Een eenvoudige methode voor Automated Solid Phase Extraction van watermonsters voor immunologische Analyse van Kleine verontreinigende stoffen

Samenvatting

Een protocol voor de extractie en pre-concentratie van oestradiol uit watermonsters door gebruik te maken van een geautomatiseerd en geminiaturiseerd systeem wordt gepresenteerd.

Samenvatting

Een nieuwe methode voor vastefase-extractie (SPE) milieu watermonsters voorgesteld. De ontwikkelde prototype is kostenefficiënt en gebruiksvriendelijk, en maakt het mogelijk om een ​​snelle, geautomatiseerde en eenvoudige SPE voeren. De pre-geconcentreerde oplossing is geschikt voor analyse door immunoassay, met een laag gehalte organisch oplosmiddel. Een werkwijze wordt beschreven voor de extractie en pre-percentage natuurlijke hormoon 17β-oestradiol in 100 ml watermonsters. Omgekeerde fase SPE wordt uitgevoerd met octadecyl-silicagel sorptiemiddel en elutie uitgevoerd met 200 pl methanol 50% v / v. Eluent wordt verdund door toevoeging van di-water om de hoeveelheid methanol te verlagen. Na bereiding handmatig SPE kolom, wordt de totale procedure automatisch uitgevoerd binnen 1 uur. Aan het eind van het proces wordt oestradiol concentratie gemeten met behulp van een commercieel enzym-gekoppelde immuun-sorbent assay (ELISA). 100-voudig pre-concentratie wordt bereikt en het gehalte aan methanol in slechts 10% v / v. Vol terugvorderingen van het molecuulworden bereikt met 1 ng / l spiked gedeïoniseerd en synthetische zeewater monsters.

Inleiding

Monstervoorbereiding is een belangrijke stap in een analytisch proces. Vooral het verwijderen van matrixeffecten, vermindering van storingen en de verrijking van het analyt nodig om nauwkeurige resultaten te bereiken en lage detectiegrenzen. Hormoonverstorende stoffen (EDC's) zijn van bijzonder belang vanwege hun actie op de levende organismen, zelfs wanneer aanwezig op zeer lage niveaus in het milieu. Het natuurlijke hormoon 17β-estradiol is aanwezig op de EU watervervuiling watch list en gevoelig te worden toegevoegd aan de lijst van prioritaire stoffen die vallen onder de Europese Kaderrichtlijn Water. Vaste fase-extractie (SPE) is gewoonlijk voor de analyse van kleine verontreinigingen in het water, zowel chemisch ^1-5 (chromatografie, massaspectrometrie) en immunologische ^6-9 detectiemethoden. De laatste kreeg belang op het gebied van toezicht op het milieu, zoals immunoassays zijn verkrijgbaar in grote verscheidenheid van formaten, zijn specifiek voor de tarGebruik analyt, en bereiken lage aantoonbaarheidsgrenzen. ^{6, 7, 10, 11} Diverse enzymgekoppelde immunosorbent assays (ELISA) zijn commercieel verkrijgbaar en in staat om meerdere monsters tegelijkertijd te analyseren op een multi-well plaat. De procedure bestaat uit achtereenvolgende reactiestappen die enkele uren kan duren. Het uiteindelijke reactieproduct kan optisch worden gedetecteerd om de concentratie van het doelwitmolecuul op basis van een ijkcurve te bepalen.

Klassieke SPE procedures omvatten sorbens pre-conditioning, monstername, wassen, elutie en indampen van het eluens. Het oplosmiddel gebruikt voor het verdunnen van het extract wordt gekozen afhankelijk van de detectiemethode. Voor immunologische werkwijzen, de hoeveelheid organisch oplosmiddel beïnvloedt sterk de gevoeligheid van de werkwijze. ¹²

Naast het herstel en de pre-concentratie uitvoeringen, de werkwijze moet ook eenvoudig en kostenefficiënt. Automatisering van de procedure helpt tot-mens-gerelateerde fouten te verminderen. In onze vorige werk ¹³ we ons prototype voor geautomatiseerde SPE geïntroduceerd, en onze methode werd toegepast op de analyse van het natuurlijke hormoon 17β-estradiol in zee watermonsters. Met de huidige video willen we de technische voordelen van onze methode vergeleken met de traditionele off-line en on-line SPE, en de bijzondere compatibiliteit met detectie door immuno-reacties te markeren. We beschrijven het protocol toegepast watermonsters voor de detectie van 17β-oestradiol. SPE wordt uitgevoerd met octadecyl-silicagel (C18) sorbent fase en elutie wordt uitgevoerd met verdunde methanol.

Protocol

Opmerking: Het volgende protocol beschrijft de SPE uitgevoerd op 100 ml water monster met C18 sorptiemiddel en elutie met 50% v / v methanol. De verrijkte monster wordt verdund tot 10% v / v methanol bereiken voordat de analyse van een enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) kit.

