Methodenartikel

Verbeterde Generatie van geïnduceerde Cardiomyocytes Met behulp van een polycistronisch Construct uitdrukken optimale verhouding van GATA4, MEF2C en Tbx5

DOI:

10.3791/53426

⸱

13 november 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, McAllister Heart Institute, University of North Carolina, Chapel Hill

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven hier een protocol voor de generatie van iCM's met behulp van retrovirus-gemedieerde levering van Gata4, Tbx5 en Mef2c in een polycistronisch construct. Dit protocol levert een relatief homogene populatie van geherprogrammeerde cellen met verbeterde efficiëntie en kwaliteit en is waardevol voor toekomstige studies van iCM-reprogrammering.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Directe omzetting van cardiale fibroblasten (CFS) in geïnduceerde hartspiercellen (ICMS) heeft een groot potentieel voor de regeneratieve geneeskunde door het aanbieden van alternatieve strategieën voor de behandeling van hart-en vaatziekten. Deze conversie is bereikt door geforceerde expressie van bepaalde factoren zoals GATA4 (G), MEF2C (M) en Tbx5 (T). Traditioneel ICMS worden gegenereerd door een cocktail van virussen die deze individuele factoren. Echter, herprogrammering rendement relatief laag is en de meeste in vitro G, M, T-getransduceerde fibroblasten niet volledig zijn geprogrammeerd, waardoor het moeilijk om de herprogrammering mechanismen te bestuderen. We hebben onlangs aangetoond dat de stoichiometrie van G, M, T is cruciaal voor efficiënte icm herprogrammering. Een optimale stoïchiometrie van G, M, T met relatief hoog M en lage niveaus van G en T bereikt door onze polycistronische MGT vector (hierna MGT) aanzienlijk toegenomen herprogrammering efficiënter en ICM kwaliteit in vitro. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van de gebruikte ICMS met MGT construct van cardiale fibroblasten te genereren methodologie. Isolatie van cardiale fibroblasten, generatie virus herprogrammering en evaluatie van de herprogrammeringsproces zijn ook een platform voor efficiënte en reproduceerbare generatie ICMS verschaffen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hart- en vaatziekten blijven de belangrijkste doodsoorzaak wereldwijd, goed voor 17,3 miljoen sterfgevallen per jaar1. Verlies van cardiomyocyten als gevolg van een hartinfarct (MI) of progressieve hartfalen is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit2. Vanwege de beperkte regeneratieve capaciteit, hebben volwassen zoogdierharten meestal last van een verminderde pompfunctie en hartfalen na een blessure3-6. Daarom is efficiënte (re)generatie van cardiomyocyten in vivo en in vitro voor de behandeling van hartaandoeningen en voor ziektemodellering een cruciaal probleem dat moet worden aangepakt.

Recente ontwikkeling van directe herprogrammering, die cellen rechtstreeks van de ene gedifferentieerde vorm naar een andere omvormt zonder over te gaan naar de pluripotente toestand, biedt een veelbelovende alternatieve aanpak voor regeneratieve geneeskunde. Het zoogdierhart bevat overvloedige cardiale fibroblasten (CFs), die ongeveer de helft van de cellen in het hart uitmaken en massief proliferatie vertonen na een blessure7-9. Dus, de enorme pool van CFs zou kunnen dienen als een endogene bron van nieuwe CM's voor regeneratieve therapie als ze direct kunnen worden omgeprogrammeerd tot functionele CM's. Het is aangetoond dat een combinatie van transcriptiefactoren, zoals Gata4 (G), Mef2c (M) en Tbx5 (T), met of zonder microRNA's of kleine moleculen, fibroblasten kan omzetten in iCM's10-26. Belangrijk is dat deze omzetting ook in vivo kan worden geïnduceerd en resulteert in een verbetering van de hartfunctie en een vermindering van de littekengrootte in een infarcteerde hart16,27-29. Deze studies geven aan dat directe hartherprogrammering een potentiële mogelijkheid kan zijn om een beschadigd hart te genezen. Echter, de lage efficiëntie van iCM-herprogrammering is een groot obstakel geworden voor verdere mechanistische studies. Bovendien is de reproduceerbaarheid van hartherprogrammering een andere controversiële kwestie van deze technologie11,30,31.

