Dit is een snel, kosteneffectief protocol voor de productie van uitgescheiden, geglycoseerde zoogdier-eiwitten en daaropvolgende eenstapszuivering met voldoende opbrengsten van homogeen eiwit voor röntgenkristallografie en andere biofysische studies.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Efficiënte zoogdiercelexpressie en Single-step Zuivering van extracellulaire Glycoproteïnen voor kristallisatie
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De productie van uitgescheiden zoogdier-eiwitten voor structurele en biofysische studies kan uitdagend, tijdrovend en kostbaar zijn. Hier wordt een tijd- en kostenefficiënt protocol beschreven voor de expressie van uitgescheiden eiwitten in zoogdiercellen en een stap zuivering met behulp van nikkel-affiniteitschromatografie. Het systeem is gebaseerd op grootschalige tijdelijke transfectie van zoogdiercellen in suspensie, wat de tijd om eiwitten te produceren aanzienlijk verkort, omdat het stappen elimineert, zoals het ontwikkelen van expressievirussen of het genereren van stabiele cellijnen die eiwitten aanmaken. Dit protocol maakt gebruik van goedkope transfectiemiddelen, die eenvoudig kunnen worden gemaakt door eenvoudige chemische modificatie, of matig geprijsde transfectiemiddelen, die het rendement verhogen door een verhoogde transfectie-efficiëntie en verminderde cytotoxiciteit. Zorgvuldige bewaking en het handhaven van glucoseniveaus in het medium verhoogt het eiwitrendement. Het controleren van de rijping van native glycanen in de expressiestap verhoogt het uiteindelijke rendement van goed gevouwen en functionele zoogdier-eiwitten, wat ideale eigenschappen zijn om röntgenkristallografie na te streven. In sommige gevallen produceert een enkele zuiveringsstap eiwit van voldoende zuiverheid voor kristallisatie, wat hier als voorbeeld wordt gedemonstreerd.
Inleiding
Inzicht eiwitstructuur op atomair niveau is de sleutel tot het blootleggen van de moleculaire basis van biologische processen en ziekten. X-ray kristallografie eiwit is het meest gebruikte / toepasbare methode voor de bepaling van macromoleculaire structuren. De belangrijkste uitdaging van deze methode is het verkrijgen van voldoende hoeveelheden correct gevouwen, zuiver eiwit. Dit wordt een probleem in het bijzonder bij het werken met uitgescheiden eiwitten van zoogdieren, welke specifieke post-translationele modificaties ondergaan.
Bacterieel tot expressie gebrachte eiwitten zijn de primaire bron van de gekristalliseerde eiwitten gedepo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. De productie van Milligram hoeveelheden van plasmide DNA voor grootschalige tijdelijke transfectie
- Kloon het eiwit van belang in een groot aantal kopieën zoogdierexpressievector behulp restrictieplaats klonering of andere geschikte techniek.
- Voor optimale resultaten gebruikt pHLsec 7 vector, die een ingebouwde C-terminaal 6His-tag, een sterke promoter Kozak-sequentie en een geoptimaliseerde secretiesignaal.
- Transformeer het plasmide op competente cellen.
- Voeg 20 pi competente E. coli cellen op 1 ug plasmide DNA en incubeer op ijs gedurende 30 min.
- Heat shock cellen bij 42 ° C gedurende 35 second....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hierbij volgt de resultaten van dit expressiesysteem toegepast op een 13 kDa uitgescheiden immunoglobuline (Ig) domein van het humane eiwit triggering receptor tot expressie gebracht op myeloïde cellen 2 (hTREM2, residuen 19-132). TREM2 is een type I transmembraan eiwit dat een enkel extracellulair Ig-domein dat twee disulfidebindingen en twee N-gebonden glycosyleringsplaatsen heeft. In tegenstelling tot veel andere Ig-domein eiwitten 8, TREM2 was niet ontvankelijk voor hervouwing uit bacteriële inclusielicha.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
HEK 293F cellen bieden robuuste productie van eiwitten die posttranslationele modificaties. Dit systeem maakt een snelle en schaalbare expressie van natief gevouwen eiwitten die disulfiden, glycosylering, en fosforylering die anders afwezig zou zijn het gebruik van meer routine expressie gereedschappen. Bovendien kan dit systeem worden gebruikt voor de expressie en zuivering van multi-eiwit complexen eenvoudig door co-transfectie van meerdere plasmiden. Naast TREM2, heeft dit systeem uitgebreid gebruikt voor functionele.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door NIH R01-HL119813 (aan T.J.B.), American Lung Association RG-196051 (aan T.J.B.), een CIMED Pilot and Feasibility-subsidie (aan T.J.B.), American Heart Association Predoctoral Fellowships 14PRE19970008 (aan Z.Y.) en 15PRE22110004 (aan D.L.K.).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Gebruik in plaats van Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cel Cultuur Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring Systeem |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Vrij Medium voor DNA transfectie |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
Referenties
- Meyer, S., et al. Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins. PLoS One. 8, e68674(2013).
- Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
