycine	Sigma	P4333
0.4 μm kweekinzet	Millipore	PICM0RG50
TSS20 Ovodyne elektroporatietoestel	Intracel	01-916-02	Gebruik 3 x 10 V, 10 msec pulsen voor elektroporatie.