Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Transformatie van probiotische gist en hun herstel van gastro-intestinale Immune Tissues Na orale sondevoeding in Muizen

12.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53453

⸱

8 februari 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 2Department of Biochemistry, Emory University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Hier voorgesteld is een enkelvoudige beschrijving van technieken die kunnen worden gebruikt voor het ontwikkelen, veranderen, beheren en testen heterologe eiwitexpressie van de probiotische gist Saccharomyces boulardii.

Samenvatting

De ontwikkeling van recombinante orale therapie zou een meer directe aanpak van het mucosale immuunsysteem mogelijk maken en de mogelijkheid verbeteren om gastro-intestinale aandoeningen te bestrijden. Het aanpassen van specifiek probiotische gist voor deze benadering biedt verschillende voordelen. Deze stammen hebben niet alleen het potentieel om een grote verscheidenheid aan complexe heterologe eiwitten te synthetiseren, maar zijn ook in staat om te overleven en die eiwitten te beschermen tijdens het transport door de darm. Belangrijk is echter dat deze aanpak expertise vereist in vele diverse laboratoriumtechnieken die doorgaans niet in tandem worden gebruikt. Verder, hoewel individuele protocollen voor gisttransformatie goed gekarakteriseerd zijn voor veelgebruikte laboratoriumstammen, wordt hier de nadruk gelegd op alternatieve benaderingen en de belangrijkheid van het optimaliseren van transformatie voor minder goed gekarakteriseerde probiotische stammen. Het beschrijven van deze methoden zal de discussie helpen faciliteren over de beste benaderingen voor het testen van probiotische gist als orale geneesmiddelafgiftesystemen en zal inderdaad dienen om de ontwikkeling van deze nieuwe strategie voor gastro-intestinale therapie te bevorderen.

Inleiding

Probiotische micro- organismen een intrigerende potentieel middel efficiënt en economisch afleveren heterologe eiwitten aan het maagdarmkanaal. Deze organismen kunnen overleven passage door het maagdarmkanaal nog niet koloniseren 1, waardoor geregelde dosering en beperken van de blootstelling aan het geneesmiddel expressie. Bovendien de mogelijkheid om eenvoudig manipuleren deze organismen heterologe eiwit op grote schaal maakt ze een voordelig alternatief voor synthetische levering deeltjes. Echter, de ontwikkeling van een dergelijke benadering, zoals onlangs aangetoond met een auxotrofe stam van het probiotische gist Saccharomyces boulardii 2, vereist kennis van laboratoriumtechnieken gewoonlijk niet gecombineerd tot een bepaald onderzoek, van gist en moleculaire biologie dier behandelingstechnieken en immunologische werkwijzen. Hoewel dus de hierin beschreven afzonderlijke procedures op zichzelf niet nieuwlaboratoriumprotocollen het doel van dit manuscript is om een ​​uniforme inleiding technieken die nodig zijn voor experimentele testen van probiotische gist geneesmiddelafgiftedragers met het muize maagdarmkanaal aanwezig. Verschaft wordt een compilatie van essentiële protocollen: 1) productie van auxotrofe mutante giststammen die gemakkelijk genetisch kunnen worden gemanipuleerd; 2) transformatie van gist culturen heteroloog eiwit tot expressie brengen; 3) toediening van recombinant gist de darm via orale gavage; en 4) het herstel van levensvatbare recombinant probiotische gist uit de muizen darm en beoordeling van hun heterologe eiwitexpressie.

Eerst, hoewel talrijke positieve en negatieve selectie methoden bestaan ​​voor het manipuleren van gistsoorten, negatieve selectie bijvoorbeeld door het gebruik van auxotrofe merkers verhoogt de efficiëntie en het gemak waarmee gist kan worden getransformeerd en geselecteerd. Positieve selectie van transformanten het gebruik van antibiotica, in samenwerkingntrast, verhoogt de kosten van gist manipulatie. Bovendien kan selectie van gist op antibiotica bevattende vaste media zorgen voor meer groei van getransformeerde achtergrond kolonies ten opzichte van selectie van auxotrofe gist over synthetische drop-out vaste media (niet gepubliceerde waarnemingen). Auxotrofe gist stammen die enzymen die kritisch zijn voor de synthese van essentiële aminozuren of uracil ontbreekt. Dergelijke gist kan alleen groeien als aangevuld met de ontbrekende metaboliet of metabole gen, waardoor negatieve selectie wanneer gist wordt uitgeplaat op synthetische drop-out media dat de essentiële metaboliet ontbreekt. Veel veelgebruikte Saccharomyces cerevisiae laboratoriumstammen zijn in feite al auxotrofe mutanten 3. Industriële, klinische en probiotische giststammen zijn echter meestal prototrofe met de mogelijkheid om alle benodigde voedingsstoffen synthetiseren. Efficiëntere genetische manipulatie van dergelijke gist mogelijk te maken, kunnen auxotrofe genen selectief worden gerichtstammen die kunnen worden geselecteerd zonder antibiotica te genereren. Specifiek richten auxotrofe merker genen kan worden bereikt door PCR gemedieerde genverstoring beroep op homologe recombinatie of recenter tot CRISPR / Cas9 targeting 4-6. Als alternatief kunnen UV-mutagenese snel genereren auxotrofe mutanten zelfs in giststammen die transformatie met meerdere plasmiden is technisch moeilijk 7. Terwijl PCR targeting en CRISPR / Cas9 zijn uitgebreid elders zijn beschreven, gepresenteerd in het eerste deel van dit manuscript is een gedetailleerd protocol beschrijft een UV-mutagenese benadering van auxotrofe stammen die zal zorgen voor negatieve selectie in plaats van positief antibiotische selectie van gist-transformanten te creëren.

