Methodenartikel

-Air bemonsterd Filter Analyse voor endotoxinen en DNA Content

9.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53444

⸱

7 maart 2016

 ,  ,  , 
1Department of Earth and Planetary Sciences, Weizmann Institute of Science, 2Multiphase Chemistry Department, Max Planck Institute

In dit artikel

Samenvatting

Twee complementaire analyses van biologische atmosferische deeltjes uit bemonsterde luchtfilters worden hier beschreven: de extractie en detectie van endotoxine en van DNA.

Samenvatting

Outdoor aerosol onderzoek maakt gebruik van algemeen fijn stof bemonsterd filters. Deze procedure kan verschillende karakteristieken van de verzamelde deeltjes wordt parallel uitgevoerd. Het doel van de hier gepresenteerde methode is een zeer nauwkeurige en betrouwbare analyse van de endotoxine en DNA- gehalte van bio-aerosolen onttrokken filters te verkrijgen. De winning van hoogmoleculaire organische moleculen, zoals lipopolysacchariden, van bemonsterde filters omvat het schudden van het monster in een pyrogeen-vrij water gebaseerde medium. De volgende analyse is gebaseerd op een enzymatische reactie die kan worden gedetecteerd met een turbidimetrische meting. Door het hoge gehalte aan organische het bemonsterde filters, wordt de extractie van DNA uit de monsters uitgevoerd met een commerciële DNA extractie kit die oorspronkelijk is ontworpen voor bodems en aangepast aan de DNA opbrengst te verbeteren. De detectie en kwantificering van specifieke microbiële soort, volgens een kwantitatieve polymerasekettingreactie Reactibij analyse (Q-PCR) worden beschreven en vergeleken met andere beschikbare werkwijzen.

Inleiding

Air bemonstering van filters is een fundamenteel instrument in atmosferische aërosolen onderzoek. 1 in de steekproef opgenomen filters zijn het uitgangspunt voor diverse chemische, fysische en biologische karakteriseringen van de verzamelde ambient deeltjes. 2-11 Het voordeel van deze aanpak is dat verschillende analyses kunnen worden uitgevoerd off-line op hetzelfde monster. Samenstellen van de gegevens uit de verschillende analyses maakt de onderzoeker een goed begrip van de kenmerken van de verzamelde deeltjes en hulpmiddelen te verkrijgen bij het ​​oplossen van complexe vraagstukken in de atmosferische wetenschappen. 12,13 Bijvoorbeeld, zee- en binnenvaart air-monsters genomen tijdens dezelfde termijn kan worden vergeleken met betrekking tot de bemonsterde deeltjes toxiciteit en biologische samenstelling. 14 voor deze studie, lipopolysacchariden (LPS), onderdelen van gram-negatieve bacteriële celwanden, ook bekend als endotoxinen werden uit filters bemonsterd wal en een binnenzee site, en werden geëvalueerd met behulp van delimulus amoebocyt lysaat (LAL) -test. Daarnaast werd een genomische evaluatie van de bacteriële inhoud (totaal bacteriën, gramnegatieve en cyanobacteriën) werd uitgevoerd op hetzelfde monster met de kwantitatieve polymerasekettingreactie (Q-PCR). De LAL-test is gebaseerd op metingen van troebelheid gevormd na de toevoeging van een waterig extract van amebocytes van de degenkrab, Limulus polyphemus, aan een waterige oplossing die de endotoxinen. Hoe hoger de endotoxine concentratie in het monster, des te sneller vertroebeling ontwikkelt. 15 de Q-PCR-analyse is gebaseerd op een fluorescentiesignaal uitgezonden als een specifiek DNA-fragment wordt geamplificeerd. 16 Bij real time monitoring van het signaal gedurende de exponentiële fase van de PCR reactie en kalibreren met een standaard curve, kan de eerste DNA bedrag worden gekwantificeerd. De combinatie van deze twee analyses samen met anderen, zoals elders beschreven, kan 14 een goede schatting van de niveaus van endotoxine en het verschaffenhoeveelheid van de bron bacteriën in de monsters.

Het doel van de hier gepresenteerde methode is een zeer nauwkeurige en betrouwbare analyse van de endotoxine en DNA- gehalte van bio-aerosolen onttrokken filters te verkrijgen. Terwijl werkwijzen voor bemonstering van de fysische en anorganische chemische eigenschappen van aërosolen zijn welbekend en, meer recentelijk, werkwijzen ontwikkeld om de organische stof component onderzoeken, 17 er weinig onderzoek gedaan naar de biologische component van aërosolen. 18 De reden voor de huidige methode is om deze kloof te pakken door die een gedetailleerd overzicht van een robuuste methode voor het extraheren, analyseren, en het identificeren van de biologische fractie van de lucht aerosolen. 14

De methode die hier beschreven wordt verwacht dat wijdverspreide gebruik vinden in biologische indoor en outdoor aerosol onderzoeksprojecten waarbij filter analyse. 20-24

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerking: Een gedetailleerde lijst van alle gebruikte materialen en instrumenten die worden gebruikt in dit protocol wordt getoond in de sectie Materials.