Zeer recent hebben we een complete set van polycistronische constructen gegenereerd die G, M, T coderen in alle mogelijke splitsingsvolgordes met identieke 2A-sequenties in een enkel mRNA. Deze polycistronische constructen leverden gevarieerde G, M en T eiwitexpressieniveaus op, wat leidde tot significant verschillende herprogrammeringsefficiëntie25. De meest efficiënte construct, genaamd MGT, die een relatief hoge Mef2c en lage Gata4 en Tbx5 expressie vertoonde, verbeterde aanzienlijk de herprogrammeringsefficiëntie en produceerde grote hoeveelheden iCM's met CM-markersexpressie, robuuste calciumoscillatie en spontaan kloppen25. Bovendien, door het gebruik van de MGT-polycistronische construct, vermeed onze studie het gebruik van meerdere vectoren en genereerde cellen met een homogene expressieverhouding van G, M, T, waardoor een verbeterd platform werd geboden voor onderzoek naar hartherprogrammering. Om de experimentele reproduceerbaarheid te verhogen, beschrijven we hier in detail hoe fibroblasten kunnen worden geïsoleerd, retrovirus met de MGT-cassette kunnen worden geproduceerd, iCM's kunnen worden gegenereerd en de herprogrammeringsefficiëntie kan worden geëvalueerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol hier geschetste gebruikt neonatale muizen. Dierlijke zorg en experimenten worden uitgevoerd in overeenstemming met de door de afdeling Laboratory Animal Medicine (DLAM) aan de Universiteit van North Carolina, Chapel Hill richtlijnen.

1. Bereiding van Buffers en media

  1. Bereid fibroblast (FB) medium: Supplement 500 ml IMDM-medium met 100 ml foetaal runderserum (FBS) en 6 ml penicilline / streptomycine.
  2. Bereid ICM medium: Supplement 400 ml DMEM medium met 100 ml M199 media en 50 ml FBS.
  3. Bereid B27 medium: Supplement 490 ml RPMI1640 media met 10 ml B27 media.
  4. Bereid Plat-E kweekmedium: Supplement 500 ml DMEM medium met 50 ml FBS, 5 ml penicilline / streptomycine en 5 ml niet-essentiële aminozuren.
  5. Bereid Plat-E transfectiemedium: Supplement 500 ml DMEM medium met 50 ml FBS en 5 ml niet-essentiële aminozuren.
  6. Prepare gelatine gecoate 24 wells plaat: Voeg 0,5 ml 0,1% gelatine-oplossing met een putje van 24 putjesplaat, incubeer bij 37 ° C gedurende ten minste 10 minuten en zuig vlak voor gebruik.
  7. Bereid FACS labeling buffer: Supplement 500 ml DPBS met 10 ml FBS en 2 ml EDTA (0,5 M) tot een eindconcentratie van 2 mM te bereiken. Passeren door een 0,22 pm filter en bewaar bij 4 ° C.
  8. Bereid sorteren MACS buffer: Supplement 500 ml DPBS met 2,5 g BSA en 2 ml EDTA (0,5 M) tot een eindconcentratie van 2 mM te bereiken. Passeren door een 0,22 pm filter en bewaar bij 4 ° C.
  9. Bereid 2x HBS buffer voor transfectie: aanvullen 500 ml HEPES-buffer (50 mM) met 280 mM NaCl (8,1816 g), 10 mM KCl (0,37275 g), 1,5 mM Na 2 HPO 4 (0,10647 g), 12 mM glucose (1,08096 g ). Voeg ongeveer 650 pi 10 N NaOH om de pH op 7,05-7,12. Filteren door een 0,22 pm porie filter en bewaar bij 4 ° C.
  10. Bereid 2,5 M CaCl2-oplossing voor transfectie: Voeg 18,376 g CaCl 2 om 50 ml DDH 2 O. Filteren door een 0,22 pm porie filter en bewaar bij 4 ° C.
  11. Bereid ICC (immunocytochemie) fixatie buffer: Voeg 5 ml paraformaldehyde (PFA, 32%) tot 35 ml DPBS tot een uiteindelijke concentratie van 4% te bereiken.
  12. Bereid ICC permeabilisatie buffer: Voeg 0,1 ml Triton tot 100 ml DPBS tot een eindconcentratie van 0,1% te bereiken.
  13. Bereid ICC blokkerende buffer: Voeg 5 g Bovine serum albumine (BSA) tot 100 ml DPBS tot een eindconcentratie van 5% bereikt.
  14. Bereid ICC kleurbuffer Voeg 1 g BSA tot 100 ml DPBS tot een uiteindelijke concentratie van 1% te bereiken.

