Efficiënte zoogdiercelexpressie en Single-step Zuivering van extracellulaire Glycoproteïnen voor kristallisatie

Summary

Dit is een snel, kosteneffectief protocol voor de productie van uitgescheiden, geglycoseerde zoogdier-eiwitten en daaropvolgende eenstapszuivering met voldoende opbrengsten van homogeen eiwit voor röntgenkristallografie en andere biofysische studies.

Abstract

De productie van uitgescheiden zoogdier-eiwitten voor structurele en biofysische studies kan uitdagend, tijdrovend en kostbaar zijn. Hier wordt een tijd- en kostenefficiënt protocol beschreven voor de expressie van uitgescheiden eiwitten in zoogdiercellen en een stap zuivering met behulp van nikkel-affiniteitschromatografie. Het systeem is gebaseerd op grootschalige tijdelijke transfectie van zoogdiercellen in suspensie, wat de tijd om eiwitten te produceren aanzienlijk verkort, omdat het stappen elimineert, zoals het ontwikkelen van expressievirussen of het genereren van stabiele cellijnen die eiwitten aanmaken. Dit protocol maakt gebruik van goedkope transfectiemiddelen, die eenvoudig kunnen worden gemaakt door eenvoudige chemische modificatie, of matig geprijsde transfectiemiddelen, die het rendement verhogen door een verhoogde transfectie-efficiëntie en verminderde cytotoxiciteit. Zorgvuldige bewaking en het handhaven van glucoseniveaus in het medium verhoogt het eiwitrendement. Het controleren van de rijping van native glycanen in de expressiestap verhoogt het uiteindelijke rendement van goed gevouwen en functionele zoogdier-eiwitten, wat ideale eigenschappen zijn om röntgenkristallografie na te streven. In sommige gevallen produceert een enkele zuiveringsstap eiwit van voldoende zuiverheid voor kristallisatie, wat hier als voorbeeld wordt gedemonstreerd.

Introduction

Inzicht eiwitstructuur op atomair niveau is de sleutel tot het blootleggen van de moleculaire basis van biologische processen en ziekten. X-ray kristallografie eiwit is het meest gebruikte / toepasbare methode voor de bepaling van macromoleculaire structuren. De belangrijkste uitdaging van deze methode is het verkrijgen van voldoende hoeveelheden correct gevouwen, zuiver eiwit. Dit wordt een probleem in het bijzonder bij het werken met uitgescheiden eiwitten van zoogdieren, welke specifieke post-translationele modificaties ondergaan.

Bacterieel tot expressie gebrachte eiwitten zijn de primaire bron van de gekristalliseerde eiwitten gedeponeerd in de Protein Data Bank ^1. Bacteriële expressiesystemen zijn grotendeels de voorkeur omdat zij snel, goedkoop en typisch van hoge opbrengsten aan eiwit. Echter, extracellulaire domeinen van zoogdiereiwitten expressie in bacteriën vaak niet goed gevouwen, waarbij opnieuw vouwen en uitgebreide zuiveringsstappen nodig zijn voorliet verkrijgen homogeen folded eiwit. Bovendien, veel zoogdiereiwitten vereisen posttranslationele glycosylering op correcte vouwing ² bereiken. Hoewel expressie en glycosylering in gist of insectencellen kunnen overwinnen van de problemen vouwen, post-translationele modificaties, zoals glycosylering, verschillen aanzienlijk van die van zoogdiercellen ^3, waardoor eiwitten onjuiste of niet-homogene modificaties.

Zoogdierlijke cellen brengen de vereiste moleculaire machinerie te zorgen voor een juiste post- translationele modificaties en vouwen; Echter, deze expressiesystemen niet typisch voorkeur van de meeste laboratoria, vanwege de beperkte opbrengsten en hoge kosten van reagentia en hulpstoffen. Polyethyleenimine (PEI), een standaard transfectie reagens is relatief goedkoop, maar legt aanzienlijke cytotoxiciteit en lage transfectie efficiëntie, resulterend in verhoogde kosten celmedia, DNA en kweken materiaal. Veel alternatieven voor PEI zijn onbetaalbaar. We pakkendeze problemen door het beschrijven van een combinatie van verbeterde celcultuur gereedschappen en chemisch gemodificeerde PEI voor de snelle en relatief goedkope werkwijze voor de expressie van gesecreteerde zoogdiereiwitten, gevolgd door enkelvoudige stap zuivering. Deze robuuste methode geeft voldoende opbrengst van functionele en biochemische studies ^4, en in sommige gevallen resulteert in eiwitten vatbaar voor kristallisatie zonder verdere zuivering.

