Ex Vivo Cultuur van Chick Cerebellaire Slices en Ruimtelijk Gerichte Elektroporatie van Korrel cel precursoren

Samenvatting

Cerebellaire granule uitwendige laag is de plaats van de grootste doorvoer versterking in de zich ontwikkelende hersenen. Hier presenteren we een protocol voor genetische modificatie om deze laag te richten op het hoogtepunt van proliferatie via ex vivo elektroporatie en cultuur van cerebellaire plakjes uit embryonale dag 14 kippenembryo's.

Samenvatting

Cerebellaire granule uitwendige laag (EGL) is de plaats van de grootste doorvoer versterking in de zich ontwikkelende hersenen en een uitstekend model voor het bestuderen van neuronale proliferatie en differentiatie. Bovendien zijn evolutionaire modificaties van de proliferatieve capaciteit belast de intense beleving van cerebellaire grootte in de amnioten geweest, waardoor het cerebellum een ​​uitstekend model voor evo-devo studies van de gewervelde hersenen. De constituerende cellen van EGL, cerebellaire granule voorlopers, ook een belangrijke cel van oorsprong vormen voor medulloblastoom, de meest voorkomende pediatrische neuronale tumor. Na doorvoer amplificatie granule precursoren migreren radiaal in de interne granulaire laag van het cerebellum, waar zij de grootste neuronale populatie in het volwassen hersenen. In kuiken, de piek van EGL proliferatie optreedt aan het einde van de tweede week van de zwangerschap. Om genetische modificatie om deze laag te richten opde piek van proliferatie, hebben we een werkwijze voor genetische manipulatie door middel van ex vivo elektroporatie van cerebellum segmenten uit embryonale dag 14 kippenembryo's ontwikkeld. Deze werkwijze herhaalt verscheidene belangrijke aspecten van in vivo granule neuron ontwikkeling en zal bruikbaar zijn bij het ​​genereren van een grondig begrip van cerebellaire granule celproliferatie en differentiatie en dus van cerebellum ontwikkeling, groei en ziekte.

Inleiding

Het cerebellum zit aan het voorste uiteinde van de achterhersenen en is verantwoordelijk voor de integratie van sensorische en motorische verwerking in de volwassen hersenen en regulering hogere cognitieve processen ^1. In zoogdieren en vogels, bezit een uitgebreid morfologie en zwaar gelaagde, een resultaat van uitgebreid doorvoer amplificatie van progenitors in ontwikkeling die produceert dan de helft van de neuronen in de volwassen hersenen. Het cerebellum is een onderwerp van onderzoek geweest neurobiologists eeuwenlang en in de moleculaire tijdperk is ook veel aandacht gekregen. Dit heeft niet alleen zijn inherent interessant biologie, maar ook op het feit dat het zwaar is betrokken bij humane ziekten waaronder ontwikkelingsstoornissen genetische aandoeningen zoals autismespectrumstoornissen ² en het meest opvallend de cerebellaire kanker, medulloblastoom ^3, dat is de meest voorkomende pediatrische brain tumor. Belangrijk is een uitstekend modelsysteem binnen which allocatie lot en neurogenese studeren tijdens de ontwikkeling van de hersenen ^4. De laatste jaren is ook vastgesteld als modelsysteem voor de vergelijkende studie van hersenontwikkeling, vanwege de enorme diversiteit van cerebellaire vormen gezien in de vertebraat fylogenie ^5-10.

Het cerebellum ontwikkelt de dorsale helft van rhombomere 1 in de achterhersenen en ontwikkelingsgebied ¹¹ omvat twee primaire progenitorpopulaties de ruitvormige lip en de ventriculaire zone. De ruitvormige lip strekt zich uit rond het dorsale gebied van de neuroepithelium van de achterhersenen aan de grens met de dakplaat. Het is de geboorteplaats van de glutamaat prikkelende neuronen van het cerebellum ^12-14. De ventriculaire zone leidt tot de remmende GABAergic cerebellaire neuronen, het meest opvallend grote Purkinje neuronen ^14,15. Later in de ontwikkeling (van ongeveer embryonale dag 13,5 in de muis; e6 in kuiken ^16), glutamaat Progensatoren migreren tangentieel van de ruitvormige lip en vormen een pial laag van voorlopers: een secundaire voorlopercellen zone genaamd de externe korrel laag (EGL). Het is deze laag die de uitgebreide amplificatie doorvoer die leidt naar de grote aantallen granule neuronen in de volwassen hersenen ondergaat.