2. Generatie van neonatale muis Cardiale fibroblasten

  1. Genereren van cardiale fibroblasten van explantatie kweekmethode
    1. Clean neonatale αMHC-GFP transgene muizen (P1 tot P2) met 75% ethanol. Snijd het hoofd af met een steriele schaar. Vervolgens een horizontale incisie onder een oksel naar de andere. Gebruik een sterielestompe en gebogen tang om ontleden uit het hart en plaats het in een putje van de 24 wells plaat met ijskoud PBS buffer.
      1. Als alternatief, knijp het hart na de horizontale snede.
    2. Check GFP expressie in hart door fluorescentiemicroscoop. Omdat de GFP expressie wordt gedreven door αMHC promoter die een cardiale specifieke promotor, moet het hart van transgene muizen in groen 15, terwijl de negatieve hart is zwak in een fluorescentie.
    3. Neem 3-4 GFP positieve harten in een 60 mm centrum goed cultuur schotel en gehakt ze in kleine stukjes van minder dan 1 mm 3 in grootte door een steriele schaar en pincet.
    4. Plaats 3-4 gehakt harten in een 10 cm schotel met 2 ml FB media. Laat de weefsels settelen voor 3 uur.
    5. Voeg langzaam 8 ml voorverwarmde FB media om de gerechten met hart weefsels. Laat de weefsels niet storen voor drie dagen.
    6. Vervang de media om de drie dagen.
    7. Op dag 7, Aspiraten het kweekmedium en was cellen met DPBS. Voeg 3 ml 0,05% trypsine aan elke plaat en vertering bij 37 ° C gedurende 5 min.
    8. Voeg 5 ml FB media om trypsine te lessen. Voorzichtig los van de cellen met een cel schraper. Pipet de media op en neer om verder mechanisch distantiëren van het weefsel.
    9. Verzamel cellen en filtreer door 40 urn cel filters verontreinigd hartweefsel fragmenten te vermijden, en vervolgens pellet cellen door spinnen bij 200 xg gedurende 5 min.
    10. Was cellen eenmaal met MACS buffer en cellen zijn klaar voor het sorteren.
  2. Genereren van cardiale fibroblasten van enzymdigestie methode
    1. Oogst GFP positieve harten als 2.1.1. Breng alle harten in een 10 cm schaal met 10 ml ijskoude DPBS.
    2. Knijp ventrikels met een steriel pincet om bloed te verwijderen en een keer spoelen met ijskoude DPBS.
    3. Trim de harten vrij van andere weefsels en vet te zijn.
    4. Snijd elk hart in ongeveer 4 stukken die nog steeds losjes verbonden zijn.
    5. Indien minder dan 20 harten, breng de harten in een 15 ml conische buis met 8 ml warme 0,05% trypsine-EDTA, en incubeer bij 37 ° C gedurende 15 min.
      1. Als er 20-30 harten, breng de harten in een 50 ml conische buis met 10 ml warme 0,05% trypsine-EDTA, en incubeer bij 37 ° C gedurende 15 min.
    6. Gooi het trypsine en voeg 5 ml (minder dan 20 harten) of 10 ml (20-30 harten) warm type II collagenase (0,5 mg / ml) in HBSS.
    7. Vortex de buis op vortexer gedurende 1 min bij een snelheidsniveau ongeveer 4 tot 6 (indien de vloeistof niet opstaan ​​om het deksel wordt het toerental is goed).
