Tracking en kwantificeren van ontwikkelingsprocessen in C. elegans Het gebruik van open-source tools

Summary

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

Abstract

Kwantitatief vastleggen van ontwikkelingsprocessen is cruciaal om mechanistische modellen en belangrijke ontlenen aan mutante fenotypes te identificeren en te beschrijven. Hier protocollen worden gepresenteerd voor het bereiden van embryo's en volwassen C. elegans dieren voor de korte en lange termijn time-lapse microscopie en methoden voor het opsporen en kwantificeren van ontwikkelingsprocessen. De gepresenteerde methoden zijn allemaal gebaseerd op C. elegans stammen beschikbaar in het Caenorhabditis Genetics Center en open source software die gemakkelijk kan worden geïmplementeerd in elk laboratorium onafhankelijk van de gebruikte microscoop. Een reconstructie van een 3D-cel-vorm model met behulp van het modelleren software IMOD, handmatig bijhouden van fluorescent-gelabelde subcellulaire structuren met behulp van de multi-purpose beeldanalyse programma Endrov, en een analyse van de corticale contractie stroom met behulp PIVlab (tijdsopgeloste Digital Particle Image Velocimetry tool voor MATLAB) getoond. Er wordt besproken hoe deze werkwijzen ook kunnen worden ingezet to kwantitatief vast te leggen andere ontwikkelingsprocessen in verschillende modellen, bijvoorbeeld, mobiele tracking en lineage tracing, het bijhouden van blaasje flow.

Introduction

Met de gestage verbetering van de fluorescerende eiwitten, genoom engineering, lichtmicroscopie en computer soft- en hardware, is het nu mogelijk om de ontwikkeling van vele modelorganismen opnemen met ongekende ruimtelijke en temporele resolutie. Dit stelt onderzoekers in staat om vragen die niet eerder konden worden aangepakt vragen of bekende ontwikkelingsprocessen opnieuw in om te zoeken naar het hoofd gezien aspecten. Deze vooruitgang is op het gebied van kwantitatieve ontwikkelingsbiologie, die gericht is op het transformeren van kwalitatieve, informele modellen in kwantitatieve modellen door een grondige metingen en statistische analyses aangewakkerd.

Protocol

1. Bereiding van C. elegans embryo's voor Time-lapse Microscopie met Microbeads

1. Transfer gravid volwassen wormen met behulp van een worm pick (platina draad) in een daling van de M9 buffer en schoon uit bacteriën door eerst krachtig roeren en vervolgens de overdracht van elke worm aan een aangrenzende druppel M9 met behulp van een wimpers gemonteerd op een tandenstoker / pipetpunt of gebruik een puntig glas capillair.
2. Verdun de dispersie bevattende 20 urn diameter polystyreen kralen 10-voudig in M9-buffer (1 L M9 buffer bevat 3 g KH _{2PO 4,} 6 g Na ₂ HPO _4, 5 g NaCl, en na autoclaafbehandelin....

Results

Door het gebruik van protocollen 2, 3, en 4, time-lapse beeldvorming van de geslachtsklieren in wild-type C. elegans volwassenen wordt uitgevoerd (stam OD58 (UNC-119 (ED3) III; ltIs38 [pAA1; pie-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + unc-119 (+)]), het uitdrukken van een membraan marker uit een kiemlijn promotor ). Gericht op het begin van de gonade, wordt een 3D-model van de kiemcellen gegenereerd uit de data microscopie (figuur 2). Dit model maakt het mogelijk om veranderingen in celgrootte analyseren.......

Discussion

Door middel van het volgen object in ontwikkeling, met name de nucleaire tracking, is het mogelijk geweest om de centrale patroonvorming mechanismen van C. helderen elegans embryogenese ^1,23,24. Uitbreiding van deze strategie tot een hogere doorvoersnelheid, is onlangs onmogelijk geweest om extra patronen regels te ontdekken en voor te stellen een methode hoe patronen afleiden regels de novo ^10. Voor veel mutanten, maar de precieze patroon defecten nog onbekend. De hier b.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereo microscope	Motic/VWR	OT4005S	Stereo microscope for dissection and mounting
Polybead Polystyrene Microspheres,	Polysciences	18329	Embryo mounting
20 µm
Polybead Polystyrene Microspheres,	Polysciences	876	Adult animal mounting
0.1 µm
Microscope slides	VWR	631-0902	Adult animal mounting
Cover glass 18x18 mm	VWR	631-1331	Embryo/adult mounting
Cover glass 24x60 mm	VWR	631-1339	Embryo mounting
Scalpel	VWR	233-5455	Embryo dissection
Silicone tubing	VWR	228-1501	Tubing for mouth pipette
30 mm PTFE membrane filter	NeoLab	Jul-01	Filter for mouth pipette
Capillary tubes	VWR	621-0003	Pipette tip for mouth pipette
Vaseline	Roth	E746.1	Embryo/adult mounting
Agar	Roth	5210.5	Adult animal mounting
Potassium-di-hydrogenphosphate	Roth	P018.2	M9 buffer
Di-sodium- hydrogenphosphate	Roth	P030.2	M9 buffer
Sodium chloride	Roth	3957.1	M9 buffer
VisiScope Spinning Disc Confocal System	Visitron Systems	n/a	Confocal microscopy