-Magnetron gedreven Synthese van ijzeroxide nanopartikels voor snelle detectie van atherosclerose

Samenvatting

Microwave technologie maakt extreem snelle synthese van ijzeroxide nanodeeltjes voor atherosclerose plaque karakterisering. Het gebruik van een aminobisphosphonate in de buitenzijde van de nanodeeltjes verschaft een snelle accumulatie in de atherosclerotische gebied.

Samenvatting

Een snelle en reproduceerbare microgolven aangedreven protocol is ontwikkeld voor de synthese van neridronaat gefunctionaliseerde nanodeeltjes. Uitgaande van de synthese van hydrofobe nanodeeltjes, is onze werkwijze gebaseerd op een aanpassing van thermische decompositie werkwijze magnetron aangedreven synthese. De nieuwe methode wordt verlaging van de reactietijden in vergelijking met de traditionele procedures. Bovendien is het gebruik van de microgolf technologie verhoogt de reproduceerbaarheid van de reacties, wat belangrijk vanuit het oogpunt van klinische toepassingen. De nieuwigheid van deze ijzeroxide nanodeeltjes is de bevestiging van neridronaat. Het gebruik van dit molecuul leidt een bisfosfonaat deel naar de buitenzijde van de nanodeeltjes die Ca ²⁺ biedt bindende eigenschappen in vitro en selectieve accumulatie in vivo in de atheroma plaque. Het protocol maakt de synthese en plaquedetectie in ongeveer 3 uur sinds de eerste synthese van organic precursors. De accumulatie ervan in de atherosclerotische gebied minder dan 1 uur heeft een contrastmiddel bijzonder geschikt voor klinische toepassingen.

Inleiding

Atherosclerose is een multifactoriële chronische ontsteking van de vaatwand veroorzaakt door een gedereguleerde vetstofwisseling en een defecte ontstekingsreactie. Door de prevalentie en de economische en sociale kosten van deze en verwante hart- en vaatziekten is er een groeiende belangstelling voor het aanpakken van de pathologie nieuwe middelen, waarvan nanotechnologie is een van de meest veelbelovende. ^1-3 Er zijn echter zeer weinig voorbeelden van snelle productie en karakterisering van probes die eenvoudig te vertalen naar de kliniek ⁴ in dit protocol gebruiken we een magnetron synthese ijzeroxide nanodeeltjes voor verdere functionalisering met een bisfosfonaat en in vivo detectie van atherosclerose bij ApoE ^{-. / -.} muizen in 1 uur ⁵ ijzeroxide nanodeeltjes (IONP) zijn een bekend nanomaterialen en het gebruik ervan als contrastmiddel voor magnetische resonantie beeldvorming (MRI) is vastgesteld voor de detectie van verschillende ziektens in de afgelopen jaren. ^6-8

Magnetron synthese (MWS), maakt het synthetiseren nanodeeltjes in extreem korte tijden met een hoge reproduceerbaarheid en verbeterde opbrengsten. ^9,10 In ons protocol krijgen we IONP met plaque targeting mogelijkheden in drie stappen. De uiteindelijke een is de bevestiging van een aminobisphosphonate, neridronaat, dat is de sleutel in onze strategie als gevolg van de calcium-bindende eigenschappen. Door de natuurlijke analoge pyrofosfaat (PPi), neridronaat is gebruikt bij de behandeling van osteogenesis imperfecta (OI) en de ziekte van Paget (VOB) vanwege hun hoge affiniteit voor botmineraal. ^11-13

De drie stappen van het protocol zijn samengevat in schema 1. Stappen één en twee zijn uitgevoerd met behulp van microgolf-technologie. Eerste stap bieden oliezuur zuur beklede ijzeroxide nanodeeltjes (OA-IONP) door een modificatie van gepubliceerde werkwijzen. ¹⁴ Het protocol is een aanpassing aan de synthese van de magnetron traional thermische ontleding synthese. ^15,16 Een mengsel dat Fe (acac) _3, oliezuur, oleylamine en 1,2-dodecaandiol opgelost in benzylalcohol en onderworpen aan twee verwarmingsprocessen. Zuivering wordt uitgevoerd wassen met EtOH en het verzamelen van de deeltjes met een Nd-Fe-B magneet om de overmaat oppervlakteactieve stoffen in het supernatant te elimineren. Vervolgens worden OA-IONP gestabiliseerd in _CHCI3. Zoals verwacht, als gevolg van de zeer snelle verwarming, verwachte resultaten toonden aan dat de nanodeeltjes gesynthetiseerd door microgolf kleiner qua kern (3,7 ± 0,8 nm) en hydrodynamische grootte (7,5 nm) ten opzichte van traditionele thermische ontleding; echter nanodeeltjes presenteren nog steeds een uitstekende kristalliniteit.