Dit protocol beschrijft verschillende technieken om expressie te optimaliseren en de opbrengst van uitgescheiden zoogdiereiwitten in humane embryonale nier (HEK) 293F cellen gekweekt in suspensie. Transfectie-efficiëntie (en kosten), eiwitproductie en zuivering zijn allemaal sterk verbeterd door het volgen van dit protocol. PEI gemodificeerd door de toevoeging van carbamaten door middel van een eenstaps ringopeningsreactie (PEI-TMC-25, synthese en eigenschappen in detail beschreven in referentie ⁵⁾ verbetert transfectie-efficiëntie, vermindert de cytotoxiciteit van kationischemembraan verstoring en dienovereenkomstig vermindert experiment kosten. Bovendien worden cellevensvatbaarheid en eiwitexpressie sterk verbeterd met de toevoeging van cultuur aanvullingen op glucose en vitaminen leveren. Belangrijk voor de productie van geglycosyleerde eiwitten behandeling met kifunensine een niet-giftige chemische remmer van mannosidase I, produceert eiwitten met gedefinieerde, onrijpe glycanen die kan worden verwijderd door endoglycosidase EndoHf om eiwitten te leveren met een N-acetylglucosamine in plaats van een full-length N-gelinkte glycan ^6. Tenslotte, de uitscheiding van eiwitten in een serumvrij, chemisch gedefinieerd medium maakt een snelle en gemakkelijke zuivering structurele en biochemische studies. Single-step nikkel-nitrilotriazijnzuur (Ni-NTA) hars zuivering verwijdert de meeste verontreinigende soorten in de bovenstaande vloeistof en in sommige gevallen kunnen eiwit voldoende zuiver verkregen voor kristallisatie.

Protocol

1. De productie van Milligram hoeveelheden van plasmide DNA voor grootschalige tijdelijke transfectie

1. Kloon het eiwit van belang in een groot aantal kopieën zoogdierexpressievector behulp restrictieplaats klonering of andere geschikte techniek.
   1. Voor optimale resultaten gebruikt pHLsec ⁷ vector, die een ingebouwde C-terminaal 6His-tag, een sterke promoter Kozak-sequentie en een geoptimaliseerde secretiesignaal.
2. Transformeer het plasmide op competente cellen.
   1. Voeg 20 pi competente E. coli cellen op 1 ug plasmide DNA en incubeer op ijs gedurende 30 min.
   2. Heat shock cellen bij 42 ° C gedurende 35 seconden, vervolgens incuberen op ijs gedurende 2 minuten.
   3. Voeg 300 ul van microbiële groeimedium (SOC) en incubeer bij 37 ° C gedurende 45 minuten, onder schudden bij 220 rpm.
   4. Plaat cellen op agar plaat met de juiste antibiotica selectie.
      1. Met 100 ug / ml carbenicilline indien het plasmide in de vector pHLsec.
3. Cultuur kolonies in 250 ml Luria Broth (LB) medium aangevuld met 100 ug / ml antibioticum (carbenicilline) O / N bij 37 ° C, onder schudden bij 220 rpm.
4. Zuiver DNA van cultuur met Hi-Speed ​​Plasmid Maxi Kit volgens het protocol van de fabrikant.
   1. Elueer DNA in buffer EB (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) in plaats van buffer TE.
   2. Aliquot het gezuiverde plasmide in hoeveelheid die nodig is voor transfectie en bewaar bij -20 ° C.

2. Grootschalige Cultuur en Transient Transfectie van 293F-cellen

1. Supplement 1 L 293F medium met 10 ml glutamine en 5 ml Pen / Strep (beide 100x). Bewaar bij 4 ° C. 5 ml Pen / Strep een voldoende sterkte in serumvrije omstandigheden en de verlaagde antibioticumconcentratie verbetert levensvatbaarheid van de cellen gedurende transfectie, welk eiwit opbrengst verbetert.
2. Cultuur 293F cellen in 300 ml media in 1 L polycarbonaat verbijsterd erlenmeyers met geventileerde dops bij 37 ° C met 8% CO _2, onder schudden in een standaard weefselkweek incubator.
3. Verdun cellen tot 5 x 10 ⁵ / ml dichtheid één dag voor transfectie.
4. Op de dag van transfectie supplement kweekmedium door toevoeging van 10% volume van 2% w / v Cell Boost in 293F media.
   1. Meet glucoseconcentratie met een glucosemonitor volgens de instructies van de fabrikant en gebruikt supplementen nodig is om een ​​glucoseconcentratie van 500 mg / dl te bereiken.
5. Voeg kifunensine (1 ug / ml eindconcentratie) in deze stap proteïneglycosylering beheersen.
6. Bereken hoeveelheid DNA die nodig is voor 1 ug plasmide per 1 x 10 ⁶ cellen. Onder steriele omstandigheden, verdund DNA in 5 ml serumvrij medium.
7. Bereken volume transfectiereagens vereist 1 ug plasmide per 2 pl transfectiereagens. Onder steriele omstandigheden verdunde transfectiereagens (PEI-TMC-25) in 5 ml serumvrij medium.
8. Toevoegentransfectiereagens in DNA-oplossing in stappen van 1 ml, voorzichtig mengen. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur reagens-DNA-complexen te vormen. Voeg vervolgens de oplossing op de cellen in een druppelsgewijze manier.
9. Sta getransfecteerde cellen om eiwitten te uiten voor 72-96 uur. Aanvullen met ~ 10% celvolume Boost Media dag, of zoals nodig blijven lezen glucose 400-600 mg / dl.