1. Voorbereiding van de reagentia

1. Bereid de watermonsters
   1. Voorafgaand aan een andere stap, filteren elke 100 ml water monster met 0,2 um poriegrootte filters.
   2. Spike het monster met gewenste concentratie door verdunning geschikt volume referentieoplossing in een volume water. Zo bereiden 100 ml water monster met 100 ng / l E2 door het verdunnen van 3,3 pl E2 referentieoplossing in een concentratie van 300 ug / L. Verdun deze oplossing tien keer om een ​​monster verrijkt met 10 ng / L E2. Verdun deze laatste nog tien keer een monster van 100 ml met 1 ng / L E2 verkrijgen.
   3. Plaats het gefiltreerde monster (ongemodificeerde of spiked) in een glazen fles met GL45 draad. Gebruik het monster op dezelfde dag. Neem een ​​kleine fractie wordt geanalyseerd met ELISA beginconcentratie schatten.
2. Bereid 300 ul eluens door verdunning methanol in gedeïoniseerd (di-) water tot 50% v / v in een strakke buis.

2. Voorbereiding van de SPE Column

1. Bereid een 20 mg / ml suspensie van octadecyl-silicagel sorbensdeeltjes door toevoeging eerst 1600 pl methanol en vervolgens 400 gl di-water om 40 mg van omgekeerde fase sorbens. Goed sluit het deksel en schud met een vortex.
2. Het installeren van de onderste membraan in kolom
   1. Selecteer een Nylon membraan met poriegrootte 11 micrometer en plaats het op een dubbele laag van anti-stof weefsel. Met een 3 mm diameter pons gesneden twee houtbewerking van het membraan.
   2. Pak een van de kleine membranen met een flatscreen-end filter pincet en plaats het op de ene kant van de kolom.
   3. Schroef de vlakke bodem connector met de buis en draai. Het membraan is now op zijn plaats en het sorbens kan veilig worden toegevoegd. Teken een pijl op het lichaam van de kolom wijst naar het einde, waar het membraan geplaatst.
3. De voorbereiding van de gepakte sorptiemiddel kolom
   1. Bevestig de kolom aan de houder met de pijl naar beneden. De kolom moet zo verticaal mogelijk worden ingesteld.
   2. Bevestig een lege 10 ml wegwerpspuit aan het einde van de buis van de kolom via de Luer-Lock aansluitingen.
   3. Bereid een micro-pipet met een 20-200 ul tip, zet het volume tot 100 ul. Deze pipetpunt formaat wordt aangepast aan de grootte van de kolom sorbens te bereiden. De procedure zou moeilijker met grotere pipettips zoals die gebruikt bij 1 ml pipetten zijn.
   4. Schud het sorberende suspensie met een vortex en snel pipet 100 ul in het midden van de kolom. Tijdens het injecteren, aspireren voorzichtig alle gepipetteerde oplossing doorheen het membraan met behulp van de injectiespuit met de andere hand. Op dit stleeftijd, moet de oplossing vullen van de spuit vrij van deeltjes en een deeltjesgrootte bed kan eventueel worden waargenomen in de kolom.
   5. Herhaal dit proces 2 keer door roeren van de voorraadsuspensie tussen alle pipetteerstappen homogene suspensie van de deeltjes in de oplossing te waarborgen. De verkregen kolom bevat 6 mg sorptiemiddel.
   6. Wanneer de 300 ul suspensie zijn geladen en gedroogd door opzuigen met de injectiespuit, houdt de spuit in positie en plaats het tweede Nylon membraan aan de bovenzijde met behulp van de tang met de andere hand.
   7. Schroef de tweede aansluiting met buis en gooi de spuit. De kolom SPE is klaar voor gebruik.

3. Voorbereiding van het systeem

1. Draai de kolom SPE op het apparaat met behulp van de Luer-Lock-aansluitingen. De pijl moet wijzen in dezelfde richting als die op de inrichting.
2. Sluit de fles met het monster op de inrichting van de schroevenmits GL45 veiligheid cap op.
3. Laad 200 gl eluent in de 'Eluent' reservoir.
4. Belasting 800 pi van di-water in het 'verwateren' reservoir.
5. Plaats een fles op de afvoer naar het verwerkte water op te vangen tijdens de extractie stap. Het formaat is niet belangrijk, maar de hoeveelheid dient voldoende groot met betrekking tot het monstervolume zijn.
6. Plaats een klein flesje op de sensor uitgang met het minimale volume van 1,5 ml. Een maximaal volume van 1 ml zal te klein zijn als belletjes zal vormen in deze outlet bij het verzamelen van verrijkt eluent en verdunning buffer.
7. Controleer de drukregelaar in gesloten stand handmatig draaien, reverse-rechts tot verdere verplaatsing niet mogelijk.