De volgende noodzakelijke stap in het gebruik van dergelijke auxotrofe stammen voor orale afgifte van heteroloog eiwit gist transformatie met plasmide-DNA. Sinds de eerste succesvolle transformatie van yeast sferoplasten gerapporteerd voor Saccharomyces cerevisiae in 1978 8, zijn talrijke wijzigingen gekarakteriseerd om de efficiëntie en het gemak waarmee gistsoort genetisch kunnen worden gemodificeerd. Gebruik van elektroporatie voor de succesvolle transformatie van DNA in S. cerevisiae werd eerst beschreven in 1985 9 en is sindsdien verbeterd via de toevoeging van 1 M sorbitol incubatie osmotisch steuncellen 10. Electroporatie efficiency is bovendien aangetoond dat afhangen van de gistsoort en stam celaantal en groeifase, elektroporatie volume, veldsterkte en specifieke buffers 11. Lithiumacetaat (LiOAc) transformatie, oorspronkelijk beschreven door Ito et al. 12, is een van de meest gebruikte transformatie protocollen zoals vereist geen speciale apparatuur. Aanvullende analyses toonden aan dat de efficiëntie van LiOAc gist transformatie verhoogt wanneer cellen worden verzameld in mid-log-fasegroei en worden warmteschok in aanwezigheid van polyethyleenglycol (PEG) en DNA bij 42 ° C 12. Incubatie van intacte gist geheel met PEG is essentieel voor efficiënte transformatie, mogelijk door verbetering bevestiging van DNA aan het celmembraan en via andere effecten op het membraan 13. Lithium zelf verhoogt ook de permeabiliteit van intacte cellen 14. Hoewel de meeste laboratorium S. cerevisiae stammen kunnen gemakkelijk worden omgezet middels LiOAc transformatie 3, kunnen andere gistsoorten efficiënter omgezet alternatieve protocollen. Pichia pastoris, bijvoorbeeld, is het meest efficiënt omgezet via elektroporatie plaats LiOAc transformatie 13. Het is cruciaal derhalve testen meerdere methoden voor transformatie en incubatieperiode en reagens concentraties te optimaliseren bij een poging om genetisch te modificeren een uncharacterized giststam. Dit manuscript beschrijft dus zowel LiOAc transformation en elektroporatie als technieken voor de transformatie van auxotrofe mutant en wildtype S. boulardii. Geïnteresseerde lezers zijn gericht op de recente beoordelingen voor een grondige beschrijving van de evolutie van gist transformatie, alternatieve protocollen, en de verdere discussies over mogelijke werkingsmechanismen 13,15. Transformatie van gist met plasmide dat codeert voor een gemakkelijk detecteerbaar eiwit ook van groot belang voor stroomafwaartse testen teneinde juiste expressie en functie van heteroloog eiwit te garanderen. Talloze verschillende eiwitten kunnen worden geselecteerd afhankelijk van het uiteindelijke doel van de therapeutische studie en de voor eiwit detectie antilichamen door immunoblotting, ELISA en andere technieken. Protocollen voor deze technieken zijn uitvoerig beschreven elders 16,17 en kunnen worden gebruikt om niveaus van heterologe eiwitproductie uit getransformeerde gist te bepalen in vergelijking met standaard curves. Voor demonstratiedoeleinden en tonensuccesvolle productie van een zeer algemeen gebruikte eiwit in gist biologie, dit manuscript geeft transformatie met plasmide dat codeert voor groen fluorescent eiwit (GFP), waardoor voor daaropvolgende detectie middels fluorescentiemicroscopie.

Even belangrijk voor de productie van probiotische organismen die tot expressie heteroloog eiwit goed beheer en detectie van deze micro-organismen in het maagdarmkanaal weefsels, zoals uiteengezet onder drie en vier. Toediening van recombinant gist via orale sondevoeding maakt afgifte van gecontroleerde hoeveelheden gist direct in de maag, waar C57BL / 6-muizen van nature niet in staat 18 braken. Echter, ongepaste dierlijke behandeling en sondevoeding leiden tot slokdarmkanker schade en perforatie, maagperforatie, tracheale administratie en aspiratiepneumonie 19,20. Slechte techniek en onervarenheid kan verder toenemen variabiliteit in muizen immuunreacties en experimentele results, die zijn toegeschreven aan dierlijke nadruk op orale gavage 21,22. Praktijk de juiste techniek kan derhalve niet alleen ongemak verminderen dier, maar ook precisie van experimentele resultaten verhogen. Dit manuscript beschrijft en demonstreert dierlijke behandeling en orale sondevoeding voor het beheer van gecontroleerde doses van recombinant gist.

Tenslotte is het essentieel om succesvolle uitvoering van recombinante gist bevestigd door analyse lymfoïde weefsels op de aanwezigheid van gist en heteroloog eiwit. Het maag immune weefsels die het gemakkelijkst en voorspelbaar voor de vinding onderzocht zijn de plaques van Peyer. Peyer's patches zijn secundaire lymfoide organen langs de dunne darm dat de belangrijkste bezienswaardigheden van mucosale immuunrespons inductie 23 zijn. Antigenen uit de lumen worden overgedragen via transcellulair microfold (M) cellen in het epitheel en vrijkomen in de plaques van Peyer, aldus blootstellen omsluitend antigeenpresenterende cellen luminale inhoud intestinale. Hoewel deeltjes opname door de intestinale epitheel ook kan worden bereikt door slijmbekercellen werden deze cellen is aangetoond dat alleen van deeltjes kleiner dan 0,02 pm in diameter 24. Transepithele dendrieten verlengd van CD103 + dendritische cellen (DC) ook van kleine deeltjes uit het darmlumen 25; Er zijn echter nog geen rapporten die aantonen dat CD103 + DCs nemen deeltjes groter dan bacteriën. Aldus intact probiotische gist, van gemiddelde grootte tussen 3-6 pm in diameter, hoogstwaarschijnlijk door M-cellen worden genomen en overgedragen aan de plekken van Peyer. Hier beschreven is een protocol voor het verzamelen en screening van plaques van Peyer van levensvatbare recombinante gist, alhoewel deze procedure ook gemakkelijk kan worden aangepast voor de evaluatie opname van probiotische bacteriën.