    8. Incubeer de buis 37 ° C waterbad gedurende 3-5 min.
    9. Vortex de buis gedurende 1 min.
    10. Sediment gedurende 1 minuut door de zwaartekracht tot het weefselstukken vestigen, verzamel de vloeistof in een nieuwe buis met 5 ml koud FB medium.
    11. Herhaal stappen 2.2.6-2.2.10 3-5 keer.
    12. Combineren alle collecties door te filteren door middel van 40 micrometer cel zeefom enkele celsuspensie te maken.
    13. Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
    14. Resuspendeer cellen in 10 ml MACS-buffer en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
    15. Optioneel: Als er veel bloedcellen, resuspendeer cellen met 1 ml RBC lysis buffer (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO3 en 0,1 mM EDTA), houdt op ijs gedurende 1 minuut, daarna verdund met 10 ml MACS buffer en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 min. Was nog een keer met MACS buffer.
  3. Isolatie van Thy1.2 + fibroblasten door MACS (magnetische-geactiveerde cel sortering)
    1. Bepaal aantal levensvatbare cellen door middel van trypan blauwe vlekken.
      1. Neem 10 pi cellen uit 10 ml celsuspensie in stap 2.2.14. Meng het met 10 pi 0,4% trypan blauwe oplossing.
      2. Voeg het mengsel van een hemocytometer. Laat het 3-5 minuten staan ​​en dan onmiddellijk te onderzoeken onder een microscoop. De dode cellen zijn gekleurd in blauw en levensvatbare cellen ongekleurd.
      3. Tel alle levensvatbare cellen in vier 1 mm hoek pleinen van de hemocytometer. Bepaal het aantal levensvatbare cellen: het gemiddelde aantal per vierkante x 2 (verdunningsfactor) x 10 4 x 10 (totaal volume van celsuspensie).
    2. Voor minder dan 1 x 10 7 cellen, resuspendeer cellen met 10 pi Thy1.2 microbolletjes in 90 gl gekoeld MACS buffer. Voeg meer parels verhouding als er meer dan 1 x 10 7 cellen. Goed mengen en incuberen in een koelkast (2-8 ° C) gedurende 30 min.
    3. Voeg 10 ml MACS-buffer en centrifugeren monsters bij 200 xg gedurende 5 min; eenmaal wassen met 10 ml MACS-buffer en centrifugeer weer.
    4. Breng volume op 2 ml in MACS buffer.
    5. Het opzetten van een MACS Separator in capuchon. Plaats een LS kolom aan de separator. Breng 3 ml MACS buffer aan de kolom te equilibreren.
    6. Leid de celsuspensie door de LS kolom geëquilibreerd.
    7. Was 3 keer met 2 ml MACS buffer elke keer.
    8. Neem de kolom LS uit tHij Separator en elueer 3 maal met 2 ml MACS buffer naar een nieuwe 50 ml buis.
    9. Spin bij 200 xg gedurende 5 min.
    10. Resuspendeer cellen in 10 ml FB media, de telling van de cellen en zaad in platen op de juiste dichtheid. Voor fibroblasten gegenereerd uit explantaatkweek methode, kan de zaaien cellen dichtheid ongeveer 3/2 x 10 4 cellen / putje van de 24 wells plaat. Voor fibroblasten gegenereerd uit enzymdigestie methode, zou de cellen dichtheid ongeveer 5/4 x 10 4 cellen / putje van de 24 wells plaat.