De tweede stap bestaat uit een directe chemische modificatie van de dubbele band, aanwezig in het oliezuur, met een sterk oxidatiemiddel zoals _KMnO4, de oorspronkelijke methodologie in onze groep werd aangepast voor MW omstandigheden.17 Een eerste fase vormt de complexen tussen MnO ₄ ^- en een dubbele binding. Vervolgens werd een tweede trap onder zure omstandigheden, produceren de splitsing van het oliezuur molecule die azelaïnezuur-IONP. Na deze twee fasen van 9 min elk, wordt het monster gezuiverd, eerst wassen met _NaHSO3 1% om de overmaat MnO ₄ verminderen ^- tot MnO ₂ en daarna met NaOH 1% om het zuur te neutraliseren.

Na de zuiveringsstap worden Azelaic-IONP gestabiliseerd in 10 mM fosfaatbuffer pH = 7,2. Deze buffer is de beste omgeving voor de colloïdale stabiliteit van de deeltjes vergelijkbaar met wat in de oorspronkelijke, thermische reactie. ¹⁸ Het gebruik van een magnetron voor de directe oxidatie van de dubbele binding in OA-IONP is een goed voorbeeld van de voordelen het gebruik van deze technologie in de synthese van nanodeeltjes. Met de klassieke methode de reactie duurt 24 uur, het gebruik van microgolf verminderen de Reactiop tijd 18 min. Bovendien is de microgolf-driven protocol toont een uitstekende reproduceerbaarheid geven nanodeeltjes met 30 ± 5 nm van hydrodynamische grootte na 4 herhalingen. Afgezien van de verandering van de hydrodynamische grootte, de zeta potentiaal is een goede parameter om snel de succes van de reactie. Door de aanwezigheid van de nieuwe carboxylgroepen in azelaïnezuur-IONP, de waarde van de zeta potentiaal ongeveer -44 mV, vergelijkbaar met de door de thermische benadering waarde.

Voor de bevestiging van neridronaat om Azelaic-IONP, wordt traditioneel EDC / sulfo-NHS vervoeging gebruikt. ¹⁹ Deze synthetische benadering is goed gevestigd sinds het gebruik van een geactiveerd carboxylaat met de sulfo-NHS verzekert colloïdale stabiliteit tijdens de reactie. Na eliminatie van fosfaatbuffer de reactie met neridronaat uitgevoerd in 1 mM HEPES buffer (pH ~ 7). De reactie maakt neridronaat-IONP met een hydrodynamische grootte van 40 ± 4 nm in een smalle grootteverdeling distribution en -24,1 mV van Zeta-potentiaal.

De procedure wordt beschreven voor snelle synthese van IONP in vivo visualisatie van atherosclerotische plaque, hoewel de uitvoerbaarheid van de werkwijze maakt de bevestiging van elke peptide / antilichaam met vrije aminen, onder dezelfde omstandigheden, voor verschillende doeleinden binnen _T2-gewogen MRI contrastmiddel veld.

Protocol

1. Bereiding van reagentia

1. Bereid 1 mM HEPES buffer oplossing van 23,8 mg HEPES in 100 ml gedestilleerd water. Breng de pH op 7.
2. Bereid 10% _NaHSO3 oplossen van 10 g _NaHSO3 in 100 ml gedestilleerd water. Roer het mengsel gedurende 15 min.
3. Bereid NaOH oplossing oplossen van 1 g natriumhydroxide in 100 ml water. Roer gedurende 10 minuten.
4. Bereid 10 mM fosfaatbuffer oplossen van 600 mg NaH ₂ PO ₄ in 1 liter water. Voeg voorzichtig 0,34 ml fosforzuur en roer gedurende 30 min. Breng de pH op 2,9 (acceptatie range 2,7-3,0).
5. Bereid 10 mM fosfaatbuffer oplossen van 269 mg NaH ₂ PO ₄ en 1,09 g Na ₂ HPO ₄ gedistilleerd water tot een volume van 1 L. een pH 7,2.