Kortom, de beoordeling recombinante probiotische gist voor de levering van derapeutic eiwitten naar de darm vereist vaardigheid in laboratoriumtechnieken verspreid over de moleculaire biologie van dieren handling en immunologie. hier gepresenteerde zijn protocollen voor 1) het genereren en screenen van auxotrofe giststammen die gemakkelijk kan negatief zonder antibiotica worden geselecteerd, 2) alternatieve protocollen om gist te transformeren en in staat de expressie van heteroloog eiwit, 3) demonstraties van de juiste behandeling van dieren technieken en orale sondevoeding voor intragastrische levering van recombinante gist, en 4) protocollen voor Peyer's patch dissectie en screenen op levensvatbare recombinante gist en functioneel heterologe eiwitten. Samen zullen deze protocollen zorgen voor het genereren en testen van een probiotische giststam kan leveren heteroloog therapeutisch eiwit aan het maagdarmkanaal.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. UV Mutagenese aan auxotrofe giststammen genereren

  1. Genereer survival curves om de benodigde dosis UV-straling te bepalen
    1. Bereid YPD (gistextract pepton dextrose) media en andere reagentia in Tabel 1 opgesomde volgens standaardprocedures 26 en beënt enkele kolonies in 5-10 ml YPD-medium. Incubeer kweken op een roller trommel bij 30 ° CO / N tot verzadiging minstens 8 uur.
    2. Bepaal de celconcentratie van O / N culturen met een spectrofotometer cellen door verdunning 1:10 in water in een plastic cuvet. Verdun cellen tot een concentratie van 10 7 cellen / ml in 20 ml steriel gedestilleerd water.
    3. Giet cellen verdund in een steriele plastic petrischaal en met verwijderde deksel, plaatst de plaat 14 cm onder een UV-lamp.
    4. Blootstellen cellen seriële uJ 5000 en 10.000 uJ doses UV bestraling, het extraheren 500 gl cellen na elke toename zodat cellenbemonsterd na blootstelling aan 0 uJ, 5000 uJ, uJ 10.000, 15.000 uJ, uJ 20.000, 25.000 uJ, uJ 30.000, 40.000 uJ en 50.000 uJ van UV bestraling. Transfer gewonnen cel monsters steriel 1,5 ml buizen en serieel verdund om 1:10 stappen in steriel water.
    5. Pellet cellen in elke verdunning door centrifugatie in een microcentrifuge bij 16.000 xg gedurende 1 min. Aspireren supernatant en resuspendeer in 100 ul volume steriel water geschikt is voor uitplaten gistcellen. Pipetteer de volledige omvang van de geresuspendeerde cellen op platen met YPD vaste media en het gebruik van een steriele spreader gelijkmatig cellen verdelen over elke plaat.
    6. Wikkel plaatranden in Parafilm om uitdroging van de media en de afdekplaten voorkomen in aluminiumfolie om foto-reactivering en reparatie van UV-geïnduceerde mutaties te voorkomen. Incubeer de platen ondersteboven op 30 ° C gedurende 2-4 dagen om de groei van de levensvatbare gist kolonies (figuur 1).
    7. Tel de number van de kolonies, eventueel met de hulp van een pen om af te bakenen geteld kolonies, een draagbare elektronische teller pen, of een teller staan ​​met vergroting. Plot als percentage van de totale cellen uitgeplaat bij elk uJ dosis UV-bestraling een overlevingscurve voor bestraalde gist (Figuur 2) opwekken.
      OPMERKING: haploïdegiststammen kan worden verwacht dat lagere doses UV bestraling opzichte van diploïde stammen nodig om hetzelfde percentage overleving bereikt. Een stam van gist die functionele DNA herstel enzymen, zoals Rad1 S. cerevisiae mutant, kan worden gebruikt als een positieve controle voor de aanwezigheid van UV bestraling bij zeer lage doses geven.
    8. Bepaal de dosis UV mutagenese worden gebruikt voor het screenen onder verwijzing naar de overlevingscurve in 1.1.7 vastgesteld. De x-waarde van het punt langs de overlevingscurve waarbij y gelijk 50 is de UV straling dosis waarbij 50% gist overleeft. Screening mutanten in dit lage percentage overleving kan eenhogere opbrengst aan succes gemuteerde stammen, met name voor diploïde gist. De dosis van 50% overleving voor WT S. boulardii, zoals getoond in figuur 2, is ongeveer 18.000 uJ.
      Opmerking Hoewel zulke hoge UV doses verhogen de kans op mutaties in genen anders dan de auxotrofe marker gen van belang cellulaire routes, moet dit nadeel afgewogen tegen de noodzaak om mutaties in beide kopieën van de auxotrofe merker gen induceren. Op haploïde stammen die op één genkopie worden gemuteerd, screening op een hoger percentage overleving, bijvoorbeeld bij 90%, vermindert het risico van aanvullende mutaties en toch zorgt voor voldoende vorming van auxotrofe mutanten.
  2. UV mutagenese en screening op auxotrofe giststammen
    1. Bereid gist zoals beschreven in de stappen 1.1.1-1.1.3.
    2. Expose gist de dosis UV-straling die overeenkomt met 50% overleving, zoals bepaald in 1.1.8. Voor WT S. boulardii, deze dosis was vastbesloten ongeveer 18.000 uJ (figuur 2) zijn.
    3. Verzamel 1 ml hoeveelheden UV bestraalde gist en pellet door centrifugeren in een microcentrifuge bij 16.000 xg gedurende 1 min. Zuig supernatant en resuspendeer cellen in 100 pi steriel water.
      1. Selectie van mutanten
