Real-time beeldvorming van Plant Cell Surface Dynamics met variabele hoek epifluorescentiemicroscopie

Summary

Het doel van dit protocol is om te demonstreren hoe fluorescent-gelabelde eiwit dynamiek op plantencel oppervlakken met een variabele hoek epifluorescentiemicroscopie, waaruit blijkt knipperende stippen van GFP-gelabeld PATROL1, een membraan mensenhandel eiwit te controleren, in de cel cortex van de stomatale complex in Arabidopsis thaliana.

Abstract

Het celoppervlak van een plant is zijn interface voor het waarnemen van omgevingssignalen; het reageert met cellulaire biologische veranderingen zoals membraantransport en herschikking van het cytoskelet. Real-time en hoogwaardige beeldanalyse van dergelijke intracellulaire gebeurtenissen zal het begrip van de plantencelbiologie op moleculair niveau vergroten. Variabele hoek epifluorescentiemicroscopie (VAEM) is een opkomende techniek die hoogwaardige, time-lapse beelden levert van fluorescentie-gelabelde eiwitten op het oppervlak van plantencellen. In dit artikel worden praktische procedures beschreven voor VAEM monstervoorbereiding, aanpassing van het VAEM optische systeem, het vastleggen van films en beeldanalyse. Als voorbeeld van VAEM observatie, worden representatieve resultaten gepresenteerd over de dynamiek van PATROL1. Dit is een eiwit dat essentieel is voor stomatale beweging, waarvan wordt gedacht dat het betrokken is bij de levering van protonpompen aan plasmamembranen in het stomatale complex van Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observatie van begeleidende cellen en hulpcellen in A. thaliana cotyledonen toonde aan dat fluorescentie-gelabeld PATROL1 verscheen als puntvormige structuren op plasmamembranen voor enkele seconden en vervolgens verdween. Kymograafanalyse van VAEM filmgegevens bepaalde de tijdsverdeling van de aanwezigheid (genoemd'verblijfstijd') van de puntvormige structuren. Het gebruik van VAEM wordt besproken in de context van dit voorbeeld.

Introduction

Het oppervlak van de plantencel, inclusief het plasmamembraan en het direct aangrenzende cytoplasma, is het belangrijkste gebied van een plantencel voor het waarnemen en integreren van biotische en abiotische signalen uit de extracellulaire omgeving. In reactie op deze signalen ondergaan componenten van het celoppervlak, inclusief plasmamembraaneiwitten en het corticale cytoskelet, dynamische veranderingen, op een tijdschaal van seconden tot minuten^1-4. Dus, real-time en hoog-resolutie beeldvorming van fluorescente eiwitten op het celoppervlak kan de reacties van een plant op omgevingssignalen op moleculair niveau verduidelijken.

Confocale laser scanning microscopie is een krachtig hulpmiddel voor het bepalen van de lokalisatie van fluorescent gelabelde eiwitten³, maar het is vaak moeilijk om de dynamische eiwitreacties in real-time te monitoren vanwege de relatief lange opnametijden. Een opkomende techniek voor real-time monitoring van eiwitten in de plantencel is variabele hoek epifluorescentie microscopie (VAEM), een aanpassing van apparatuur die meestal wordt gebruikt voor totaal interne reflectie fluoresceren (TIRF) microscopie. In TIRF microscopie is de fluoresceren-excitatieverlichtingsbron een evanescent lichtveld dat wordt gegenereerd wanneer de invalshoek van de laser ondiep genoeg is om licht volledig intern te reflecteren op het glas-water grensvlak. De penetratiediepte van het evanescente lichtveld is ongeveer 100 nm. TIRF microscopie is een uitstekend hulpmiddel voor single molecuul beeldvorming, zoals de detectie van exocytose in dierlijke cellen⁵. Evanescent licht kan echter geen plasmamembranen of het corticale cytoplasma in plantencellen bereiken, omdat ze dikke celwanden hebben. Recentelijk is TIRF microscopie apparatuur aangepast door plantencel biologen, die observeerden dat een laser, als deze iets dieper wordt ingezet dan wanneer het wordt gebruikt om totale interne reflectie fenomenen te induceren, het oppervlak van plantencel monsters kan exciteren, resulterend in hoogwaardige plantencel beeldvorming^6,7. De excitatie verlichtingsdiepte wordt gevarieerd door de invalshoek van de laser aan te passen; daarom wordt deze techniek beschreven als VAEM. Dit optisch systeem wordt ook wel variabele hoek TIRF microscopie (VA-TIRFM) genoemd omdat er een mogelijkheid is dat totale reflectie plaatsvindt op het celwand-periplasma grensvlak⁷, maar de term VAEM wordt in dit artikel gebruikt, zoals in het eerste rapport in planten⁶.