3. Productie van retrovirus voor icm herprogrammeren

Opmerking: Voer de volgende stappen in een BSL2 bioveiligheidskast onder steriele omstandigheden. De correcte verwijdering van getransfecteerde cellen, pipetpunten en buisjes wordt aanbevolen om het risico van milieu- en gezondheidsrisico's te voorkomen.

  1. Handhaaf Plat-E cellen Plat-E medium aangevuld met 1 ug / ml puromycine en 10 ug / ml blasticidin bij 37 ° C met 5% CO2.
  2. Op dag 2, vervang het medium door Plat-E kweekmedium ontbreekt puromycine en blasticidine.
  3. Op dag 0, split Plat-E cellen in 10 cm schalen van de dag vóór transfectie bij ongeveer 4-5 x 10 6 cellen per plaat. De cellen moeten ~ 80-90% confluent op de dag van transfectie.
  4. Op dag 1, wijziging kweekmedia transfectie media op cellen binnen 1 uur voorafgaand aan transfectie. Transfectie procedure is als volgt:
    1. Transfectie met behulp van commerciële kits
      1. Meng 20 pl transfectiereagens (bijvoorbeeld Lipofectamine) en 500 ul verminderde serum media (bijvoorbeeld Opti-MEM). Voeg 10 pg van de retrovirale plasmide een 500 ul gereduceerd serum medium. Incubeer elk mengsel bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 min.
      2. Voeg langzaam het plasmide mengsel transfectie mengsel. Deze stap kan 15-30 seconden duren. Incubeer het mengsel gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (oplossing kan troebel).
      3. Voeg mengsel druppelsgewijs aan de cellen.
      4. Incubeer overnacht in een 37 ° C incubator.
    2. Transfectie met calciumfosfaat.
      1. Mix 40 pi 2,5 M CaCl 2 en 440 pl DDH 2 O, voeg dan 20 pg van de retrovirale plasmide (pas het bedrag van DDH 2 O, zodat de totale hoeveelheid is 500 pl).
      2. Voeg 500 ul 2x HBS een 15 ml conische buis.
      3. Vortex de HBS en ondertussen voeg de calcium-DNA-mengsel aan de HBS druppelsgewijs. Deze stap duurt ongeveer 30 seconden voor elk monster. Dus maximaal doen 3-4 monsters tegelijk.
      4. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 min Incubatie gedurende langere tijd leidt tot grotere neerslag en minder cellen zal de neerslag.
      5. Voeg het mengsel druppelsgewijs naar de cellen en acht onder 20X microscoop. Fijne precipitaten (een heleboel kleintjes zijn goed, maar een paar grote bedrijven zijn niet goed) moet worden gezien.
      6. Incubeer overnacht bij 37 ° C incubator.
  5. Op dag 2, veranderen de media op cellen met 8 ml voorverwarmd kweekmedium. Incubeer 24 uur.
  6. Op dag 3 en dag 4, verzamel kweeksupernatant van de schotels met een 10 ml steriele wegwerpspuit, filtering door een 0,45 urn poriegrootte celluloseacetaatfilter en overbrengen naar een 50 ml buis. Voeg 2 ml van retrovirus precipitatieoplossing elk 8 ml virus-bevattende supernatant. Voorzichtig mengen en incubeer overnacht bij 4 ° C.
  7. Op dag 5, draai het virale mengsel bij 1500 xg bij 4 ° C gedurende 30 min. De virale deeltjes moet in witte pellet op de bodem van de buis.
  8. Verwijder het supernatant. Spin down resterende oplossing door centrifugatie bij 1500 x g gedurende 5 min. Verwijder alle sporen van de vloeistof door aspiratie, het nemen van grote zorg van de neergeslagen retrovirale deeltjes niet te storen in pellet.
  9. Resuspendeer retrovirale pellets met 100 gl DPBS buffer voor elk 8 ml viraal supernatant. Evenmatighet virus op ijs. Onmiddellijk te gebruiken of op te slaan bij -80 ° C.

4. Herprogrammering van Cardiale fibroblasten

  1. Voeg 4 pi 10 mg / ml polybreen oplossing in de 10 ml Icm medium en meng voorzichtig op en neer te pipetteren. De eindconcentratie van polybreen is 4 ug / ml.
  2. Voeg 500 ul ICM medium dat polybreen aan elke well van 24 wells plaat geënt met fibroblasten.
  3. Voeg 10 ul retrovirus aan elk putje met ofwel 03/02 x 10 4 cellen uit explantatie cultuur of 5/4 x 10 4 cellen van enzymdigestie methode. De hoeveelheid virus proportioneel worden verhoogd met een verhoogd aantal cellen in verschillende kweekplaten of schotels. Plaats de plaat in een 37 ° C incubator gedurende 24-48 uur om de virale infectie toe. De tijdslijn cardiale herprogrammering wordt getoond in figuur 1.
  4. Na virale transductie, vervang virus bevattende media met 500 ul icm reguliere media.
  5. Veranderen de media om de 2-3 dagen. Voor positieve selectie van viraal getransduceerde cellen, voeg icm medium aangevuld met puromycine bij 2 ug / ml aan doelwitcellen. Houd het voor drie dagen. Daarna houden puromycine in de ICM medium bij een concentratie van 1 ug / ml.
  6. Drie dagen na virale infectie, neem de plaat uit de incubator en plaats het onder een omgekeerde fluorescentie microscoop (20X) om GFP expressie te observeren.
    Opmerking: Tien dagen na virale infectie, kunnen cellen voor FACS-analyse en ICC analyse om de herprogrammering efficiëntie vast worden geoogst (in stap 5 en 6).
  7. Veertien dagen na de virale infectie, vervang ICM media B27 media. Veranderen de media om de drie dagen. Spontane kloppende cel loci kan blijken uit drie (cellen van enzymdigestie methode) of vier (cellen van explantaatkweek methode) weken na de virale transductie.