1. Air Sampling op Filters

  1. Bereiding van filters
    1. Voor hoge volume sampling, gebruik maken van 20,3 x 25,4 cm 2 filters. Kies het specifieke type filter die aansluit bij onderzoeksbehoeften, en de afsnij- size, indien van toepassing. 1 hier gebruik kwarts microfiber filters.
    2. Pre-bak filters die bestemd zijn voor organische en biologische verbinding bemonstering organische resten te vernietigen. Pre-bake de filters, wikkel ze afzonderlijk in aluminiumfolie en bak ze in een laboratorium-oven bij 450 ° C gedurende ten minste 5 uur.
    3. Bewaar de gebakken filters bij -20 ° C tot bemonstering.
  2. Instrument Handling en Air Sampling
    1. Clean resterende stof van het hoofd van het hoge volume sampler. Veeg de onderdelen met een schone papieren doekjes en laat ze aan de lucht drogen before ze dan weer aan de sampler.
    2. Ontsmet de filter cassette met ethanol, en werken met handschoenen en een laboratoriumjas te allen tijde.
    3. Plaats een pre-gebakken filter in het schone filter cassette, en ga verder volgens de hoge volume sampler handleiding.
    4. Markeer de datum en alle ongewone weersomstandigheden, indien van toepassing (bv regen, stof storm) op de aluminium wrap, en opslaan in een schone plek tot aan de voltooiing van de bemonstering.
    5. Verzamel de bemonsterde filter en vouw het in de helft, met de bemonsterde kant naar binnen.
    6. Wikkel het filter in de originele aluminiumfolie en bewaar bij -20 ° C tot analyse.
      Let op: Als het tijdsverloop tussen bemonstering en analyse is langer dan 2 maanden, bewaar het monster bij -80 ° C om afbraak van de organische en biologische materiaal te voorkomen.

2. endotoxine Analyse

Let op: Ontsmet het werkoppervlak met 70% ethanol eend werken met pyrogeenvrij buizen, tips en reagentia alleen. Als glaswerk worden gebruikt, is voorverwarmen bij 250 ° C gedurende 30 minuten of 200 ° C gedurende 60 minuten noodzakelijk. 25 Prepare alle reagentia in een klasse II bioveiligheid kast en met handschoenen en een laboratoriumjas allen tijde.

  1. reagens Voorbereiding
    1. Volg het protocol van de LAL kit fabrikant om het lysaat kort hydrateren voor gebruik. 26 Tik zachtjes op het flesje te verjagen LAL nog op de fles muren. Til de stopper voorzichtig om het vacuüm te breken. Met behulp van een injectiespuit genaaid, voeg 5 ml pyrogeenvrij water (PFW) aan het flesje alle lysaat inhoud hydrateren en meng zachtjes om schuimvorming te voorkomen.
    2. Sluit de flacon met plastic paraffine film wanneer niet in gebruik en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal twee dagen. Bewaar overblijvende lysaat bij -20 ° C gedurende maximaal drie maanden.
      Opmerking: Dit reagens kan slechts eenmaal worden bevroren.
    3. Hydrateren de controle standaard endotoxine (CSE), waarvan 0,5 μ bevat; g E. coli, in overeenstemming met het protocol van de fabrikant. 27 Bepaal de specifieke hoeveelheid water aan de CSE flacon moet worden toegevoegd op de website van de fabrikant van de 28 door het invoeren van het lotnummer voor de set, waar vermeld op de website. De eindconcentratie van E. coli in de flacon, wordt gemeten in endotoxine-eenheden (EU, waarbij 10 EU = 1 ng). Label dit flesje ed0.
    4. Sluit de CSE flacon met plastic paraffine film wanneer niet in gebruik en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 4 weken.
  2. Standard Curve en Spiked-filter Voorbereiding
    1. In een klasse II bioveiligheid kast bereiden 22 pyrogeenvrij 2 ml centrifugebuizen met afnemende hoeveelheden CSE (buizen Ed1-Ed11) of geen CSE (de lege buis met alleen PFW) een gedupliceerde endotoxine verdunningsreeks produceren, zoals getoond in Tabel 1.
    2. In een biologisch kast met kringloop, gesneden 22 cirkelstukken van schone, voorgebakken filter met een gedesinfecteerd 1,1 2 cm diameter kurkboor.
    3. Plaats het filter paren in steriele petrischaaltjes.
    4. Spike 50 ul van elk lid van endotoxine verdunningsreeks Ed2-Ed11 en naar de lege buis op een overeenkomstige paar filters.
    5. Laat de platen met het verrijkte filters geopend onder de motorkap om te drogen gedurende 30 min.
    6. Plaats elk filter stuk in een pyrogeenvrij 2 ml buis.
Buis Final endotoxine concentratie (EU ml -1) Standard volume endotoxine (ml) Pyrogeenvrij water volume (ml) totale volume (ml)
ed0 2500 stock oplossing * 5
ED1 1000 80 (van ed0) 120 200
Ed2 100 20 (van Ed1) 180 200
ED3 50 10 (van Ed1) 190 200
eD4 25 5 (van Ed1) 195 200
ED5 12.5 2.5 (van Ed1) 197.5 200
ED6 6.25 1.25 (uit Ed1) 198,75 200
ED7 3.125 6.25 (uit Ed2) 193,75 200
ED8 1,563 6,25 (van ED3) 193,75 200
ED9 0,781 6.25 (uit eD4) 193,75 200
ED10 0,391 6,25 (van ED5) 193,75 200
Ed11 0,195 6,25 (van ED6) 193,75 200
Blanco 0 0 200 200
* Bereid de voorraad oplossing volgens de instructies van de fabrikant.
">