2. Synthese oliezuur gecoate nanodeeltjes (OA-IONP)

1. In een magnetron aangepaste fles toe te voegen 0,5 g Fe (acac) _3, 1,4 ml Oleic zuur, 0,6 ml oleylamine en 1,19 g 1,2-hexadodecanediol. Voeg 10 ml van fenylether voorzichtig door de kolf muur met behulp van een gegradueerde pipet.
2. Introduceer de kolf in de magnetron reactor en start de magnetron protocol.
   Opmerking: Microwave software kan kiezen de magnitude van verschillende parameters zoals temperatuur, druk, roersnelheid, kracht en reactietijd. Bovendien heeft de mogelijkheid om drie verschillende stadia van hetzelfde protocol waarmee afstembare synthese laden. Zodra de geladen synthetische protocol begint, magnetron verwarmt het monster zo snel mogelijk (ramping proces) en houdt deze gedurende de gekozen reactietijd (draaiend proces). Verkiezing van de macht bepaalt de tijd van ramping.
3. Laad een dynamische studie in de magnetron. Het protocol bestaat uit drie fasen:
   1. Fase 1: stel de temperatuur tot 60 ° C, de tijd 2 minuten, druk 250 psi en 150 W vermogen. Roer de snelheid moet in hoge positie en maximaal vermogen in op.
   2. Herte 2: stel de temperatuur tot 200 ° C, tijd 20 min, de druk van 250 psi en 300 W vermogen. Roer de snelheid moet in hoge positie en maximaal vermogen in op.
   3. Fase 3: stel de temperatuur tot 250 ° C, 10 min, de druk van 250 psi en 300 W vermogen. Roer de snelheid moet in hoge positie en maximaal vermogen in op.
4. Nadat het protocol laat de kolf afkoelen op kamertemperatuur.
   OPMERKING: Cooling down proces kan worden gedaan met of zonder gasstroom. In beide gevallen bieden dezelfde resultaten. Aggregaten verschijnen in de roerstaaf en in de wand van de kolf, was het met EtOH en zet het op de kolf.
5. Breng het reactiemengsel tot een Erlenmeyer met een glazen pipet en voeg 10 ml EtOH 98%. Zet een Nd-Nb-B magneet onder de kolf, wacht 5 minuten en verwijder het supernatant met een glazen pipet.
6. Voeg 10 ml EtOH, ultrasone trillingen het monster bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten en 40 kHz, zet het monster op de magneet en het supernatant te elimineren. Herhaal deze stap op least driemaal.
7. Dispergeren oliezuur nanodeeltjes in 30 ml _CHCI3 en ultrasone trillingen op 40 kHz gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Controleer de hydrodynamische grootte in de Zetasizer volgens instructies van de fabrikant. Doe 0,5 ml OA-IONP in het glas cuvet en voeg 0,5 ml _CHCI3. Acceptatie range 7-10 nm, uitgedrukt als Z-gemiddelde grootte in intensiteit.
   LET OP: OA-IONP kan goed worden verspreid in hexaan.

3. Synthese van Azelaic Acid Nanodeeltjes (Azelaic Acid-IONP)

1. Los op 44,3 mg _KMnO4 en 150,4 mg BTACl in een mengsel van _{H2O: CHCl3} (3: 2 ml). Voeg de resulterende oplossing een 5 ml aliquot van OA-IONP in de magnetron aangepaste kolf.
2. Start de magnetron protocol voor Azelaic acid-IONP. Ingestelde temperatuur bij 105 ° C, tijd 9 min, druk 250 psi en vermogen bij 300 W. Breng 10 ml fosfaatbuffer pH = 2,9 in de kolf en herhaal de magnetron protocol. Na afkoeling stap, herstellen van de nanodeeltjesmet behulp van een magneet en het supernatant te elimineren.
3. Voeg 5 ml 10% _NaHSO3 een Erlenmeyer kolf, ultrasone trillingen bij 40 kHz voor 2 min bij 25 ° C, laat de deeltjes met behulp van een magneet en het supernatant te elimineren. (De stap wordt 2 keer herhaald.) Was de nanodeeltjes drie keer met 1% NaOH en tenslotte opnieuw dispergeren in 5 ml fosfaatbuffer pH = 7,2.
4. Controleer de hydrodynamische grootte en zetapotentiaal. Doe 0,7 ml Azelaic-IONP in de wegwerp gevouwen capillaire cel en plaats het op de Zetasizer.
   LET OP: Acceptatie bereik voor maat 25-35 nm, uitgedrukt als Z-gemiddelde grootte in intensiteit. Acceptatie bereik voor Z-Kans op -45 ± 5 mV. Grotere nanodeeltjes (~ 70 nm) zijn verkrijgbaar met fosfaatbuffer pH> 7 plaats pH = 2,9 (ref Chem Eur J 2008).