5. Immunocytochemische Analyse van herprogrammeren Efficiency

  1. Rinse cellenmet ijskoud PBS driemaal; verwijdert overtollige oplossing.
  2. Voeg 0,5 ml ICC fixatie buffer aan elk putje van platen met 24 putjes. Fixeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 15-20 min.
  3. Spoel de cellen met PBS driemaal.
  4. Voeg 0,5 ml ICC permeabilisatie buffer aan elk putje van de 24 wells platen. Permeabilize de cellen bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
  5. Spoel de cellen met PBS driemaal.
  6. Voeg 0,5 ml ICC blockingbuffer elke well van 24 wells plaat, incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  7. Verdunde primaire antilichamen met ICC-vlekken buffer. Voeg 200 ul antilichaam oplossingen aan elk putje en incubeer overnacht bij 4 ° C. De antilichaamverdunning factoren worden opgesomd in Materials.
  8. De volgende dag wassen cellen met PBS driemaal.
  9. Voeg 200 ul secundair antilichaam oplossingen aan de cellen en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
  10. Was de cellen met PBS driemaal.
  11. Voeg 150 ul bevestigingsoplossing met DAPI aan elk putje. Laat kernen vlek gedurende 1 min. Danbestrijken elk putje met ronde glazen afdekplaat slip en druk de slip tegen de onderkant met een tang om luchtbellen te verwijderen.
  12. Zuig het overtollige oplossing en de monsters zijn klaar voor de beeldvorming. De representatieve beelden die de geherprogrammeerd cellen die uitdrukken cardiale marker cTnT en αActinin bij d14 zijn weergegeven in figuur 2B.

6. FACS analyse van herprogrammeren Efficiency

  1. Grondig cellen één keer met DPBS. Voeg 0,3 ml trypsine (0,05%) aan elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 min.
  2. Tik voorzichtig de plaat naar het opheffen van de cellen te vergemakkelijken. Controleer de cel detachement onder de microscoop. Voeg 1 ml FACS buffer aan elk putje wanneer de meeste cellen worden gescheiden. Pipet op en neer om verder mechanisch scheiden van de cellen.
  3. Transfer cellen in de 24 wells plaat met een 96 well diepe well plaat ook goed. Spin bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C om de cellen te verzamelen.
  4. Was de cellen eenmaal metFACS buffer.
  5. Voeg 100 ul fixatie / permeabilisatie oplossing om cellen opnieuw in suspensie gedurende 20 min bij 4 ° C.
  6. Was de cellen tweemaal met 1x wasoplossing, pellet en verwijder supernatant.
  7. Bereid primaire antilichaam oplossing tegen GFP en cTnT in 1x wasbuffer. Grondig mengen elk monster met 50 gl antilichaamoplossing en incuberen bij 4 ° C gedurende 30 min.
  8. Was cellen eenmaal in 1x wasoplossing, pellet en verwijder supernatant.
  9. Voeg 50 ul secundair antilichaam oplossing met Alexa Fluor 488 geconjugeerd ezel anti-konijn IgG en Alexa Fluor 647-geconjugeerd ezel-anti muis IgG aan elk monster. Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 min in het donker.
  10. Was cellen eenmaal in 1x wasoplossing, pellet en verwijder supernatant.
  11. Resuspendeer cellen in 400 gl fixatie buffer (DPBS met 1% PFA). Transfer cel in FACS buis met cel zeef dop. Monsters zijn klaar voor FACS detectie. De vertegenwoordiger FACS analyse van de herprogrammering efficiency behulp pMxs-puromycine-MGT construct met of zonder puromycine selectie wordt getoond in figuur 2A.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De herprogrammering stappen zijn samengevat schema in figuur 1. Na MGT transductie kan GFP expressie in cellen herprogrammering al op dag 3. Puromycineselectie van getransduceerde cellen begint vanaf dag 3 en de eerste twee weken gehandhaafd wordt waargenomen PMX-puro -MGT construct wordt gebruikt. Overdag 10 tot dag 14, zou expressie van cardiale markers zoals cTnT en αActinin worden gedetecteerd door zowel ICC (figuur 2B, stap 5) en FACS (Figuur 2A, stap 6), wat aange...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor een succesvolle ICM generatie bij het gebruik van dit protocol, zijn er een aantal belangrijke factoren die een impact hebben op de algehele efficiëntie. Vooral de voorwaarden van het starten van fibroblasten en de kwaliteit van retrovirus dat codeert MGT kan grote invloed herprogrammering efficiency.