        1. Bij gebruik van selectie zoals bij ura3 - auxotrofe mutanten, plaat bestraald gist op media die 5-fluororotinezuur (5-FOA) om te selecteren op cellen die een functioneel Ura3 enzym.
          OPMERKING: gist die functionele kopieën van Ura3 zal 5-FOA converteren naar het toxine 5-fluorouracil, wat leidt tot celdood en zorgen voor gemakkelijke selectie van ura3 - kolonies die een functionele Ura3 27 ontbreken. Analoge selectie benaderingen mogelijk voor de LYS2 en LYS5, TRP1 en MET2 en MET15 markers met behulp van media die α-aminoadipinezuur 28; 5-fluorantranilzuur 29; en methylkwik 30,31, respectievelijk.
        2. Pipetteer 100 ul geresuspendeerde cellen op minimaal medium dat 5-FOA en een steriele strooier gelijkmatig bekleden van de plaat. Wikkel platen in Parafilm en incubeer kop bij 30 ° C gedurende 2-4 dagen om de groei van de levensvatbare gist kolonies.
        3. Bevestigen ura3 - fenotype van elke kolonie die op 5-FOA platen door opnieuw uitstrijken op YPD, uracil - en 5-FOA platen (figuur 3). Gebruik de punt van een steriele tandenstoker om een deel van een enkele kolonie verzamelen en zachtjes sleep de cellen over verse YPD, uracil - en 5-FOA-platen. Opnieuw incubeer verpakt platen ondersteboven op 30 ° C gedurende 2-4 dagen.
          OPMERKING: Levensvatbare kolonies verschijnen als verhoogd, ruwweg ronde gezwellen terwijl niet levensvatbare cellen wordt alleen als een ondoorzichtige vlek zonder verhoogde gezwellen (figuur 3).
      2. screening mutanten
        1. Wanneer het genereren van een auxotrofe mutant waarvoor selectiemethoden niet beschikbaar zijn, bereiden seriële verdunningen van 1:10 UV bestraalde gistcellen in steriel water en de pipet verdunningen op YPD medium, met een steriele spreader gelijkmatig bekleden van de plaat.
        2. Wikkel platen in Parafilm en incubeer kop bij 30 ° C gedurende 2-4 dagen. Bepaal welke verdunning termijn voor groei van individuele kolonies die gemakkelijk kunnen worden onderscheiden van elkaar, meestal niet meer dan ongeveer 100 kolonies per plaat.
        3. UV herhaalde mutagenese gist monsters zoals beschreven in 1.2.1-1.2.3 en plaat cellen op die bepaalde verdunning. Pipetteer de verdunde gist YPD medium op een steriele spreider om de cellen te verdelen, en incubeer verpakte platen ondersteboven op 30 ° C gedurende 2-4 dagen.
        4. Scherm voor auxotrofen door replica plating op selectieve media ontbreekt het metaboliet van belang. In de eerste plaats zorgen voor een steriele fluwelen kussen op een bord standen keren de plaat met UV bestraald kolonies op de fluwelen, het markeren van de plaat oriëntatie.
        5. Vervolgens keren een frisse plaat ontbreekt de metaboliet van belang op de fluwelen en lichtjes aandrukken om cellen te brengen van de fluwelen aan de plaat. Bewaar de originele plaat staan ​​bij 4 ° C. Wikkel en incubeer de nieuwe plaat op zijn kop bij 30 ° C gedurende 2-4 dagen.
        6. Als alternatief voor replica plating, scherm mutanten door het opnieuw uitstrijken van kolonies op YPD selectieve media. Gebruik de punt van een steriele tandenstoker om een ​​deel van een enkele kolonie verzamelen en zachtjes sleep de cellen over een verse YPD plaat en een plaat zonder de metaboliet van belang. Opnieuw incubeer verpakt platen ondersteboven op 30 ° C gedurende 2-4 dagen.
          OPMERKING: Zorg moet worden genomen om enkele kolonies en streak uit kolonies meerdere keren selecteren om een ​​homogene populatie van ware auxotrofe cellen bevestigen.
    4. Verder bevestigt het fenotype van bestraalde cellen door inoculating enkele kolonies in 5-10 ml van zowel YPD en media die niet over de juiste metaboliet (bijvoorbeeld in uracil - media voor een URA3 - mutant). Incubeer op een roller trommel bij 30 ° CO / N om de groei van cellen in YPD medium maar niet bevestigd in de afwezigheid van de metaboliet.
      Opmerking Hoewel groeipatronen op vaste media duidelijk auxotrofe gist status moet geven, is het mogelijk dat sommige gist spanningen verdragen en vormen kleine, langzaam groeiende kolonies op vaste media, maar toch dezelfde omstandigheden in vloeibaar medium (ongepubliceerde waarnemingen) tolereren. Enting in vloeibare kweken moet dus worden uitgevoerd om grondig te bevestigen groeipatronen van UV bestraald mutanten.
    5. Voor opbergen van bevestigde auxotrofe mutanten termijn bereiden glycerol voorraden door inoculeren cellen in 10 ml YPD en incuberen op een roller trommel O / N bij 30 ° C. Pellet cellen door centrifugeren gedurende 3 min bij 2500 xg en zuig media. Resuspendeer cellen in 50%steriel gefiltreerd glycerol, overbrengen naar een cryoflesje en bewaar bij -80 ° C.
      LET OP: UV gemutageniseerd gist mogelijk mutaties bevatten anders dan in de auxotrofe marker van belang meerdere genen. Alvorens verder gebruik van geverifieerde auxotrofe mutanten moeten deze stammen verder geanalyseerd door middel van genetische sequentie en evaluatie van de weerstand tegen pH galzuur spanningen en andere kenmerken probiotische stammen relevant, zoals elders 2 beschreven. Daarnaast is het gebruik van pcr homologie of CRISPR / Cas9 targeting selectiever muteren auxotrofe merkers dienen als alternatief voor UV mutagenese 4 worden beschouwd - 6.