Het doel van dit protocol is om praktische procedures te demonstreren voor het gebruik van VAEM om fluorescent gelabelde eiwitdynamiek op plantenceloppervlakken te visualiseren. Daarnaast wordt een beeldanalyse protocol beschreven om de verblijfstijd (duur van aanwezigheid) van moleculen te kwantificeren voor VAEM filmanalyse. GFP-PATROL1 stippen knipperen op stomata complex cellen in Arabidopsis thaliana cotyledonen wordt gebruikt als voorbeeld. PATROL1 werd geïdentificeerd door forward genetische benaderingen als een oorzakelijk gen van een stomata respons defect mutant in A. thaliana⁸. PATROL1 is een plantenhomoloog van MUNC-13, dat een priming factor is in synapsische blaasjes exocytose⁸. In reactie op omgevingssignalen, zoals licht of vochtigheid, wordt gedacht dat PATROL1 reversibel de levering van een protonenpomp aan plasmamembranen in het stomata complex reguleert. Stomatal complexen bestaan elk uit een paar begeleidende cellen⁸ en bijbehorende cellen⁹, en ze hebben een protonenpomp nodig voor stomata beweging. In deze cellen lokaliseert GFP-gelabeld PATROL1 naar stippen-achtige structuren die minder dan 1 minuut op het plasmamembraan blijven⁹.

Protocol

1. Bereiding van Zaailingen

1. Steriliseren van de zaden.
   1. Bereid de sterilisatie door toevoeging van 500 pi NaClO (chloor: 5,0%) en 1 ui 10% Triton X-100 om 500 pi steriel water.
   2. Plaats ca. 10 transgene A. thaliana zaden dragen GFP-PATROL1 ⁸ in een 1,5 ml buis.
   3. Voeg 1 ml 70% ethanol-oplossing en meng goed door het omkeren vijfmaal. Laat gedurende 1 min.
   4. Observeer de zaden zinken naar de bodem van de buis. In een schone laminaire stroming kast, verwijder voorzichtig de 70% ethanol met behulp van een micropipet, en voeg 1 ml sterilisatie oplossing. Meng goed door omkeren vijfmaal en laat gedurende 5 min.
   5. Was de zaden. Nog steeds onder aseptische omstandigheden op een schone bank, verwijder voorzichtig de oplossing met behulp van een micropipet, en voeg 1 ml steriel water. Herhaal dit vijf keer. De gesteriliseerde zaden worden bewaard in steriel water bij 4 ° C gedurende 2 dagen.
2. Zow de gesteriliseerde zaden op een 0,5% gellan-gom gestold 1/2 Murashige en Skoog medium plaat (pH 5,8) ^9. Tape het deksel op de plaat met behulp van twee lagen van chirurgische tape.
3. Incubeer de plaat in het donker bij 4 ° C met een koude opslagkamer, O / N.
4. Breng de plaat in een groeikamer ingesteld op 23,5 ° C met een 12-uur / 12-uur licht-donker cyclus met 100 umol m ^-2 s ^-1 witte lichten, en incubeer gedurende 7 dagen. Zaailingen met zaadlobben van ongeveer 1 mm lang kan vervolgens worden geoogst.