Het is belangrijk om fibroblasten als vers en gezond mogelijk te genereren. Voor explantaatkweek werkwijze kan fibroblasten worden gebruikt voor zeven dagen na de explantaten werden uitgep...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zijn dankbaar voor de deskundige technische assistentie van de UNC Flow Cytometry Core en de UNC Microscopy Core. We danken de leden van het Qian lab en het Liu lab voor de nuttige discussies en kritieke beoordelingen van het manuscript. Dit onderzoek werd ondersteund door de NIH/NHLBI R00 HL109079-subsidie aan Dr. Liu en de American Heart Association (AHA) Scientist Development Grant 13SDG17060010 en de Ellison Medical Foundation (EMF) New Scholar Grant AG-NS-1064-13 aan Dr. Qian.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
anti-cardiac troponin TThermo ScientificMS-295-PO1:200 voor FACS en 1:400 voor ICC
anti-GFPLife TechnologiesA111221:500 voor zowel FACS als ICC
anti- aActininSigma-AldrichA78111:500 voor zowel FACS als ICC
anti-Connexin43Sigma-AldrichC62191:500 voor  ICC
anit-Mef2cAbcamab646441:1.000 voor ICC 
anti-Gata4Santa Cruz Biotechnologysc-12371:200 voor ICC
anti-Tbx5Santa Cruz Biotechnologysc-178661:200 voor ICC
Alexa Fluor 488–geconjugeerd donkey anti-rabbit IgGJackson ImmunoResearch Inc711-545-1521:500 voor zowel FACS als ICC
Alexa Fluor 647–geconjugeerd donkey anti-mouse IgGJackson ImmunoResearch Inc715-605-1501:500 voor zowel FACS als ICC
Cytofix/Cytoperm kit voor intracellulair kleuringBD Biosciences554722
Rhod-3 Calcium Imaging KitLife TechnologiesR10145
Thy1.2 microbeadsMiltenyi Biotec130-049-101
Vectashield oplossing met DAPIVector labsH-1500
FBSSigma-AldrichF-2442
Trypsin-EDTA (0,05%)Corning25-052
PRMI1640 mediumLife Technologies11875-093
B27 supplementLife Technologies17504-044
IMDMLife Technologies12440-053
Opti-MEM Reduced Serum MediumLife Technologies31985-070
M199 mediumLife Technologies10-060
DMEM, hoge glucoseLife Technologies10-013
Penicilline-streptomycineCorning30-002
Niet-essentiële aminozurenLife Technologies11130-050
Lipofectamine 2000Life Technologies11668500
blasticidinLife TechnologiesA11139-03
puromycinLife TechnologiesA11138-03
Collagenase IIWorthingtonLS004176
polybreneMilliporeTR-1003-G
Triton X-100FisherBP151-100
CaCl2Sigma-AldrichC7902
HEPESSigma-AldrichH4034
NaClSigma-AldrichBP358-212
KClSigma-AldrichPX1405
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
GlucoseSigma-AldrichG6152
Bovine serum albumineFisher9048-46-8
paraformaldehydeEMS15714
Retrovirus Precipitatie OplossingALSTEMVC-200
0,4% Trypan blauw oplossingSigma-AldrichT8154
gelatineSigma-AldrichG1393
Dulbecco's PBS zonder CaCl2 en MgCl2 (D-PBS, 1x)Sigma-AldrichD8537
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)Corning21022
LS kolomMiltenyi Biotec130-042-401
0,45 μm cellulose acetaat filter Thermo Scientific190-2545
24-well platesCorning3524
10 cm weefselkweek schotels Thermo Scientific172958
60 mm center well kweekschotel  Corning3260
96 Well Clear V-Bottom 2 ml Polypropylene Deep Well PlateDenville ScientificP9639
Polystyreen ronde bodem buizen met cel-strainer dop BD Biosciences352235
CentrifugeEppendorf5810R
Vortexer MINIVWR58816-121
EVOS FL Auto Cell Imaging SystemLife TechnologiesAMAFD1000
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
MidiMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-302
Ronde glazen dekselElectron Microscopy Sciences72195-15

