Bericht Column Derivatisering behulp Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

Summary

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Abstract

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

Introduction

High performance liquid chromatografie (HPLC) in combinatie met post column derivatisering (PCD) is een krachtige tool die nuttig zijn bij het oplossen van een aantal zaken in het analytisch laboratorium is. Het kan worden gebruikt om verbindingen die anders ondetecteerbaar de reeks detectoren verkrijgbaar zijn ^1,2 detecteren, verhogen het signaal van het doelanalyt, waarbij ondergrenzen van detectie en kwantificering ^3-5 toelaat of selectief derivatiseren een doelanalyt ter voorkoming matrixeffecten ^6. Algemeen gebruikte PCD reacties omvatten de omzetting van amines, zoals aminozuren, met ortho-phthaladehyde ^7-9, ninhydrin....

Protocol

Let op: Raadpleeg de veiligheidsinformatiebladen (VIB) voor alle materialen en reagentia voor het gebruik (dwz, VIB voor methanol). Zorg ervoor dat het gebruik van alle nodige veiligheidsvoorschriften bij de omgang met oplosmiddelen en High Performance Liquid Chromatography (HPLC) eluent. Zorgen voor het juiste gebruik van technische controles van HPLC, analytische balans en de detector instrumentatie, en zorgen voor het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, volledige lengte broek en dichte schoenen).

Opmerking: Dit protocol beschrijft 3 methoden reactie stroming post-column derivatisering (RF-PCD) technieken, elk ....

Results

De eerste PCD methode die werd aangepast voor RF-PCD is de derivatisering van antioxidanten met de 2,2-difenyl-1-picrylhydrazil groep (DPPH ^{•) 24.} Deze reactie werd geïntroduceerd door Koleva et al. ²⁵ en is op grote schaal gebruikt sinds. De detectie is gebaseerd op de ontkleuring van de DPPH ^• radicalen in aanwezigheid van reactieve zuurstofspecies, vandaar de aanwezigheid van antioxidanten leidt tot een daling van de absorptie waargenomen. De DPPH ^• reac.......

Discussion

RF-PCD maakt het efficiënt mengen van het derivatiseringsreagens het effluent na de kolom HPLC zonder gebruik van reactie spoelen, het minimaliseren van de effecten van bandverbreding en verbetering scheidend vermogen. RF-PCD werkwijzen hebben ook aangetoond verbeterd signaal respons met betrekking tot detectie methode. Camenzuli et al. ²⁸ was de eerste die de toepassing van reactie stroom kolommen met DPPH ^• voor de detectie van ROS in een espresso monster melden. Hun studie omvatte de an.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPLC instrument	Agilent	1290 Series HPLC
Additional Pump(s) for derivatization system	Shimadzu	LC-20A
RF colum			Non-commercial
PEEK tubing	Sigma Aldrich	Z227307
Column stoppers			Provided with column
PEEK tube cutter	Sigma Aldrich	Z290882
Analytical Scale Balance			4-point analytical balance
Stop watch			Non-Scientific equiptment
Eluent collection vials			Any Small vial with a flat bottom will do, e.g., HPLC vials
HPLC Vials			Will depend on instrument used
Vessels for mobile phase and derivatization solution(s)	Sigma Aldrich	Z232211
General Laboratory glassware			Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method.
Methanol	Sigma Aldrich	34860
DPPH	Sigma Aldrich	D9132
Ammonium Acetate	Sigma Aldrich	17836
Ammonia	Sigma Aldrich	320145	Corrosive
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998
Fluorescamine	Sigma Aldrich	F9015
4-aminoantipyrene	Acros Organics BVBA	AC103151000
Potassium ferricyanide	AnalaR	B10204-30