2. Sky Drop Montage van Cotyledon Specimens

LET OP: Een belangrijke factor bij het prepareren voor VAEM observatie is het vermijden van het opnemen van luchtbellen tussen het model en het deksel glas. Bubbles sterk verminderen van de beeldkwaliteit van VAEM door het veroorzaken verschillen in de brekingsindex. Een eenvoudige methode die wij "sky drop 'hebben genoemd montage, kan worden gebruikt om luchtbellen te vermijdentussen A. thaliana zaadlobben en het deksel glas. Dit moet gebeuren onmiddellijk voor observatie.

1. Plaats 30 gl buffer basale [5 mM 2- (N -morpholino) -ethanesulfonic acid-Tris (MES-Tris) bij pH 6,5, 50 mM KCl, 100 pM _CaCl2] in het midden van een glasplaatje (size: 76 x 26 mm, dikte: 1,0-1,2 mm).
2. Verwijderen van een zaadlob van een 7-dagen oude zaailing met het ontleden van een schaar. Float de zaadlob met de waarneming naar boven op de basale buffer druppel (Figuur 1, stap 1).
3. Plaats 30 gl basale buffer in het midden van een dekglas (grootte: 18 x 18 mm, dikte: 0,12-0,17 mm) (Figuur 1, stap 2). Draai het deksel glas ondersteboven voorzichtig. Oppervlaktespanning de buffer daling kunnen vallen te voorkomen. Houd het deksel glas met een pincet op een rand. Plaats de tegenoverliggende rand van het glaasje zodat de buffer druppel is ongeveer boven de zaadlob.
4. Met de rand van het deksel glas nog steeds op de glijbaan, en nog steeds de tegenoverliggende rand met een pincet, stel de positie van de buffer vallen onder de dekking van glas, zodat het direct boven de zaadlob monster (Figuur 1, stap 3). Loslaten van het deksel glas. Monteer een druppel op het monster resulteert in een preparaat zonder luchtbellen.
5. Veeg overtollige buffer met behulp van niet-pluizende weefsels. Onmiddellijk houden aan de voorbereiding (zie stap 3).
   Opmerking: Het is niet nodig om de monsters te verzegelen.

3. VAEM observatie en Movie Acquisition

Opmerking: Een omgekeerde microscoop is uitgerust met een TIRF eenheid en TIRF objectieflens met een numerieke apertuur van 1,49: The TIRF microscoopsysteem ⁹ toegepast in dit onderzoek wordt als volgt beschreven. Voor geautomatiseerde regeling van de laser inloophoek is een schakelkast gebruikt. Groen fluorescent eiwit (GFP) wordt geëxciteerd met een 488 nm optisch gepompte halfgeleiderlaser en thij fluorescentie wordt gedetecteerd door een 510-550 nm banddoorlaatfilter om autofluorescentie voorkomen chloroplasten. De gemeten maximale waarde van vezels uitgangsvermogen is 13,0-13,5 mW. Voor de detectie, een elektron te vermenigvuldigen charge-coupled device (EM-CCD) camera hoofd-systeem en een C-mount camera vergroting verandering unit worden gebruikt.