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2015 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. , (2014).
  2. Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, (2010).
  3. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493, 433-436 (2013).
  4. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
  5. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17169-17174 (2009).
  6. Choi, W. Y., Poss, K. D. Cardiac regeneration. Curr Top Dev Biol. 100, 319-344 (2012).
  7. Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A. Cardiac fibroblast: the renaissance cell. Circ Res. 105, 1164-1176 (2009).
  8. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16, 233-244 (2009).
  9. Moore-Morris, T., et al. Resident fibroblast lineages mediate pressure overload-induced cardiac fibrosis. J Clin Invest. 124, 2921-2934 (2014).
  10. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
  11. Chen, J. X., et al. Inefficient reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes using Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 50-55 (2012).
  12. Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8, e63577(2013).
  13. Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1, 235-247 (2013).
  14. Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100, 105-113 (2013).
  15. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142, 375-386 (2010).
  16. Inagawa, K., et al. Induction of cardiomyocyte-like cells in infarct hearts by gene transfer of Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 1147-1156 (2012).
  17. Islas, J. F., et al. Transcription factors ETS2 and MESP1 transdifferentiate human dermal fibroblasts into cardiac progenitors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 13016-13021 (2012).
  18. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110, 1465-1473 (2012).
  19. Muraoka, N., et al. MiR-133 promotes cardiac reprogramming by directly repressing Snai1 and silencing fibroblast signatures. Embo J. 33, 1565-1581 (2014).
  20. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141, 4267-4278 (2014).
  21. Nam, Y. J., et al. Reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 5588-5593 (2013).
  22. Protze, S., et al. A new approach to transcription factor screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells. J Mol Cell Cardiol. 53, 323-332 (2012).
  23. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8, 1204-1215 (2013).
  24. Wang, H., et al. Small Molecules Enable Cardiac Reprogramming of Mouse Fibroblasts with a Single Factor, Oct4. Cell Rep. , (2014).
  25. Wang, L., et al. Stoichiometry of Gata4, Mef2c, and Tbx5 Influences the Efficiency and Quality of Induced Cardiac Myocyte Reprogramming. Circ Res. , (2014).
  26. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  27. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
  28. Mathison, M., et al. In vivo cardiac cellular reprogramming efficacy is enhanced by angiogenic preconditioning of the infarcted myocardium with vascular endothelial growth factor. J Am Heart Assoc. 1, e005652(2012).
  29. Srivastava, D., Ieda, M., Fu, J., Qian, L. Cardiac repair with thymosin beta4 and cardiac reprogramming factors. Ann NY Acad Sci. 1270, 66-72 (2012).
  30. Muraoka, N., Ieda, M. Stoichiometry of transcription factors is critical for cardiac reprogramming. Circ Res. , 116-216 (2015).
  31. Srivastava, D., Ieda, M. Critical factors for cardiac reprogramming. Circ Res. 111, 5-8 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Induced CardiomyocytesCardiac FibroblastsPolycistronic ConstructGata4 Mef2c Tbx5Retroviral ReprogrammingCell IsolationFlow Cytometry AnalysisImmunochemistry DetectionPurmycin SelectionGFP Expression

Gerelateerde artikelen