Proliferatie in de EGL is lang verbonden met de sub-pial plaats als gevolg van tangentiële migratie van de ruitvormige lip ^17, de schakelaar celcyclus verlaten en neuronale differentiatie van voorlopercellen behoort bij het ​​verlaten van de buitenste EGL laag in het midden EGL ^18. Uitgebreide tangentiële migratie van post-mitotische granule cellen in mediale-laterale as optreedt in het midden en binnenste EGL ¹⁹ vóór definitieve radiale migratie naar de binnenste laag van de korrel rijpe cerebellaire cortex. Migratie van cellen uit de ruitvormige lip over de cerebellaire oppervlakte is afhankelijk van CXCL12 signalering van de pia ^20-22 En granule cellen drukken de CXCL12 receptor CXCR4. Hun tangentiële migratie is dus denken aan die van de neocorticale tangentiaal migreren remmende interneuron bevolking ^23-25. Intrigerend elektronenmicroscopische studies ¹⁷ hebben gesuggereerd dat EGL cellen met een proliferatieve morfologie behouden pial contact, het koppelen van de cel gedrag proliferatieve mogelijkheden op een manier die doet denken aan de basale voorouders van de zoogdieren cortex ^26. Dit komt tot uiting in de genoemde stratificatie van de EGL in drie sub-lagen die worden gedefinieerd door verschillende extracellulaire milieu en indien granule precursors hebben verschillende genexpressie handtekeningen ^18.

Proliferatie van voorlopers in de oEGL optreedt met een normale verdeling van kloon afmetingen zodanig dat als voorlopers individueel genetisch gemerkt eind embryonale ontwikkeling bij de muis, geven aanleiding tot een mediaan gemiddelde van 250-500 g postmitotischeranule neuronen ^27,28. Proliferatie is afhankelijk van mitogene SHH signalering van onderliggende Purkinje neuronen ^29-32. Het vermogen om te reageren op SHH aangetoond volledig afhankelijk cell autonome expressie van de transcriptiefactor Atoh1 te zijn, zowel in vitro ³³ en in vivo ^34,35. Evenzo heeft celcyclus verlaten en differentiatie getoond afhankelijk van de expressie van het stroomafwaartse transcriptiefactor NeuroD1 ^36, die waarschijnlijk een directe repressor van Atoh1 ³⁷ zijn.

Ondanks deze vooruitgang, en de aanzienlijke vooruitgang in het ontcijferen van de celbiologische basis van de celcyclus exit ^38-42, het fundamentele moleculaire mechanisme (s) dat de beslissing ten grondslag liggen aan de celcyclus verlaten en om de overgang van een voorloper van een differentiërende neuron, en de geassocieerde postmitotische tangentiële migratie in het binnenste EGL en de latere switchradiale migratie, blijft onvolledig begrepen. Dit is grotendeels vanwege het experimentele eigenzinnigheid van de EGL: het laat ontwikkelen, en moeilijk genetisch doel omdat veel van dezelfde neurogene moleculen ook cruciaal vroeger in het leven van korrel precursors in het ruitvormige lip. Om dit probleem te overwinnen zijn talrijke auteurs in vivo en ex vivo elektroporatie ontwikkeld als een methode om de postnatale cerebellum bij knaagdieren ^43-48 richten. Hier hebben we pionier het gebruik van ex vivo elektroporatie in chick op de EGL, die aanzienlijke voordelen vertegenwoordigt in termen van kosten en het gemak bestuderen. Onze methode van elektroporatie en ex vivo stukje cultuur van chick cerebellaire weefsel maakt gebruik van weefsel ontleed uit embryonale dag 14 kuikens op het hoogtepunt van EGL proliferatie. Deze methode maakt genetische targeting van het EGL onafhankelijk van de ruitvormige lip en het stadium voor genetische dissectie van de overgang van granulevoorlopercellen te postmitotische korrel neuron in het cerebellum.

Protocol

Let op: Alle experimenten werden uitgevoerd met overeenstemming met het King's College in Londen, Verenigd Koninkrijk en het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken richtlijnen verzorging van dieren.