1. Kalibreer de laser centreren en richten volgens de instructies van de fabrikant.
   OPMERKING: Deze stap is cruciaal voor nauwkeurige VAEM waarnemingen. Het wordt sterk aanbevolen dat de periodieke controles van de aanpassing procedures laser pad, afhankelijk van uw microscoop, worden uitgevoerd.
   1. Bepaal de centrale positie verlicht met een objectief-lens vrije lichtpad op het plafond van de microscopie kamer. Naar de centrale positie te markeren, zet een gekleurde cirkel zegel op het plafond (afbeelding 2, stap 1, 2).
   2. Verlichten het plafond met een objectieflens (figuur 2, stap 3, 4). Verplaats de illuminated regio in de middelste stand (figuur 2, stap 5). Concentreer de laser (figuur 2, stap 6). Fijn afstellen van de positie van de gefocusseerde laser naar het midden (figuur 2, stap 7).
2. Stel een exemplaar op het podium van de microscoop en selecteer cellen voor observatie met behulp van helderveld verlichting.
3. Controleer of de fluorescerende eiwit kan worden waargenomen in de cellen, en de ingestelde positie van de z-as op het celoppervlak via epifluorescentie belichting (Figuur 3A).
4. Voeren VAEM waarnemingen.
   1. Neig de ingang hoek van de laserstraal geleidelijk met de doos controller. Op hetzelfde moment, het toezicht op de livebeeld zorgvuldig. In eerste instantie zal het beeld wazig zijn (Figuur 3B).
   2. Als de laser hoek toeneemt, zal het beeld op de VAEM minder vervaagd, een helder beeld (Figuur 3C en D) uiteindelijk produceren. Op dit punt, stop increazingen de laser hoek. Als de fluorescentie signaal verloren, afnemen tot een ondieper hoek.
   3. Fine-tunen van de laser ingang hoek om een ​​beter beeld te krijgen. Fine-tuning van de positie van de z-as kan ook het verbeteren van het beeld. Indien nodig, de optische parameters (laservermogen, golflengte en filter set) en de beeldsensor parameters [beeldgrootte, belichtingstijd, winst, digitizer en elektron te vermenigvuldigen (EM) winst].
      OPMERKING: Bij de TIRF microscoop uitrusting hierboven beschreven representatieve parameters als volgt. Vergroting van de lens vlak voor de camera: 2X; Laser-uitgang: 1,0 mW; Beeldformaat: 512 × 512 pixels; Belichtingstijd: 100 msec; Gain: 5 ×; Digitizer: 11 MHz; en EM winst: 100.
5. Verwerven van een film als een multi-page TIFF image-bestand met de commerciële microscoop software. Hier is de film van met GFP gemerkte dots knippert op het oppervlak van stomatale cellen.
   OPMERKING: representatief beeld acquisitie voorwaarden zijn foldieptepunten. Acquisitie modus: Stroom naar RAM; Aantal beelden: 600; en multi-page TIFF bestandsgrootte: ~ 302 MB.

4. kymograaf Analyse voor kwantificatie van GFP-gelabelde Dot Residence tijd met behulp van Fiji Software