Tabel 1:. Endotoxine standaardcurve endotoxineconcentratie, hoeveelheid gesteld endotoxine en pyrogeenvrij water toegevoegd, en het totale volume verkregen worden voor elke verdunning buis in de ijkcurve.

  1. Endotoxine Extraction van de Experimentele en Spiked Filters
    1. In een biologisch kast met kringloop, stuurde de bemonsteringsfilters (uit stap 1.2) in ronde stukken met een gedesinfecteerd 1,12 cm diameter kurkboor en plaats ze samen met de puntige standaard filters (van stap 2,2), in pyrogeenvrij 2 ml buizen (dat wil zeggen, het monster tubes).
    2. Voeg 1 ml PFW aan de buizen en schud ze gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur met een klinisch shaker.
    3. Centrifugeer de monsterbuizen in een microcentrifuge bij 375 xg gedurende 10 min. 29
    4. Transfer the supernatant, die de endotoxinen bevat, in een nieuwe pyrogeenvrije 2 ml buis.
  2. Limulus Amebocyte Lysaat (LAL) test
    1. Bepaal de concentratie endotoxine in de monsters door het uitvoeren van de LAL-test in een pyrogeen-vrij 96-well microplaat met een vlakke bodem en een deksel.
    2. Plan de plaat matrix vooraf, zoals getoond in figuur 1. Voeg een standaardcurve direct bereid uit endotoxine standaardoplossingen Ed2-Ed11 (en immers het concentratiebereik van 100-0,195 EU / ml (zie paragraaf 2.2)) zich in hardloopplaat . De standaard curve moet putten 1-10 rijen A en B van de plaat te bezetten. Zet opzij putten 11-12 in deze rijen voor de blanco monsters (het maken van een totaal van vier blanks).
    3. Schakel microplate lezer en programmeren van een kinetische reactie waarbij incubatie van de microplaat bij 37 ° C en schudden elke 5 min, gevolgd door absorptiemetingen bij 405 nm. Herhaal 18 keer gedurende 1,5 uur.
    4. Bepaal de efficiency waarmee de endotoxinen worden uit de bemonsteringsfilters (bijv., verkregen uit het verrijkte standaard filters monsters) via splitsing van de berekende endotoxine bedrag door de oorspronkelijke hoeveelheid ingespoten.
    5. Start de test door het plaatsen van 50 ui van de standaard endotoxine-oplossingen (uit stap 2.4.2), of van de spiked filter extract en zijn blanks (van paragraaf 2.3), of van de experimentele monsters en blanco's (ook uit paragraaf 2.3), volgens de geplande plaat-array (figuur 1) en sluit het deksel.
    6. Aan elk putje, snel toe te voegen 50 pl LAL-oplossing, en schud de plaat horizontaal, terwijl het wordt geplaatst op de tafel voor het opheffen van hem in de lezer.
    7. Plaats de plaat in de plaat lezer en start de experimentele run.

figure-protocol-1
Figuur 1:. Endotoxine-array plaat Een exruim van een endotoxine analyse array in een 96-well microplaat.

3. Genomic Analysis

Opmerking: Voor DNA-extractie, ontsmet het werkblad met 70% ethanol en werken met steriele buizen, tips en reagentia alleen. Voor Q-PCR-analyse van DNA, ontsmet het werkblad met oppervlak DNA-ontsmettingsmiddel. Bereid alle reagentia in een klasse II bioveiligheid kast en werken met handschoenen en een laboratoriumjas te allen tijde.