1. Dissectie van e14 kleine hersenen

1. Broeden eieren bruin bevruchte kippeneieren bij 38 ° C tot embryonale Dag 14.
2. Met behulp van ei schaar onthoofden kippenembryo in ovo en verwijder het hoofd naar een petrischaal met ijskoude PBS (Figuur 1A).
3. Met behulp van standaard tang, maak insnijdingen achter elk oog helemaal door het weefsel, het verwijderen van de ogen en bovenkaak. Een tweede insnijding helemaal door de keelholte verwijderen van de onderkaak (Figuur 1B).
4. Met behulp van standaard tang, verwijder alle huid van de oppervlakte van de schedel door het weg te pellen (figuur 1C) en verwijder de frontale en pariëtale botten, onthullen hersenen.
5. Vanuit een ventrale aspect, verwijder pharyngeal kraakbeen en hulpstoffen mesenchym.
6. Vanuit een dorsale aspect, voorzichtigly verwijderen mesenchym dorsale achterhersenen naar de zorg niet te pia, en aparte gehele hersenen (figuur 1D) beschadigen.
7. Maak incisie helemaal door het weefsel tussen de middenhersenen en achterhersenen en aparte achterhersenen inclusief cerebellum (figuur 1E).
8. Door het maken van incisies helemaal door het weefsel aan beide laterale kruispunten van cerebellum en alar plaat van de achterhersenen, verwijdert hele cerebellum, zorg ervoor dat de integriteit van de pia hele dissectie (Figuur 1F) handhaven. Verwijder de choroid plexus vormen (figuur 1G).
9. Verplaats de kleine hersenen ontleed in ijskoude HBSS.

2. Slice Cultuur van e14 kleine hersenen

1. Breng de hele cerebellum naar de steriele platform van een Tissue Chopper met een spatel of een 3 ml Pasteur pipet met de punt weggesneden om het diafragma te verbreden. Verwijder overtollige vloeistof met een pipet.
2. Snijd hele hele cerebellum in tHij vereist oriëntatie 300 urn dik met de tissue chopper ingesteld met een snijsnelheid van 50% van het maximum. Weefsel integriteit is het meest gemakkelijk bewaard in sagittale doorsnede; Maar oriëntatie is ook een belangrijke overweging voor mobiele analyse (Purkinje cel dendrieten zijn sagittally uitgelijnd, terwijl de korrel cel axonen dwars lopen, loodrecht op het vlak van de Purkinje cel dendrieten).
3. Met behulp van een 3 ml Pasteur pipet, hebben betrekking op de in plakjes gesneden cerebellum in ijskoude HBSS.
4. Breng de plakjes in HBSS tot een 60 mm petrischaal met ijskoude verse HBSS met behulp van een 3 ml Pasteur pipet met cut tip.
5. Zorgen voor een scheiding van de afzonderlijke segmenten met horlogemaker tang onder een dissectiemicroscoop verlicht met een fiber optic lichtbron. Identificeer segmenten te geëlektroporeerd, gebaseerd op hun weefselintegriteit en medio-laterale positie.
   Opmerking: Elke dissectie van embryo tot incubatie snijden in kweekmedium duurt ongeveer 10-20 minuten, afhankelijk upon ervaring. Voer dissecties een tegelijk zodat cerebella brengen minimale tijd tussen onthoofding en ex vivo kweken.