1. Installeer Fiji (Fiji is slechts ImageJ ') software ¹⁰ met behulp van de instructies van de auteurs (http://fiji.sc/Fiji).
2. Run Fiji en open de verworven multi-page TIFF-bestand met behulp van de Fiji-menu "Bestand-Open".
3. Plaats een lijn op de plaats van belang, met behulp van de Fiji-werkbalk menu "Rechte Lijn Selection Tool". Optioneel gebruik maken van de "gesegmenteerde Line Selection Tool" of "Freehand Line Selection Tool". In de hier gepresenteerde resultaten is een rechte lijn van 100 pixels (overeenkomend met 8,0 um) subsidiair cellen (Figuur 4A) geplaatst.
4. Maak kymograaf beeld met behulp van de Fiji-menu "Beeld-Stacks-Dynamic Reslice een '(http://fiji.sc/Dynamic_Reslice) (Figuur 4B). Eventueel "Flip verticaal" en "Rotate 90 graden" in een vakje raam zijn ook (niet gebruikt in de hier gepresenteerde resultaten). De x- en y-as beeld kymograaf geven de lijn positie (overeenkomend met 100 pixels 8,0 micrometer) en observatie tijd (600 pixels dat overeenkomt met 60 sec), respectievelijk. Als het beeld kymograaf niet bevredigend is, de positie en het type (rechte, gesegmenteerd en uit de vrije hand) van de lijn op het meerdere pagina's kan worden gewijzigd. Als de lijn verandert, beeld kymograaf dynamisch verandert. Sla beeld kymograaf als een TIFF-bestand met behulp van de Fiji-menu "Bestand-Save As-Tiff".
5. Meet de lengte van de blob in de richting van de tijdas.
   1. Om geluidsreductie te voeren, breng dan een Gauss-filter om de kymograaf beelden met behulp van de Fiji-menu "-Filters-Gaussian Blur". De "Sigma (Radius) "parameter instelbaar is (1 pixel radius wordt gebruikt voor de gepresenteerde resultaten).
   2. Segment het signaal regios drempelen, met behulp van de Fiji-menu "Beeld-Adjust-drempel".
      NB: Er zijn verschillende drempelwaarden algoritmen om uit te kiezen. In gepresenteerde resultaten, werd de "Yen" algoritme gekozen (Figuur 4C).
   3. Bereid je voor om de tijd (y) te meten -as lengte van de blob met het menu "Analyseren-Set Metingen". Controleer de "begrenzende rechthoek" in het venster "Set Metingen". Uitstek het gebied set moet zo klein mogelijk zijn, om ruis uit te sluiten. Hier werd de minimale oppervlakte vastgesteld op 50 pixels. Meet de tijd (y) -as lengte van de blob met het menu "Analyze-Analyseer Deeltjes". Om het resultaat te verkrijgen waarden en bewijzen dat de geloofwaardigheid van de meting regio's, controleer de "Toon resultaten" en "toevoegen aan Manager </ em> "dozen.
   4. Waarden in de "hoogte" kolom zijn de tijd (y) -as lengtes voor de gemeten blob (Figuur 4D). Sla de waarden met behulp van het menu Results tafel "Bestand-opslaan als" en bereken en verwerken van de dataset van het beeld blob duur met behulp van een statistisch pakket en / of spreadsheet-software (Figuur 4E).

Results

In deze video artikel, de protocollen voor VAEM observatie van GFP-PATROL1 in A. thaliana zaadlob stomatale complex cellen zijn aanwezig. Hemel druppel montage is een eenvoudige bereidingswijze die kunnen helpen bij het ​​verminderen van het optreden van luchtbellen in VAEM voorbereidingen van A. thaliana zaadlobben (figuur 1). Overtilting van de invoer laser en / of z-positionering specimens VAEM zal een onduidelijk beeld te krijgen. Als dat gebeurt, is het raadzaam om opnieuw te star...

Discussion

In deze video artikel, zijn protocollen gegeven voor het bewaken en meten van het dynamische gedrag van GFP-PATROL1 stippen op de stomatale complex van Arabidopsis thaliana. Zoals hier getoond, VAEM observatie is een krachtig hulpmiddel voor live-beeldvorming van plantencel oppervlakken. Onder dezelfde omstandigheden hier voor GFP-PATROL1 controle, was er zeer weinig fluorescentie fotobleken in de voor 1 min video capture monster, omdat de zeer gevoelige EM-CCD maakt het gebruik van een relatief zwakke laser VA...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted microscope	Olympus	IX-73
TIRF unit	Olympus	IX3-RFAEVAW
TIRF objectieflens	Olympus	UAPON 100 × OTIRF	NA = 1.49
Laser hoekbesturingsbox	Chuo Seiki	QT-AK
Optisch gepompte halfgeleiderlaser	Coherent	SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser
510–550 nm bandpassfilter	Olympus	U-FBNA
EM CCD-camera	Hamamatsu Photonics	ImagEM C9100-13
C-mount cameravergrotingswisselingseenheid	Olympus	U-TVCAC
MetaMorph-software	Molecular Devices	MetaMorph versie 7.7.11.0
TIRF-microscopiehandleiding	Olympus	AX7385	Instructies: Total Internal Reflection Illumination System (Gedrukt in Japan op 24 augustus 2012)
Dompelolie	Olympus	Immersion Oil Typr-F	ne = 1.518 (23 graden)