  1. Bereiding van het DNA Primers en Probes
    1. Voorafgaand aan DNA extractie, hetzij teneinde een in de handel verkrijgbare set van primers en een probe (als de methode hydrolyse probe wordt toegepast), of het ontwerpen van een nieuwe set primers en een probe middels primer ontwerpen rekentechnieken. 30
    2. Hydrateren de primers volgens het protocol van de fabrikant met behulp van 10 mM Tris-0,1 mM Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) (TE-buffer) of PCR-grade water.
      Opmerking: Het wordt aanbevolen om de eerste PCR-primer st ontbindenock in TE-buffer met lage EDTA (0,1%) als het voorkomt primer afbraak bij bewaring gedurende een langere tijdsduur. Gebruik PCR-grade water voor daaropvolgende verdunningen te EDTA bedragen die PCR-reacties kunnen remmen te verminderen.
    3. Aliquots van 50 pl en 100 pl van de primer en probe in steriele 0,5 ml buizen en bewaar bij -20 ° C tot analyse.
  2. Standard Cell Concentratie Evaluation Voorafgaand aan DNA Extraction
    1. In een geschikte grootte centrifugebuis, bereiden een standaard mobiele oplossing van de microbiële species van belang (buis Od0, tabel 2A). Meng de celsuspensie door pipetteren op en neer in de buis 7-10 keer met behulp van een pipet met een kleine boring.
    2. Als de cellen worden gekleurd (bijvoorbeeld bepaalde schimmelsporen), hebben een kleuring procedure niet uit. Als cel kleuring vereist, verdunnen de celsuspensie in een geschikte kleurstof voor microscopische detectie van de cellen van belang. 31
    3. Reinig het deksel slip en hemocytometer met ethanol. Bevochtig en bevestig het deksel slip op de hemocytometer.
    4. Laad ongeveer 8 ul van de celsuspensie in zowel hemocytometer compartimenten door voorzichtig aanraken van de rand van het dekglas met de punt van de pipet en het vullen van de kamer door capillaire werking. Niet over / onder de kamer te vullen.
    5. Bepaal het aantal cellen door ze te bekijken onder een microscoop bij 400x vergroting (40X objectief en 10x bij oculaire). Negen vierkanten van 1 x 1 mm en 2 aangebracht in een 3 x 3 raster moet worden gezien. Focus de microscoop op een van de vier hoeken vierkanten van het rooster (een hogere vergroting kan worden gebruikt). De 1 x 1 mm 2 vierkante moeten 16 kleinere vierkanten bevatten.
    6. Tel alle cellen in de vier 1 x 1 mm 2 hoekvelden, en in het middelste vierkant van 3 x 3 raster. Als er te veel of te weinig cellen te tellen, herhaalt u de procedure, hetzij concentreren of verdunnen van de oorspronkelijke celsuspensie zo nodig (15-50 cellen moeten bedekken een uitkiezen 1 mm 2-gebied).
    7. Bereken de concentratie van de cellen (cellen ml-1) in de standaard celsuspensie Od0 het aantal cellen gemiddeld over de vijf velden geteld als volgt: Celgetal ml -1 = Gemiddelde cellen vierkante -1 Verdunningsfactor 10 4.
  3. Evaluatie van DNA Extraction Efficiency
    1. Bereid negen steriele 0,5 ml buizen volgens tabel 2A.
    2. Verdun de standaard celoplossing (Od0) tot ongeveer 10 7 cellen ml-1 in een totaal volume van 20 pl (OD1) bevatten.
    3. Voeg 18 ul van steriele nuclease-vrij PCR-grade water (NFW) naar buizen Od2-Od8 en 20 ul naar de lege buis, Od9.