2. Gist Transformatie

  1. LiOAc Transformatie van gist
    1. Inoculeer enkelvoudige gistkolonies in 5-10 ml YPD medium en incubeer op een roller trommel bij 30 ° CO / N.
    2. Om log-fase groei induceren en efficiëntie van plasmide opname verhogen, determine celconcentratie met een spectrofotometer een 1:10 verdunning van cellen in steriel water te meten in een plastic cuvet. Verdun O / N kweken tot een OD 600 van 0,16-0,2 (ongeveer 2 x 10 6-2,5 x 10 6 cellen / ml) in 50 ml vers warm YPD en incubeer cellen op een orbitale schudinrichting ingesteld op platform 200 rpm totdat de kweek er ongeveer 1 x 10 7 cellen / ml, gewoonlijk ongeveer 4 uur.
      OPMERKING: Transformatie efficiëntie kan worden gemeten als een functie van het aantal met succes getransformeerde gist kolonievormende eenheden (CFU) per ug plasmide DNA. Verhoogde efficiëntie resultaten meer getransformeerde kolonies per ug plasmide DNA. Subcultuur gistcellen en collectie tijdens log-fase groei is een factor die transformatie-efficiëntie 12 toeneemt.
    3. Pellet cellen door centrifugeren bij 2500 xg gedurende 3 min.
    4. Zuig het supernatant en overdracht cellen een 1,5 ml microcentrifugebuis door resuspenderen de Pellet in 1 ml steriel water.
    5. Pellet cellen door centrifugatie bij 16.000 xg gedurende 1 minuut in een microcentrifuge, zuig de supernatant en was cellen door resuspenderen in 1 ml TE / LiOAc (Tris EDTA LiOAc) buffer.
    6. Herhaal centrifugeren en hersuspenderen cellen in TE / LiOAc buffer tot een concentratie van 2 x 10 9 cellen / ml.
    7. Bereid transformatie mengsels met elk van de volgende: 50 gl van bereide gist in TE / LiOAc buffer, 5 pl drager-DNA (10 ug / ul) en 1 pi plasmide-DNA (1 ug). Microgram plasmide-DNA kan worden getitreerd toenemende hoeveelheden DNA al dan niet leiden tot een verhoogde transformatie-efficiëntie 32
      OPMERKING: Voor een mutante giststam die één auxotrofe marker kan slechts één plasmide coderend voor de markering worden omgezet per monster. Verder gebruik van een plasmide dat codeert voor een gemakkelijk detecteerbaar eiwit zoals GFP, zal zorgen voor een efficiënte bepaling van juiste vouwing en expressie van heterologe protein de giststam na transformatie.
    8. Om elke bereiding, voeg 300 ul van PEG / LiOAc / TE en vortex grondig. Incubatie van intacte cellen met PEG is essentieel voor een efficiënte transformatie 13.
    9. Incubeer preparaten bij 30 ° C gedurende 30 minuten onder roeren door het plaatsen microcentrifugebuizen in een bekerglas geplaatst op een orbitale schudinrichting bij platform 200 rpm.
    10. Voeg 35 ul DMSO aan elk reactiemengsel en heat shock cellen gedurende 15 min in een 42 ° C waterbad. Hoewel er tegenstrijdige verslagen van de extra voordeel van DMSO 33 is hitteschok van intacte gistcellen aangetoond transformatie-efficiëntie 12 sterk toenemen.
    11. Was de cellen door pelleteren via centrifugeren als in 2.1.5, opzuigen of pipetteren uit de bovenstaande vloeistof, en resuspenderen in 1 ml steriel water. Voorzichtig pipet op en neer te breken van de cel pellet.
      NB: Het is belangrijk om grondig te verwijderen van de bovenstaande vloeistof, omdat de media gebruikd in het genereren van competente cellen kunnen gistgroei en kolonievorming remmen.
    12. Herhaal cel pelleteren zoals in 2.1.5, zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 100 pi steriel water. Pipetteer de volledige volume op een selectieve plaat en gebruik een steriele spreader gelijkmatig de vacht van de plaat met getransformeerde gist.
    13. Wikkel randen van beklede platen in Parafilm om uitdroging van media voorkomen en incubeer kop bij 30 ° C gedurende 2 dagen om de groei van getransformeerde gistcellen. Succesvolle, efficiënte transformatie en auxotrofe selectie van Saccharomyces cerevisiae levert een groot aantal kolonies per transformatie preparaat hoewel veel lagere opbrengst van andere stammen (figuur 4) kan zijn.
    14. WINKEL gist platen voor de korte termijn (gewoonlijk 1-3 weken) ondersteboven en bedekt bij 4 ° C. Bereid glycerol voorraden van getransformeerde gist zoals beschreven in 1.2.5 voor de lange termijn opslag.
      LET OP: Verdere studies testen getransformeerd CFU nodig om plasmidestabiliteit bepalen en juiste expressie van heteroloog eiwit te evalueren. Grondige beschrijving van plasmidestabiliteit 34, gebruik van immunoblotting gedenatureerde eiwitten gewonnen uit celmonsters 17 detecteren, enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) te detecteren goed gevouwen driedimensionale eiwitten 16 en het gebruik van GFP in gist studies 35 elders beschikbaar. Figuur 6 toont een representatief beeld van succesvolle GFP expressie in getransformeerde S. cerevisiae opzichte van getransformeerde cellen. Gebruik van een dergelijk fluorescerend eiwit is een middel efficiënt bepalen van succesvolle heterologe eiwitproductie.
  2. Elektroporatie van gist
    1. Inoculeer enkelvoudige gistkolonies in 5-10 ml YPD medium en incubeer op een roller trommel bij 30 ° CO / N.
    2. Bepaal celconcentratie met een spectrofotometer een 1:10 verdunning van cellen in steriel water te meten. diluit O / N culturen in 100 ml verse warme YPD media om een OD 600 equivalent van ongeveer 0,3. Incubeer subculturen bij 30 ° C op een orbitale platform shaker ingesteld op 200 rpm tot het bereiken van een OD 600 van ongeveer 1,6, gewoonlijk 4-5 uur. Elk 100 ml subcultuur genoeg cellen twee transformatiereacties geconditioneerd genereren.
    3. Pellet cellen door centrifugeren bij 2500 xg gedurende 3 min. Zuig het supernatant en was de cellen door resuspenderen in 50 ml ijskoud steriel water. Herhaal het wassen door pelleteren cellen, aspireren supernatant en resuspenderen in vers 50 ml ijskoud steriel water.
    4. Pellet de cellen opnieuw af en resuspendeer in 50 ml ijskoude elektroporatie buffer (1 M sorbitol, 1 mM CaCl2).
    5. Herhaal draaien als in 2.2.3, aspireren supernatant en resuspendeer cellen in 20 ml 0,1 M LiOAc / 10 mM DTT. Incubeer celsuspensie op een roller trommel bij 30 ° C gedurende 30 minuten. Voorincubatie van cellen in LiOAc en DTT synergetisch verhoogt deefficiëntie van elektroporatie 36.
    6. Pellet de cellen als in 2.2.3, verwijder supernatant, en was door resuspenderen in 50 ml ijskoude elektroporatie buffer. Herhaal centrifugeren en hersuspenderen cellen in ijskoude elektroporatie buffer tot een eindvolume van 1 ml.
    7. Voor te bereiden op het ijs: airconditioning gistcellen, steriele elektroporatie cuvetten en plasmide DNA. Onmiddellijk na uiteindelijke hersuspenderen van de cellen in 1 ml elektroporatie buffer voorziene Combineer 400 pi voorziene gistcellen met ongeveer 1 pg plasmide DNA en voeg aan een ijskoude 0,2 urn elektroporatie cuvet. Toepassing van grotere hoeveelheden DNA kan iets toenemen transformatie-efficiëntie 11. Incubeer reactie op ijs gedurende 5 minuten, dan electroporate met electroporator ingesteld op 2,5 kV en 25 uF.
      Opmerking: Zoals beschreven in 2.1.7, kan een mutante giststam die één auxotrofe marker worden getransformeerd met één plasmide codeert voor de gemuteerde marker per monster. Ook het gebruikeen plasmide dat een gemakkelijk detecteerbaar eiwit zoals GFP codeert maakt een efficiënte bepaling van juiste vouwing en de expressie van heteroloog eiwit na transformatie.
    8. Transfer geëlektroporeerde cellen in 8 ml van een 1: 1 mengsel van YPD: 1 M sorbitol en laat cellen incuberen op een roller trommel bij 30 ° C gedurende 60 minuten.
    9. Pellet cellen zoals in 2.2.3 en resuspendeer in 100 ul 1: 1 YPD: 1 M sorbitol. Plaat volledige volume op selectief medium dat 1 M sorbitol, wikkel randen van platen in Parafilm en incubeer platen ondersteboven op 30 ° C gedurende 2-5 dagen om de groei van getransformeerde gistcellen.
      Opmerking: Het is belangrijk om te testen getransformeerde gist juiste expressie van heteroloog eiwit te evalueren, zoals in 2.1.14 en 2.2.7.