4. Synthese van neridronaat Nanodeeltjes (neridronaat-IONP)

1. Voeg 12 mg EDC en 15 mg sulfo-NHS in een centrifuge met 2 ml aliquot van Azelaic-IONP. Leggenhet mengsel in een vortex bij kamertemperatuur 35 min.
2. Plaats een magneet onder de centrifuge om de nanodeeltjes destabiliseren, zuig de supernatant en was de deeltjes met 1,5 ml HEPES 1 mM pH = 7 buffer. (Herhaal deze stap tweemaal.) Daarna voeg 5 mg neridronaat en schud in een vortex gedurende 2 uur.
3. Aparte nanodeeltjes met een magneet en wassen (3 x 2 ml) met 1 mM HEPES pH = 7 buffer. Tenslotte dispergeren neridronaat-IONP in 2 ml 1 mM HEPES pH = 7 buffer.
4. Controleer de hydrodynamische grootte en zetapotentiaal. Doe 0,7 ml neridronaat-IONP in de wegwerp gevouwen capillaire cel en plaats het op de Zetasizer (zie apparatuur setup).
   LET OP: Acceptatie bereik voor maat 40-45 nm, uitgedrukt als Z-gemiddelde grootte in intensiteit. Acceptatie bereik voor Z-Kans op -20 ± 5 mV.