    4. Overdracht 2 pi van de celoplossing van OD1 in Od2. Pipet voorzichtig te mengen en de overdracht 2 pl van tube Od2 naar OD3. Verder verdunnen van de cellen op dezelfde wijze langs de buizen tot en met koker Od8 te obtain een seriële verdunning van 10 -10 0 7 cellen ml-1.
    5. In een biologisch kast met kringloop, gesneden 18 cirkelstukken van schone, voorgebakken filter met een gedesinfecteerde 1,12 cm diameter kurkboor. Plaats de filters paarsgewijs in steriele petrischalen.
    6. Spike 10 gl van verdunningen OD1 tot Od8 en de lege buis Od9 op elk van de gepaarde filters, zodat er een filterpaar overeenkomt met elke standaard celconcentratie.
    7. Laat de petrischaaltjes geopend onder de motorkap en laat ze drogen gedurende 30 min.
    8. Plaats elk filter stuk in een steriele schroef-top 2 ml buis en pak het DNA volgens de procedure van punt 3.4.
  4. DNA-extractie van de Experimentele en Spiked Filters
    Opmerking: Voor DNA-extractie van filters, gebruiken commerciële kits zijn ontworpen voor DNA extractie van grond volgens het protocol van de fabrikant met de volgende modificaties.
    1. Voor elke filter monster (OD1-Od8), voor te bereiden een mengsel van zuur gewassen glasparels in een 0,5 ml steriele buis. Gebruik 0,1 g korrels met een diameter van 425-600 urn en 0,3 g korrels met een diameter van ≤106 um.
    2. In een kast met biologische kringloop, snijd drie ronde stukken uit willekeurig geselecteerde locaties op elk filter monster met behulp van een gedesinfecteerde 1,12 cm diameter kurkboor, en plaats ze in schroef-top 2 ml buizen.
    3. Voeg de glaskraal mengsel aan de buizen.
    4. Voeg de cel-lysis buffer met de extractie kit aan elke buis in de biologische kast met de in protocol van de fabrikant bedrag.
    5. Bereid een emmer ijs en verstoren de cellen mechanisch met behulp van een kraal beater.
    6. Klop de kralen voor 1 min en vervolgens leg ze op ijs gedurende 1 minuut. Herhaal vijf keer.
    7. Ga verder met het protocol van de kit leverancier uit de post-lysis stap.
    8. Na elutie met bijgeleverde elutiebuffer (10 mM Tris bevat bUffer) of NFW, herlaad het geëlueerde monster door de kolom opnieuw om DNA opbrengst te verbeteren.
      Opmerking: Als niet geanalyseerd op dezelfde dag als de DNA-extractie, kunnen monsters worden bewaard bij -20 ° C tot analyse.
A- Bereiding van Standard Cell Verwatering Series
Buis Uiteindelijke celconcentratie (cel -1 ml) standaardcel volume (ml) Nuclease gratis water volume (ml) Totaal volume (ml)
Od0 bepalen met Hemocytometer telkamer
OD1 worden geëlueerd om het bereik van 10 7 cellen ml -1 20
OD2 10 -1 OD1 2 van OD1 18 20
OD3 10 -2 OD1 2 van Od2 18 20
Od4 10 -3 OD1 2 van OD3 18 20
Od5 10 -4 OD1 2 van Od4 18 20
Od6 10 -5 OD1 2 van Od5 18 20
Od7 10 -6 OD1 2 van Od6 18 20
Od8 10 -7 OD1 2 van Od7 18 20
Blanco 0 0 20 20
B- Bereiding van DNA standaardcurve
Buis Uiteindelijke DNA-concentratie (mg ml -1) Standaard DNA volume (ml) Nuclease gratis water volume (ml) Totaal volume (ml)
bepalen met NanoDrop
DD1 worden geëlueerd om het bereik van 10 1 mg ml -1 20
DD2 10 -1 DD1 2 van DD1 18 20
DD3 10 -2 DD1 2 van DD2 18 20
DD4 10 -3 DD1 2 van DD3 18 20
DD5 10 -4 DD1 2 van DD4 18 20
DD6 10 -5 DD1 2 van DD5 18 20
DD7 10 -6 DD1 2 van DD6 18 20
DD8 10 -7 DD1 2 van DD7 18 20
Blanco 0 0 20 20
1 "style =" height: 21px; "> Dd0