3. orale sondevoeding van Muizen met Transformed Gist

  1. Voer alle dierlijke zorg en behandeling procedures volgens de Gids voor de zorg en het gebruik van het Laboratorium Anij dieren en Institutional Animal Care en goedkeuring gebruik Comite.
  2. Bereid O / N gistkweken door het enten enkele kolonies van getransformeerde auxotrofe gist in 5-10 ml selectief medium. Incubeer kweken O / N voor ten minste 8 uur op een roller trommel bij 30 ° C tot verzadiging.
    OPMERKING: Gebruik van plasmide coderend proef eiwitten zoals GFP zal voor gemak van eiwitexpressie gavaged testen in gist, zoals beschreven in 4.7.
  3. Voor maximale inductie van eiwitexpressie en log-fase groei induceren bereiden subculturen van de O / N culturen door verdunnen tot een OD 600 equivalent van ongeveer 0,16-0,2 in 50 ml geschikte media zoals beschreven in 2.1.2.
  4. Het gehalte aan subkweek cellen zoals in 1.1.2 en aangepast voor 10 9 cellen / ml. Bereid een 100 ul dosis voor elke muis, met een paar honderd ul extra volume per groep om de nauwkeurigheid te verbeteren en het gemak van het monster laden.
  5. Pellet cellen door centrifugeren bij 2500 x g3 min of in een microcentrifuge bij 16.000 xg gedurende 1 min. Aspireren supernatant en resuspendeer cellen door toevoeging van een gelijk volume steriel water en voorzichtig en neer te pipetteren.
  6. Stelt een passende gauge maagsonde naald (22 G 15-20 g muizen) op een 1 ml steriele spuit en load gist monster, en zorg ervoor dat eventuele luchtbellen en stel zuiger om een ​​100 ul increment te elimineren. Plaats een extra spuit met steriel water om sondevoeding controle muizen en controleer op eventuele aanwezigheid van vervuilende gist.
  7. Pick-up van de muis te gavaged met behulp van de niet-dominante hand, met de wijsvinger en duim stevig grijpen de huid rond de hals (figuur 6A). Steek de staart onder de pink beweging van het onderlichaam te voorkomen. Zorg ervoor dat de grip is goed beveiligd en verbiedt de muis te bewegen haar hoofd om schade aan de interne weefsels tijdens de maagsonde te voorkomen.
    LET OP: Schat hoe ver de maagsonde naald moet worden ingebracht door het vasthouden van de naald tegen de muis zodanig datde lamp zelfs met de processus xiphoideus van het sternum. Deze lengte van de naald inbrengen meestal een toelaatbaar de sondenaald lamp naar de maag voeren.
  8. Met behulp van de dominante hand, voorzichtig steek de maagsonde naald in de muis slokdarm door hengelen de naald langs het dak van de mond en de achterkant van de keel, licht houden om links van het midden. Wacht tot de muis om de lamp van de naald te slikken en laat de naald iets verder af te dalen naar het punt geschat 3.7 (figuur 6B). Wanneer één weerstand voelt het inbrengen van de maagsonde naald of de muis op elk moment begint te hijgen, verwijdert de naald opnieuw proberen om de slokdarm te vinden.
  9. Na de muis de lamp van de maagsonde naald heeft ingeslikt, zachtjes druk de zuiger tot 100 pi (10 8 CFU) van gist toe te dienen rechtstreeks in de maag van de muis.
    Opmerking Hoewel muizen kunnen geen van de gavaged oplossing braken na toediening 18,19 is het mogelijk om reflux te zijn tijdens gavage 21,37. Correct plaatsen van de maagsonde naald, alsmede het aanpassen van het volume en de viscositeit van de oplossing, kan helpen om reflux te beperken en nauwkeurige dosering.
  10. Haal de maagsonde naald uit de maag en de slokdarm van de muis en de terugkeer van de muis naar de kooi. Controleer of de muis ademt en beweegt normaliter na gavage zodat de sondenaald goed gedurende de procedure en dat er geen oplossing werd afgezogen werd ingebracht.