3. Elektroporatie van Slices

1. Construct een elektroporatie kamer door vaststelling van de anode van een elektroporator aan de basis van een 60 mm petrischaal met isolatieband. Voeg ongeveer 1 ml HBSS om de elektrode bedekken.
2. Plaats een 0,4 urn kweekinsert bovenop de elektrode bedekt met HBSS. Laat de cultuur insert te rusten op de elektrode ervoor te zorgen dat er altijd contact tussen de insert en de elektrode.
   Opmerking: In deze opstelling zal de kweekinsert de segmenten rusten op het oppervlak van de oplossing, het handhaven van de schakeling, maar waarbij ruimtelijke gerichtheid van de kathode.
3. Transfer geïdentificeerd plakjes (maximaal vijf per cultuur insert) op cultuur insert met 3 ml Pasteur pipet met de cut tip. Aparte en laat bezinken op cultuur insert in een sagittal oriëntatie.
4. Met behulp van een pipet, verwijderen overtollige HBSS zodat schijfjes niet meer badend in oplossing.
5. Met een P10 pipetpunt, pipet DNA (bij een concentratie van 1 ug / ul) verdund met 20% snel groen over het oppervlak van doelgebied van een plak. 20% snel groen zorgt visceuze DNA-oplossing en voorkomt onbetaalbaar brede verspreiding van DNA. Voeg ongeveer 5 ul DNA / fast green oplossing voor elk segment (figuur 2B).
6. Plaats de kathode op gewenste gerichte weefsel en electroporate met 3 x 10 V, 10 ms duur pulsen. Vermijd direct contact van de kathode met het weefsel. In plaats daarvan gebruik maken van de oppervlaktespanning van de vloeistof geleidbaarheid handhaven (plaats de kathode zo dicht bij het weefsel mogelijk zonder dat het aanraken van het weefsel).
7. Herhaal DNA levering en elektroporatie meerdere gebieden van EGL op iedere afzonderlijke cerebellaire segment zoals gewenst.
8. Na voltooiing van elektroporatie, de overdracht van cultuur insert tot 30 mm petrischaal.
9. Aan elke kweek, voeg 1 ml voorverwarmd kweekmedium (Basaal Medium Eagle, 0,5% (w / v) D - (+) - glucose, 1% B27 supplement, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine) onder de kweekinsert zodanig dat de cultuur inzetstuk in contact met medium, maar schijfjes niet gebaad.
10. Incubeer kweken bij 37 ° C / 6% CO ₂ tot 3 dagen. Vervang alle van het kweekmedium elke 24 uur met verse voorverwarmde medium.
11. Na cultuur, vast plakken cultuur inzetstukken voor 1 uur in 4% paraformaldehyde (of O / N bij 4 ° C) in een verse 30 mm schaal zonder kweekmedium.

4. beeldvorming van cerebellaire Slices

1. Na fixatie, wassen plakken 3 maal gedurende 5 min in PBS.
2. Met behulp van een scheermesje, ontleden elk geëlektroporeerd en gekweekt cerebellaire slice uit de cultuur insert door te snijden om de slice en het verwijderen van het segment en regio insert wordt nageleefd. Doniet proberen om slice uit de cultuur insert oppervlak te verwijderen.
3. Mount plakjes in ongeveer 1 ml van de montage medium met DAPI (indien gewenst) onder een dekglaasje zorg niet te bellen in te voeren, en het beeld met behulp van laser-scanning confocale microscopie.
   Opmerking: Imaging parameters kunnen worden gevarieerd afhankelijk van de constructen geëlektroporeerd, en naar keuze van de individuele gebruiker.

Resultaten

Dit gedeelte illustreert voorbeelden van resultaten die kunnen worden verkregen met behulp van slice elektroporatie en cultuur van cerebellum uit embryonale dag 14 chick. De ontleding van het cerebellum is geïllustreerd in figuur 1 en elektroporatie kamer ingesteld is weergegeven in figuur 2. We tonen aan dat het mogelijk is cultuur cerebellaire schijfjes, die de structuur en cellulaire morfologie (figuur 3A) behoude...

Discussie

Het protocol hier gemeld beschrijft een methode voor het ontleden, elektroporeren en het kweken van plakjes embryonale Dag 14 cerebellum van het kuiken. Dit protocol maakt targeting van elektroporatie kleine focale gebieden van de EGL, inclusief geïsoleerde targeting van individuele cerebellaire lobben. Het maakt genetische analyse en weergave met een hoge resolutie te bereiken, en tegen lage kosten in vergelijking met bestaande technieken bij knaagdieren ^43-47. Dergelijke analyse is momenteel niet mogelijk <...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
McIlwain tissue chopper	Mickle Laboratory Engineering Ltd		Snij op 300 μm voor de beste resultaten.
Basal Medium Eagle (Gibco)	Life Technologies	41010-026
L-glutamine	Sigma	G7513
penicilline/streptomycine	Sigma	P4333
0.4 μm kweekinzet	Millipore	PICM0RG50
TSS20 Ovodyne elektroporatietoestel	Intracel	01-916-02	Gebruik 3 x 10 V, 10 msec pulsen voor elektroporatie.