Tabel 2:. DNA Standaard Curve Standaard microorganisme cellen verdunningsreeks (A) gedetailleerd voor de standaard cel volume, NFW volume en het totale volume in elke verdunning buis. DNA standaard curve preparaat (B), gedetailleerd voor de standaard DNA volume, NFW volume, en het totale volume in elke verdunning buis.

  1. DNA Standard Curve Voorbereiding
    1. Uittreksel DNA direct vanaf een standaardmonster van het micro-organisme van belang (Dd0) volgens dezelfde procedure als beschreven voor de experimentele filters in stap 3,4.
    2. Gebruik een spectrofotometer om de DNA-concentratie van de standaard DNA monster (Dd0) te bepalen bij 260 nm.
    3. Bereid negen steriele 0,5 ml buisjes om een DNA-standaardcurve bereid, zoals weergegeven in tabel 2B.
    4. Indien nodig verdunnen standaard DNA-oplossing Dd0 binnen een concentratiebereik van 1-10 ug ml-1 in de eerste buis (DD 1) in een totaal volume van 20 pl.
    5. Voeg 18 ul van NFW buizen DD2-DD8 en 20 ul naar de lege buis.
    6. Overdracht 2 pi van de standaard DNA-oplossing van DD1 in DD2. Pipet voorzichtig te mengen en vervolgens over 2 pl van DD2 naar DD3. Verder verdunnen van het DNA op dezelfde wijze langs de buizen een seriële verdunning van 10 0 -10 -7 in tubes DD2-DD8 samen met een lege buis containi bereikenng alleen NFW.
      Opmerking: Als niet geanalyseerd op dezelfde dag van extractie, monsters opslag bij -20 ° C tot analyse.
  2. Kwantitatieve PCR-analyse
    1. Schakel de Q-PCR-instrument van te voren op te warmen.
    2. In een nieuw programma-bestand, plaatst u de details voor de Q-PCR uitgevoerd in de-instrument besturingssoftware zoals beschreven in tabel 3.
      Opmerking: De verschillende instrumenten hebben verschillende optimale timing voor elke thermische cyclus stap. Deze ingang is beschreven in de handleiding van het instrument.
    3. Ontsmet het werkoppervlak met oppervlak DNA-ontsmettingsmiddel en werken alleen met steriele buizen, tips, en reagentia.
    4. Bereid een emmer ijs naast de werkbank. Store Taq-polymerase mix op ijs.
    5. Bereken het aantal reactieholten dat de plaat wordt ingenomen. Voeg theoretische rekening met extra reacties (5%) en vermenigvuldig het vergrote aantal reacties van het volume per reactie op het totale keuze reactietijd berekenenn volume.
    6. Bereid de reactie gemengd zwembad, vanaf NFW, primers, probe, en ten slotte het Taq-polymerase mix. Zie bijvoorbeeld het volume berekeningen voor de gemengde pool in Tabel 4.
    7. Bewaar het reactiemengsel in het donker op ijs tot gebruik.
    8. Plaats 1 pl standaard DNA, DNA monster of NF W (als negatieve controle) in de putten in de Q-PCR microtiterplaat in drievoud.
    9. Zorg ervoor dat de plaat is in een plaat houder om te voorkomen dat het aanraken van het werkoppervlak en het schoon te houden.
    10. Voeg 9 ul van de gemengde pool (tabel 4) in elke reactieholte.
    11. Bedek de plaat met optische zelfklevende folie en sluit deze goed van alle kanten.
    12. Spin down de plaat in een centrifuge met plaat bakken gedurende 1 minuut bij 1000 xg voordat u hem in de Q-PCR-apparaat.
    13. Plaats de plaat in het instrument en activeer het lopende programma.
Parameter Details Comments
detectiemethode Kwantitatieve hydrolyseprobe
Thermische fietsen voorwaarden
Initiële denaturatie en enzymactivering 95 ° C gedurende 10 min
Denaturation 95 ° C gedurende 15 sec herhaal 45 keer
Gloeien en extensie 60 ° C gedurende 60 sec
Plate-array
standaardkromme DD1 - DD8 3 herhalingen per verdunning in 1-8 putjes op de top 3 rijen
Non-template control (NTC) Nuclease gratis water (NFW) 3 herhalingen in de 9 e en aan de top3 rijen.
geanalyseerde monsters DNA geëxtraheerd uit filters 3 herhalingen per monster bij de overige wells.
primer set per elk putje
monstervolume 10 ml

Tabel 3:. Details voor Q-PCR besturingssoftware Details van de analyse parameters in het programma bestand Q-PCR worden ingevoerd.

Reagens Volume per reactie (ml) Aantal reacties Toelage voor fouten(5%) Het totale volume mix (ml)
Taq-polymerase mix 5 50 52.5 262.5
F primer (10 mm) 0.5 50 52.5 26.25
R primer (10 mM) 0.5 50 52.5 26.25
Nuclease gratis water 3 50 52.5 157.5
DNA - 1 ml zal rechtstreeks in het doel putten in de 96 plaat worden toegevoegd.

Tabel 4:. kwantitatieve PCR-Reaction Mix Berekening Volume per reactie, het aantal reacties, toelage voor fouten, en de berekende totale volume in het reactiemengsel per reagens toegevoegd worden gedetailleerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het is gebruikelijk om atmosferische aërosolen studie met "off-line" analyses van bemonsterde filters (zie figuur 2). 32 Chemische analyses van de bemonsterde stof omvatten organische (bijvoorbeeld eiwitten, koolwaterstofmoleculen, sacchariden) en anorganische (bijvoorbeeld metalen, zouten) -gehalte . Biologische analyses omvatten levensvatbare en niet-levensvatbare micro-organismen inhoud, soort-identificatie door een DNA aanpak of...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit werk beschrijft de extractie en detectiemethoden voor het kwantificeren van zowel endotoxinen en DNA aanwezig in spuitbussen monsters verzameld op filters. De methoden vereisen nauwkeurige routines en kan gemakkelijk worden uitgevoerd zolang de experimentator hecht aan een paar essentiële en belangrijke punten besproken.