4. Oogst van muizen Peyer's Patches en isolatie van levensvatbare gist Colonies

  1. Op het juiste moment post punt maagsonde, meestal 4 uur, opoffering muizen met behulp van IACUC goedgekeurde methoden. Controleer bij gebrek aan respons na een teen knijpen, en gebruik een secundaire maatregel als cervicale dislocatie om de muis te offeren. Extra tijdstippen kunnen ook worden getest, talrijke studies die de efficiëntie en het tijdstip tot geblekennemen over het epitheel is deeltje afhankelijk 38,39.
  2. Leg de muis met de buik volledig blootgesteld en steriliseer de buikstreek door te besproeien met 70% EtOH. Maak een dwarse incisie door de vacht en de huid met een schaar, zorg dat u geen interne weefsels niet beschadigt. Handmatig wrikken de incisie te openen naar aanleiding van het buikvlies, de dunne serosale voering die de buikorganen bloot te leggen. Til het buikvlies en maak een dwarse incisie naar de darmen bloot te leggen.
  3. stompe tang voorzichtig te plagen de dunne darm van het mesenterische slagaders, vet en andere weefsels. Maak de dunne darm van de maag, het kwadrant linksboven van de muis buik, de blindedarm, de grote zak van darmweefsel aan het begin van de dikke darm.
  4. Isoleer de Peyer's Patches door naar 1-3 mm min of meer ronde stukken ondoorzichtig weefsel langs de dunne darm (Figuur 7). Met behulp van gebogen dissectie GCBsors wegsnijden de koepel van patch van Peyer, waardoor marges zodat geen van de aangrenzende lamina propria verzameld.
    LET OP: De meeste muizen hebben tussen de 4-8 goed zichtbaar Peyer's patches. Uitvoeren van de procedure in een gebied met directe overhead verlichting zal het gemak waarmee Peyer's patches kunnen worden gevisualiseerd verhogen.
  5. Collect ontleed Peyer's vlekken in volledige Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium (IMDM).
    LET OP: Het is cruciaal om een ​​steriele techniek te gebruiken en omvatten antibiotica in de collectie media om gastro-intestinale bacteriële besmetting van gist platen te voorkomen.
  6. Strain Peyer's vlekken door een 40 um cel zeef aan collectie media te elimineren. Wash plaques van Peyer met verse volledige IMDM over een 50 ml buis en het gebruik van een zuiger van een 1 ml spuit om voorzichtig breken van de Peyer's patches. Gespannen pellet cellen door centrifugeren bij 1800 rpm gedurende 7 minuten. Zuig supernatant en resuspendeer cellen ineen eindvolume van ongeveer 100 ui.
  7. Solliciteer gespannen cellen op selectief gist media en het gebruik van een plaat spreader gelijkmatig cellen te verdelen. Wikkel plaatranden in Parafilm en incubeer platen ondersteboven op 30 ° C gedurende 2 dagen om de groei van elke levensvatbare gist teruggewonnen uit de plekken van Peyer's muizen.
    OPMERKING: Verder onderzoek na herstel gist van Peyer 'pleisters zijn nodig om te bevestigen dat de stammen kunnen goed gevouwen heteroloog eiwit leveren deze immuun weefsels. Zoals beschreven in 2.1.14 kunnen dergelijke werkwijzen omvatten immunoblotting, ELISA of fluorescentiemicroscopie fluorescerende eiwitten zoals GFP 2,40 detecteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Genereren van een overlevingscurve na UV bestraling vereist plating verdunde gistcellen zodat afzonderlijke kolonievormende eenheden (CFU) kunnen vormen. Elk 500 pl monster verzameld zoals hierboven beschreven bevat ongeveer 5 x 10 6 cellen; Echter, meer dan 100 kolonies per plaat zijn moeilijk om nauwkeurig te onderscheiden. Plating onverdund monster en seriële verdunningen van 1:10 bestraalde cellen dus zorgt ervoor dat CFU kunnen worden geteld op elke UV dosering, zoals aan...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Samen vormen de protocollen beschrijven hierin de essentiële stappen die nodig zijn voor het ontwikkelen en testen van auxotrofe probiotische giststammen voor afgifte van heteroloog therapeutisch eiwit aan de darm. Deze manipulatie en het testen van recombinant probiotische gist vereist technieken en middelen waarmee een individu laboratorium kan op dit moment niet bekend zijn. Dus, hoewel talrijke eerdere studies de hierboven beschreven protocollen voor meerdere gist en muis stammen, deze methoden hebben niet om de ken...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs erkennen financiering via het Children's Center voor Immunologie en vaccins en een NIH New Innovator Award (1DP2AI112242-01) toegekend aan Tracey J. Lamb. De auteurs danken ook Natalya P. Degtyareva voor de gulle bijdrage van Rad1 S. cerevisiae.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
SmartSpec 3000 SpectrophotometerBioRad170-2501Voorbeeld van een spectrophotometer voor het bepalen van de celconcentratie en OD600 van gistculturen
New Brunswick Roller DrumEppendorfM1053-4004Voorbeeld van een rollerdrum voor gistcultuur incubatie
UV Stratalinker 2400Stratagene400075-03Voorbeeld stratalinker
Stuart Colony Counter SC6PLUS11983044Fisher ScientificStaand plaatje met vergroting registreert het aantal kolonies bij het voelen van druk van de pen
Scienceware Colony Counter F378620002Bel-Art SciencewareHandmatige kolonieteller pen
Replica plating deviceFisherbrand09-718-1Voorbeeld van replica plating stand en pads 
Velveteen squaresFisherbrand09-718-2
L-vormige steriele celverspreiders Fisherbrand14665230
Deoxyribonucleïnezuur, enkelstrengs uit zalmtestikelsSigma-AldrichD7656-1MLVoorbeeld drager DNA voor gist LiOAc transformatie
GavagenaaldenBraintree ScientificN-PK  002Voor muizen van 15-20 g, is de aanbevolen naald een 22 gauge (1,25 mm kogel), 1 inch lang, herbruikbare, rechte gavagenaald. Voor muizen met een gewicht van meer dan 20  g, kunnen 20 gauge of grotere rechte of gebogen gavagenaalden worden gebruikt
1 ml steriele slip-tip wegwerp tuberculine spuitBecton DickinsonBD 309659
Blunte pincetten zoals Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) getande tip, brede grip pincettenElectron Microscopy Sciences77937-28Voorbeeld van blunte pincetten nodig voor dissectie 
Rechte en gebogen dissectiescharenElectron Microscopy Sciences72966-02 en 72966-03Voorbeelden van schaar nodig voor dissectie
IMDMLife technologies12440053