4. SPE met de Prototype

1. Schakel de prototype door op de knop op de achterkant.
2. De voorbereiding van de user interface en het selecteren van het programma
   1. Open de gebruikersinterface. Selectde communicatie-poort van de computer waarop het apparaat is aangesloten uit de lijst, en klik op de knop 'Volgende'.
   2. Voer de waarden 580 voor PSET en 30 voor dpset. De pomp wordt aangepast om de druk in het druksysteem en reservoirs te handhaven op 580 ± 30 mbar uitgevoerd.
   3. Selecteer de automatische modus.
   4. In de automatische modus hoek, laadt het programma bestand in het vak 'configuratiebestand pad'.
3. Het aanpassen van de drukregelaar
   1. Start de pomp.
   2. Draai handmatig de drukregelaar totdat de waarde lezen preg inferieur is, maar dicht bij 320 mbar.
   3. Stop de pomp.
4. Starten van de SPE procedure
   1. Druk op 'start' in de automatische modus hoek. De pomp zal inschakelen en de winning, elutie en verdunning stappen zullen automatisch volgen elkaar. De gehele procedure een 100 ml monster wordt uitgevoerd in 50 minuten.
   2. Controleer de waarde van preg. Het moet in de range 320 zijn - 350 mbar bij de winning stap om een ​​optimale debiet te garanderen.
   3. Sluit het kleine flesje en bewaar bij 4-5 ° C in het donker tot analyse. Voer analyse in de volgende 30 uur tot degradatie te voorkomen.
   4. Ontdoen van het verwerkte water.
5. Het reinigen van het systeem
   Let op: Na elke extractieprocedure het systeem moet worden gereinigd om kruisbesmetting te voorkomen.
   1. Bereid een 10 ml oplossing van methanol 70% v / v in een glazen fles GL 45.
   2. Stekker uit de kolom SPE en steek de buis met connectoren.
   3. In de automatische modus selecteert u de 'schoonmaak' bestand en start het met dezelfde druk instellingen.

5. Detectie van estradiol Concentratie met ELISA

1. Bereid de kalibratie monsters bij concentraties zoals aangegeven in het protocol die bij de ELISA kit die wordt gebruikt. Bereid een calibratie set met dezelfde matrix als het monster, en een calibratie set met methanol 10% v / v.
2. Doseer de benodigde hoeveelheid monster in de putjes op de plaat, volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik ijkmonsters, ongewijzigde en spiked watermonsters die werden gefilterd, maar niet in methanol 10% v verwerkt met SPE, en verrijkt samples / v. Gebruik 3 putjes per monster aan de foutenbronnen bij de assay te verminderen.
3. Volg de aanwijzingen van het protocol dat wordt geleverd bij de kit voor de toevoeging van reagentia, incubatietijd, wassen en verdere reactie met het enzym.
4. Lees het optische signaal in elke put volgens instructies van de fabrikant kit met een plaatlezer instrument en het verzamelen van de gegevens.
5. Met de software van de plaatlezer instrument om de kalibratiekromme te passen en bepaal de E2 concentratie in het oorspronkelijke monster met dezelfde matrix, en in het verrijkte monsters met methanol 10% v / v.

Resultaten

Reproduceerbaarheid sorptiemiddel verpakking werd geëvalueerd door het drogen en het wegen van de gepipetteerde sorbens in glazen flesjes en het resultaat wordt getoond in figuur 1. Reproduceerbaarheid van het tijdstip van de injectie werd getest 100 ml monsters, zie figuur 2. Concentratie initiële en pre- spiked geconcentreerde monsters werden bepaald met een commerciële ELISA kit voor 17β-oestradiol en worden getoond in figuur ...

Discussie

Een nieuwe werkwijze voor de bereiding van watermonsters gevolgd door analyse met behulp immunoassay voorgesteld. Het instrument maakt het mogelijk om de vaste fase extractie uit te voeren op een geautomatiseerde en gebruiksvriendelijke manier.

De filtratie van het watermonster vóór de injectie in het systeem kritisch. Eventuele deeltjes nog in de oplossing mogelijk verstopping van de vloeibare netwerk veroorzaken en belemmeren de kolom SPE. Een andere belangrijke stap is de bereiding van de...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Filter membrane 0.2 μm pore size	Merck Millipore	GNWP04700	Voor monsterfiltratie
Nylon membrane 11 μm pore size	Merck Millipore	NY1104700	Voor SPE-kolom
Disposable biopsy punch 5 mm	Medical Budget	39302439
Nucleodur C18 ec	Macherey Nagel	713550.01	50 μm deeltjesdiameter
Synthetic sea water	Sigma Aldrich	SSWS500-500ML
Methanol	VWR
17beta-estradiol standard	Enzo Life Science		300 ng/ml
17beta-estradiol ELISA kit	Enzo Life Science	ADI-900-008	96 wells, bereik 30 - 3.000 ng/L