Voor het endotoxine detectiestap op dat de lysaatoplossing vrij viskeus is en neigt om belletjes op pipetteren. Het is moeilijk te verwijderen u bellen, en ze een wijzig...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs danken Dr. Yoav Barak van de Faculteit Scheikunde, Weizmann Instituut, voor ondersteuning en advies. Dit onderzoek werd ondersteund door de Israel Science Foundation (subsidie # 913/12), en door de Minerva Foundation met financiering van het Federale Duitse Ministerie voor Onderwijs en Onderzoek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Filter sampling
HiVol 3000 - High Volume Air SamplerEcotech
Quartz Microfiber FiltersWhatman1851-865203 mm x 254 mm
ELF - Laboratory Chamber FurnacesCarboliteELF 11series
Aluminum foilOpal
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Endotoxin
EthanolSigma Aldrich16368 Laboratoriumreagens, 96%
Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1ESCO10011712
Pyrotell -TAssociates of Cape Cod, Inc.T0051
Control Standard EndotoxinAssociates of Cape Cod, Inc.E0005-1Escherichia coli O113:H10, 0,5 µg/vial 1 Pack
LAL Reagent WaterAssociates of Cape Cod, Inc.W0051
10 ml steriele spuit met Luer-Lok tipBecton-Dickinson & Co.309605
BD Precisionglide spuitnaaldBecton-Dickinson & Co.305129Steriele 
Parafilm-M afdichtingstapeParafilmP7543Sigma catalogusnummer
MicrotubesAxigenMCT-200-C2 ml, pyrogeenvrij
1,12 cm diameter Cork BorerBoekel Scientific1601 BD Series - SteelOnderdeel van een kurksnijdersset met snijders met verschillende diameters. 
50 mm Petri SchaalMiniplast Ein-Shemer72050-01Aseptisch
Vortex Genie 2 Scientific Industries, inc.SI-0297
Microcentrifuge 5415 DEppendorf22621408
TC MicroWell 96 F SI met dekselNunc167008Vlakke bodemputjes (met deksel (individueel verpakt)), steriele, pyrogeenvrij
Synergy HT Multi-Detection Microplate ReaderBiotek7091000
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DNA
DNA wegSigma Aldrich7010
Standaard DNA van de microbiële soort van belangATCC of andere kweekcollectieOfwel de geschikte microbiële stam voor DNA-extractie of het geëxtraheerde DNA
Neubauer-verbeterdMarienfeld640030hemocytometers
TE buffer, Low EDTALife Technologies12090-01510 mM Tris-HCl (pH 8,0) 0,1 mM EDTA 
Nuclease-vrije PCR-kwaliteit water Sigma Aldrich3315959001
PCR-primersSigma AldrichRicht zich op de microbiële soort van belang
Dual-Labeled ProbesSigma AldrichRicht zich op de microbiële soort van belang
SchroefdopbuisjesAxigenST-200-SS2 ml 
PowerSoil DNA-extractiekit Mo Bio Laboratories12888-100
Glasperken, zuurgewassen 425-600 µmSigma AldrichG8772-100G
Glasperken, zuurgewassen <106 µmSigma AldrichG4649-100G
PowerSoil Solution C1Mo Bio Laboratories12888-100-1Cell lysis buffer, Power soil Kit
Magic Touch ijsemmerBel-Art18848-4001
Mini-Beadbeater-16BioSpec607EUR
StepOnePlus Real-Time PCR-systeemApplied Biosystems4376600
Fast SYBR Green Master MixApplied Biosystems4385612
TaqMan Gene Expression Master MixApplied Biosystems4370048
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reactieplaat met streepjescode, 0,1 mlApplied Biosystems4346906
MicroAmp Splash-Free 96-Well BasisApplied Biosystems4312063
MicroAmp Optische LijmfolieApplied Biosystems4311971
Centrifuge 5810 REppendorf5811 000.010Rotor A-4-62 met MTP emmers 