Referenties

  1. Edwards-Ingram, L., Gitsham, P., et al. Genotypic and physiological characterization of Saccharomyces boulardii, the probiotic strain of Saccharomyces cerevisiae. Applied and environmental microbiology. 73 (8), 2458-2467 (2007).
  2. Hudson, L. E., Fasken, M. B., et al. Functional Heterologous Protein Expression by Genetically Engineered Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii. PloS one. 9 (11), 1-12 (2014).
  3. Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. Guthrie, C., Fink, G. R. , (1991).
  4. DiCarlo, J. E., Norville, J. E., Mali, P., Rios, X., Aach, J., Church, G. M. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  5. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  6. Lorenz, M. C., Muir, R. S., Lim, E., McElver, J., Weber, S. C., Heitman, J. Gene disruption with PCR products in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 158, 113-117 (1995).
  7. Hamedi, H., Misaghi, A., Modarressi, M. H., Salehi, T. Z., Khorasanizadeh, D., Khalaj, V. Generation of a Uracil Auxotroph Strain of the Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii as a Host for the Recombinant Protein Production. Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (1), 29-34 (2013).
  8. Hinnen, A., Hicks, J. B., Fink, G. R. Transformation of yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (4), 1929-1933 (1978).
  9. Hashimoto, H., Morikawa, H., Yamada, K., Kimura, A. A novel method for transformation of intact yeast cells by electroinjection of plasmid DNA. Appl Microbiol Biotechnol. 21, 336-339 (1985).
  10. Becker, D., Guarente, L. High-efficiency transformation of yeast by electroporation. Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. , 182-187 (1991).
  11. Benatuil, L., Perez, J. M., Belk, J., Hsieh, C. -M. An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries. Protein engineering, design & selection : PEDS. 23 (4), 155-159 (2010).
  12. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. Journal of Bacteriology. 153 (1), 166-168 (1983).
  13. Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism. Bioengineered bugs. 1 (6), 395-403 (2010).
  14. Zheng, H. Z., Liu, H. H., et al. Yeast transformation process studied by fluorescence labeling technique. Bioconjugate Chemistry. 16, 250-254 (2005).
  15. Gietz, R. D., Woods, R. A. Genetic transformation of yeast. BioTechniques. 30 (4), 816-831 (2001).
  16. JoVE Science Education Database. The ELISA Method. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2015).
  17. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (16), (2008).
  18. Horn, C. C., Kimball, B. A., et al. Why Can't Rodents Vomit? A Comparative Behavioral, Anatomical, and Physiological Study. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
  19. Hoggatt, A. F., Hoggatt, J., Honerlaw, M., Pelus, L. M. A spoonful of sugar helps the medicine go down: a novel technique to improve oral gavage in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 49 (3), 329-334 (2010).
  20. Johnson, M., Shayne, C. G., Kemper, C. J. The rat. Animal Models in Toxicology. , 50-193 (2006).
  21. Brown, A. P., Dinger, N., Levine, B. S. Stress produced by gavage administration in the rat. Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 39, 17-21 (2000).
  22. Jacoby, R., Fox, J., Davisson, M. Biology and diseases of mice. Laboratory animal medicine. , 35-133 (2002).
  23. Schulz, O., Pabst, O. Antigen sampling in the small intestine. Trends in immunology. 34 (4), 155-161 (2013).
  24. McDole, J. R., Wheeler, L. W., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
  25. Farache, J., Koren, I., et al. Luminal bacteria recruit CD103+ dendritic cells into the intestinal epithelium to sample bacterial antigens for presentation. Immunity. 38 (3), 581-595 (2013).
  26. Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , Cold Spring Harbor Lab Press. (2000).
  27. Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. A positive selection for mutants lacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance. Molecular & general genetics : MGG. 197 (2), 345-346 (1984).
  28. Chattoo, B. B., Sherman, F., Azubalis, D. A., Fjellstedt, T. A., Mehnert, D., Ogur, M. Selection of lys2 mutants of the yeast Saccharomyces cerevisiae by the utilization of alpha-aminoadipate. Genetics. 93, 51-65 (1979).
  29. Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., La Thompson,, Hollis, G. F. A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance. Yeast. 16 (6), Chichester, England. 553-560 (2000).
  30. Singh, A., Sherman, F. Genetic and physiological characterization of met15 mutants of Saccharomyces cerevisiae: a selective system for forward and reverse mutations. Genetics. 81, 75-97 (1975).
  31. Singh, A., Sherman, F. Characteristics and relationships of mercury resistant mutants and methionine auxotrophs of yeast. Journal of Bacteriology. 118 (3), 911-918 (1974).
  32. McCoy, S. L., Hausman, F. A., et al. Quantification of DNA binding to cell-surfaces by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 241, 141-146 (2000).
  33. Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
  34. Zhang, Z., Chisti, Y. Plasmid stability in recombinant saccharomyces cerevisiae. Science. 14 (4), 401-435 (1996).
  35. Lorang, J. M., Tuori, R. P., Martinez, J. P., Sawyer, T. L., Redman, R. S., Rollins, J. Green Fluorescent Protein Is Lighting Up Fungal Biology. Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).
  36. Thompson, J. R., Register, E., Curotto, J., Kurtz, M., Kelly, R. An improved protocol for the preparation of yeast cells for transformation by electroporation. Yeast. 14, 565-571 (1998).
  37. Damsch, S., Eichenbaum, G., et al. Gavage-related reflux in rats: identification, pathogenesis, and toxicological implications (review). Toxicologic pathology. 39, 348-360 (2011).
  38. Desai, M., Labhasetwar, V., Amidon, G., Levy, R. Gastrointestinal uptake of biodegradable nanoparticles: effect of particle size. Pharma. 13 (12), (1994).
  39. Shakweh, M., Ponchel, G., Fattal, E. Particle uptake by Peyer's patches: a pathway for drug and vaccine delivery. Expert opinion on drug delivery. 1 (1), (2004).
  40. Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. Journal of visualized experiments : JoVE. (80), e50921(2013).
  41. Hashimoto, S., Ogura, M., Aritomi, K., Hoshida, H., Nishizawa, Y., Akada, R. Isolation of Auxotrophic Mutants of Diploid Industrial Yeast Strains after UV Mutagenesis. Applied and environmental microbiology. 71 (1), 312-319 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Transformatie van probiotische gistUV-mutageneseorale gavage bij muizenisolatie van Peyerse plaqueslithiumacetaat-transformatieelectroporatietechniekgistcelconcentratieheterologe eiwitexpressieanalyse van gistherstel
Transformatie van probiotische gist en hun herstel van gastro-intestinale Immune Tissues Na orale sondevoeding in Muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.