5. In vivo detectie van atheroma Plaque in ApoE ^{- / -} muizen door middel van MRI

1. Voorbereiding van de MRI Acquisition
   LET OP: Verschillende extra systemen voor dierproeven nodig zijn. Zo zal het nodig hebben:
   1. Gebruik de juiste apparatuur om de dieren te verdoven.
   2. Verkrijgen van een close-circuit circulerend warm watersysteem met een externe warme lucht de temperatuur van het dier stabiel.
      Opmerking: In dit geval registreert de MRI compatibel registratiesysteem en poortsysteem de temperatuur van het dier in de magneet MRI.
   3. Controleer de buitentemperatuur in de nabijheid van het dier, het lichaam (rectale thermometer) temperatuur van het dier, de ademhaling sensor onder het lichaam van het dier nabij de thorax via een geïntegreerde interface in de MRI console.
2. MRI Experiment
   1. Verdoven de dieren verdampt isofluraan (2% voor inductie gedurende twee of drie minuten en 1-1,5% voor onderhoud tijdens de MRI-experiment) met 100% zuurstof lijn.
   2. Plaats het dier in het midden van de magneet met behulp van een profiel acquisitie.
   3. Na stap 5.2.2 Stem de RF spoel 300 MHz (7 T) resonantiefrequentie en overeenkomen met de karakteristieke impedantie van de spoel 50 Ohm voor een optimale signaalontvangst.
      LET OP: Let op de externe bedrading en de aansluitingen naar het meetsysteem via de adapter / splitter aan elk deel van de zender spoel individueel (in ons geval was het een kwadratuur spoel).
   4. Na het instellen van en het afstemmen van de spoelen, steek de rollen in de scanner.
   5. Voor RF puls kalibratie (vorm en lengte) en het centrum frequentie afstelling zowel pulse kalibratie en het centrum van de frequentie handmatig. handmatig uitvoeren van de 90 ° puls kalibratie, grof vulplaten (zie hieronder), centrale frequentie en de ontvanger winst aanpassingen.
   6. Voer juiste positie met behulp van een gradiënt echo (FLASH of GRE) localizer scan (3 vliegtuig scout overname: axiale, coronale en sagittale, ook wel TriPilot.
   7. Voer de magneet vulplaten het magneetveld homogeniteit optimaliseren heter van de magneet. handmatig uit deze stap (zie 5.2.3) via één of enkele puls FID sequentie en pas de eerste en tweede opdrachten vulplaatjes of automatisch vulplaten sequentie in het systeem
      LET OP: Een goed opgevuld magnetisch veld is gemakkelijk te herkennen en gemeten door de T2 * (zoals groter hoe beter) of smal FWHM van de spectra.
3. MRI Data Acquisition van de Plaque ⁵
   1. Injecteer 100 pi (1 mg [Fe] ml ^-1) van neridronaat nanodeeltjes intraveneus in de ader van de staart en het verwerven van beelden 1 uur na de injectie. Laad de parameters voor MRI verkrijging van atherosclerotische plaque kijken naar de abdominale aorta (renale vertakking).
   2. Zet meerschijven, 10-20 plakjes interleave modus om artefacten te minimaliseren.
   3. Verwerven hoge-resolutie snelle spinecho T1-gewogen MRI in coronale of axiale weergave met de volgende parameters: FOV 60 x 30 mm (coronale), 30 x 30 mm (axiaal), slice dikte 0,8 mm (met de kleine gradiëntspoel configuration kan worden teruggebracht tot 0,6 mm), 400 msec TR, 8 msec TE, 256 x 256 acquisitie en reconstructie matrijsgegevens, 6 (grote gradient) om 8 (kleine gradiënt) signaal gemiddelden voor 5-8 minuten gemiddelde acquisitietijden.
      OPMERKING: TE is bijzonder kritisch en de aanwezigheid van bloed signaal en stroom en chemische verschuiving artefacten die de toepassingen beperken. In dat geval vloeien ongevoelig snelle spinecho T2-IR kan helpen om artefacten en het verkrijgen van aanvullende gegevens in exact dezelfde lokatie verminderen kan helpen om de plaque te karakteriseren. Bovendien kan een voorverzadiging puls gebruikt om het vetweefsel rond de arteriële wand een betere afbakening van de buitengrens van de muur en chemische verschuiving artefact reductie verminderen.
   4. Breng de beelden met behulp van een standaard formaat, zoals Dicom en uitzicht in de juiste software (bijv Osirix Imaging Software of amide: Medical Imaging Gegevens Examiner) ^5. Kwantificeren van de contrast-effect handmatig afgrenzing van de vessel gebied, wanddikte, lumen gebied en plaque last ^5.

Resultaten

In dit protocol wordt de synthese van drie verschillende IONP beschreven. Uitgaande van hydrofobe OA-IONP worden waterige stabiele nanodeeltjes verkregen met behulp van magnetron-driven synthese. Alle nanodeeltjes gepresenteerd ultrakleine hydrodynamische grootte (Dh <50 nm) in een zeer smalle grootteverdeling (figuur 1c). Het gebruik van microgolf-technologie maakt ultra-kleine nanodeeltjes in termen van de kern maten. Sinds magnetron produceren een snelle verwarming...

Discussie

Ijzeroxide nanodeeltjes (IONP) zijn één van de belangrijkste nanomaterialen en het is gebruikt voor verschillende toepassingen van lang geleden. Het gebruik van deze materialen als contrastmiddel voor magnetische resonantie beeldvorming (MRI) is een gevestigde gebied. Echter, de routes van synthese duren vaak meerdere tijd en de instelling is ingewikkeld. Door drastisch verminderen reactietijden en reproduceerbaarheid verhoogt het gebruik van microgolf-gestuurde synthese lijkt een goed alternatief voor de produktie van ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Microwave Explorer/Discover Hybrid-12	CEM Corporation, USA		Elke magnetron voor chemische synthese kan worden gebruikt
Disposable PD-10 ontzoutingskolommen	GE Healthcare life sciences	17-0851-01	Elke grootte-uitsluitingskolom zal werken
Amicon®Ultra-0.5 ml	Merck Millipore Ltd
Gekalibreerd pH-meter	SI analytics	285105127
Neodymium magneet	Aiman Gz	ND010B
Vortex Genius 3	IKA	3340000
ZetaSizer Nano ZS	Malvern Instruments
Standaard (macro) cel Optisch glas	Labbox	11718
ZetaSizer nanoserie beschikbare gevouwen capillaire cellen DTS1070	Malvern
Bruker Minispec mq60	Bruker