Referenties

  1. Methods of Air Sampling and Analysis. Lodge, J. P. J. , 3rd ed, Lewis Publishers, Inc. (1988).
  2. Costa, V., et al. Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns. Atmos. Res. , (2015).
  3. Brent, L. C. Development, enhancement, and evaluation of aircraft measurement techniques for national ambient air quality standard criteria pollutants [dissertation]. , University of Maryland, College Park. Thesis 3682591 (2014).
  4. Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
  5. Hospodsky, D., et al. Characterizing airborne fungal and bacterial concentrations and emission rates in six occupied children's classrooms. Indoor air. , (2014).
  6. Bottos, E., Woo, A., Zawar-Reza, P., Pointing, S., Cary, S. Airborne Bacterial Populations Above Desert Soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. Microb. Ecol. 67, 120-128 (2014).
  7. Ovadnevaite, J., et al. Submicron NE Atlantic marine aerosol chemical composition and abundance: Seasonal trends and air mass categorization. J. Geophys. Res. Atmos. 119, (2014).
  8. Lodge, J. Jr ES&T Books: Methods of Air Sampling and Analysis, 3rd ed. Environ. Sci. Technol. 23, 938(1989).
  9. Aerosol Measurement: Principles, Techniques, and Applications. Pramod, K., Baron, P. A., Willeke, K. , John Wiley & Sons. (2011).
  10. Vincent, J. H. Aerosol Sampling: Science, Standards, Instrumentation and Applications. , John Wiley & Sons. (2007).
  11. Duquenne, P., Marchand, G., Duchaine, C. Measurement of Endotoxins in Bioaerosols at Workplace: A Critical Review of Literature and a Standardization Issue. Ann. Occup. Hyg. 57, 137-172 (2013).
  12. Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
  13. Lewtas, J. Air pollution combustion emissions: Characterization of causative agents and mechanisms associated with cancer, reproductive, and cardiovascular effects. Mutat. Res.-Rev. Mutat. 636, 95-133 (2007).
  14. Lang-Yona, N., Lehahn, Y., Herut, B., Burshtein, N., Rudich, Y. Marine aerosol as a possible source for endotoxins in coastal areas. Sci. Total. Environ. 499, 311-318 (2014).
  15. Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197 (1968).
  16. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
  17. O'Dowd, C. D., de Leeuw, G. Marine aerosol production: a review of the current knowledge. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 1753-1774 (2007).
  18. O'Dowd, C. D., et al. Biogenically driven organic contribution to marine aerosol. Nature. 431, 676-680 (2004).
  19. Yang, R., Paparini, A., Monis, P., Ryan, U. Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples. Int. J. Parasitol. 44, 1105-1113 (2014).
  20. Stetzenbach, L. D., Buttner, M. P., Cruz, P. Detection and enumeration of airborne biocontaminants. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 170-174 (2004).
  21. Dannemiller, K. C., Gent, J. F., Leaderer, B. P., Peccia, J. Influence of housing characteristics on bacterial and fungal communities in homes of asthmatic children. Indoor air. , (2015).
  22. Yamamoto, N., Hospodsky, D., Dannemiller, K. C., Nazaroff, W. W., Peccia, J. Indoor emissions as a primary source of airborne allergenic fungal particles in classrooms. Environ. Sci. Technol. 49, 5098-5106 (2015).
  23. Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6, 1801-1811 (2012).
  24. Karottki, D. G., et al. Cardiovascular and lung function in relation to outdoor and indoor exposure to fine and ultrafine particulate matter in middle-aged subjects. Environ Int. 73, 372-381 (2014).
  25. Guy, D. Endotoxins and Depyrogenation. Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls. Hodges, N., Hanlon, G. , Euromed. 12.1-12.15 (2003).
  26. Associates of Cape Cod Incorporated. Limulus Amebocyte Lysate - PYROTELL-T. , Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/inserts/PyrotellT.pdf (2006).
  27. Associates of Cape Cod Incorporated. Endotoxin (E. coli O113:H10) Control Standard Endotoxin (CSE). , Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/pisheets/CSE%200.5ug.pdf (2007).
  28. Associates of Cape Cod Incorporated. Cape Cod Certificate of Analysis. , Available from: http://www.acciusa.com/pageCOA.php (2015).
  29. Thorne, P. S., Bartlett, K. H., Phipps, J., Kulhankova, K. Evaluation of Five Extraction Protocols for Quantification of Endotoxin in Metalworking Fluid Aerosol. Ann. Occup. Hyg. 47, 31-36 (2003).
  30. Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem. Mol. Biol. Educ. 39, 145-154 (2011).
  31. Madigan, M. T., Clark, D. P., Stahl, D., Martinko, J. M. Brock Biology of Microorganisms. , 13th ed, Benjamin Cummings. (2011).
  32. Watson, J. G., Chow, J. C. Aerosol Measurement: Principles and Techniques. , 3rd ed, John Wiley & Sons, Inc. 591-613 (2011).
  33. Mueller-Anneling, L., Avol, E., Peters, J. M., Thorne, P. S. Ambient endotoxin concentrations in PM10 from Southern California. Environ. Health Perspect. 112, 583-588 (2004).
  34. Hospodsky, D., Yamamoto, N., Peccia, J. Accuracy, Precision, and Method Detection Limits of Quantitative PCR for Airborne Bacteria and Fungi. Appl. Environ. Microbiol. 76, 7004-7012 (2010).
  35. Kutyavin, I. V., et al. 3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28, 655-661 (2000).
  36. Brankatschk, R., Bodenhausen, N., Zeyer, J., Bürgmann, H. Simple absolute quantification method correcting for quantitative PCR efficiency variations for microbial community samples. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4481-4489 (2012).
  37. Strober, W. Appendix 3B, Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  38. Hollander, A., Heederik, D., Versloot, P., Douwes, J. Inhibition and enhancement in the analysis of airborne endotoxin levels in various occupational environments. Am Ind Hyg Assoc J. 54, 647-653 (1993).
  39. Kennedy, S. PCR troubleshooting and optimization : the essential guide. , Caister Academic Press. (2011).
  40. Joiner, T. J., Kraus, P. F., Kupiec, T. C. Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products. Int J Pharm Compd. 6, 408-409 (2002).
  41. Ebentier, D. L., et al. Evaluation of the repeatability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial source tracking methods. Water Res. 47, 6839-6848 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

EndotoxineanalyseDNA extractiefilterbemonsteringturbidimetrische metingkwantitatieve PCRglaskraal homogenisatiepygeenvrij watercentrifugatieprotocolveiligheidskastmicroplatereader

Gerelateerde artikelen