3. Zuivering

1. Giet cultuur in een kolf centrifuge gecentrifugeerd gedurende 20 minuten bij 1300 xg om cellen te pelletiseren en verzamel de bovenstaande vloeistof. Eventueel spin tweede en / of gebruik 0,22 urn filter om supernatant te verduidelijken.
2. Voeg 10% volume 10x Ni-NTA bindingsbuffer (1,5 M NaCl, 0,5 MK ₂ HPO _4, 0,1 M Tris pH 8,5, 50 mM imidazool).
3. Bereid een zwaartekracht kolom door toevoeging van 2 ml Ni-NTA slurry in een kolom en het equilibreren met 10 kolomvolumes (CV) 1x bindingsbuffer. Indien mogelijk, doe alle kolom stappen in een 4 ° C kamer. AlternativEly, chill eiwit en alle buffers op het ijs voordat kolom stap, en houdt eiwit en verzamelde doorstroming op het ijs.
   Opmerking: Ni-NTA brij 50% hars vol en verklaard bindingscapaciteit van de fabrikant is 50 mg / ml. Ni-NTA korrels kan worden opgeladen voor meerdere doeleinden
4. Stromen de bovenstaande vloeistof over de hars en het verzamelen van doorstroming. Herhaal deze stap.
5. Wassen met 10 CV wasbuffer (300 mM NaCl, 50 mM K ₂ HPO _4, 20 mM imidazol pH 8).
6. Elueer het eiwit in 5 CV elutiebuffer (300 mM NaCl, 50 mM K ₂ HPO _4, 250 mM imidazol pH 8).
7. Indien deglycosylatie vereist:
   1. Voor een eindvolume van 0,5 ml, concentraat eluaat 0,43 ml via een centrifugatie concentrator. Indien neerslaat vorm pellet vuil door centrifugatie bij 16000 xg en 4 ° C.
   2. Voeg 50 ul van 500 mM Na-citraat pH 5,5.
   3. Voeg 20 ul van EndoHf (1 x 10 ⁶ U / ml). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
      NietE: Het enzym werkt optimaal bij 37 ° C, hetgeen kan de geconcentreerde proteïneoplossing te aggregeren. Verleng de RT incubatie, indien deglycosylatie, bepaald door SDS-PAGE en immunoblotting, onvolledig. Het enzym heeft geen activiteit bij 4 ° C.
   4. Om EndoHf verwijderen: Wash amylosehars 3x in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of definitieve opslag buffer. Incubeer eiwit met hars gedurende 1 uur bij 4 ° C. Spin 5 min bij 1000 xg om kralen pellet en verzamel de bovenstaande vloeistof.
   5. Concentreer eiwit met behulp van geschikte moleculair gewicht cutoff centrifugeren filter en buffer uitwisseling in opslag buffer (150 mM NaCl en 20 mM HEPES pH 7,5).

Results

Hierbij volgt de resultaten van dit expressiesysteem toegepast op een 13 kDa uitgescheiden immunoglobuline (Ig) domein van het humane eiwit triggering receptor tot expressie gebracht op myeloïde cellen 2 (hTREM2, residuen 19-132). TREM2 is een type I transmembraan eiwit dat een enkel extracellulair Ig-domein dat twee disulfidebindingen en twee N-gebonden glycosyleringsplaatsen heeft. In tegenstelling tot veel andere Ig-domein eiwitten ^8, TREM2 was niet ontvankelijk voor hervouwing uit bacteriële inclusielicha...

Discussion

HEK 293F cellen bieden robuuste productie van eiwitten die posttranslationele modificaties. Dit systeem maakt een snelle en schaalbare expressie van natief gevouwen eiwitten die disulfiden, glycosylering, en fosforylering die anders afwezig zou zijn het gebruik van meer routine expressie gereedschappen. Bovendien kan dit systeem worden gebruikt voor de expressie en zuivering van multi-eiwit complexen eenvoudig door co-transfectie van meerdere plasmiden. Naast TREM2, heeft dit systeem uitgebreid gebruikt voor functionele...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture Flasks	GeneMate	F-5909B
293 Freestyle Media	Gibco/Life Technologies	12338-018
GlutaMAX	Gibco/Life Technologies	35050-061	Gebruik in plaats van Glutamine
Hype 5 transfection reagent	Oz Biosciences	HY01500
293fectin transfection reagent	Life Technologies	12347019
PEI transfection reagent	Sigma-Aldrich	408727
Maxiprep Kit	Qiagen	12162
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430
Endo Hf	NEB	P0703L
Amylose Resin	NEB	E8021S
Cell Boost R05.2	HyClone	SH30584.02	Cel Cultuur Supplement
GlucCell	CESCO Bioengineering	DG2032	Glucose Monitoring Systeem
Opti-MEM	Life Technologies	519850.91	Serum Vrij Medium voor DNA transfectie
Luria Broth (LB Media)	Life Technologies	10855-001
GC10 Competent Cells	Sigma-Aldrich	G2919