Methodenartikel

Stamcelachtige

7.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53474

⸱

2 februari 2016

1Institut Curie, 2UMR 3387, CNRS, 3PSL Research University, 4Université Paris-Sud

In dit artikel

Samenvatting

In Xenopus embryo's, cellen van het dak van de blastocoel zijn pluripotent en kunnen worden geprogrammeerd om verschillende weefsels te genereren. Hier beschrijven we protocollen om uitstrijkjes van de amfibische blastocoel-dak als een assaysysteem te gebruiken om belangrijke in vivo en in vitro kenmerken van vroege neurale ontwikkeling te onderzoeken.

Samenvatting

Het begrijpen van de genetische programma's die ten grondslag liggen aan neurale ontwikkeling is een belangrijk doel van de ontwikkelings- en stamcelbiologie. In de amfibieënblastula zijn cellen van het dak van de blastocoel pluripotent. Deze cellen kunnen worden geïsoleerd en geprogrammeerd om verschillende weefsels te genereren door manipulatie van genexpressie of inductie door morfogenen. In dit manuscript worden protocollen beschreven voor het gebruik van Xenopus laevis blastocoel dak explantaten als een assay-systeem om belangrijke in vivo en in vitro kenmerken van vroege neurale ontwikkeling te onderzoeken. Deze protocollen maken het mogelijk om de acquisitie van cellijnen, celmigratiegedrag en cel-autonome en niet-autonome eigenschappen te onderzoeken. De blastocoel dak explantaten kunnen worden gekweekt in een serumvrij gedefinieerd medium en geënt in gasthereMBRYO's. Deze transplantatie in een embryo maakt het mogelijk om de langetermijnlijntoewijzing, de inductieve eigenschappen en het gedrag van geëntte cellen in vivo te onderzoeken. Deze assays kunnen worden gebruikt om moleculaire mechanismen, cellulaire processen en gen-regulerende netwerken te onderzoeken die ten grondslag liggen aan neurale ontwikkeling. In de context van regeneratieve geneeskunde bieden deze assays een manier om neurale afgeleide celtypen in vitro te genereren die kunnen worden gebruikt in geneesmiddelenscreening.

Inleiding

Het gewervelde zenuwstelsel Uit de neurale plaat als een homogene laag van neuro-epitheelcellen. Begrijpen hoe ontwikkelingsprogramma's worden geïnduceerd, gecodeerd, en vastgesteld tijdens regionalisering van de neurale plaat is, op dit moment, een belangrijke doelstelling in de ontwikkelingsbiologie. In vergelijking met andere systemen, de experimenteel vatbaar Xenopus embryo is een model van keuze voor het analyseren van vroege stappen van neurale ontwikkeling 1,2. Het is gemakkelijk om grote aantallen embryo's te verkrijgen en buitenlandse ontwikkeling geeft toegang tot de eerste stappen van neurulatie 3. Veel tools beschikbaar om experimenteel te manipuleren Xenopus laevis (X. laevis) embryonale ontwikkeling. Micro-injectie van mRNA of morfolino (MO), waaronder induceerbare MO, samen met biochemische en farmacologische gereedschappen, maakt gecontroleerde gain of function (GOF) en functieverlies (LOF) en de specifieke wijziging van signaaltransductiewegen 4,5. De blastocoel dak ectoderm, rond de animale pool van een blastula of een zeer vroeg gastrula embryo en aangeduid als het "Animal Cap (AC), een bron van pluripotente cellen die kunnen worden geprogrammeerd door manipulatie van genexpressie vóór explantaten bereiding. In dit manuscript zijn gedetailleerde protocollen te gebruiken X. laevis AC explantaten testen in vitro en in vivo moleculaire mechanismen en cellulaire mechanismen van neurale ontwikkeling.

Een techniek wordt gepresenteerd, waardoor fijne observatie van genexpressie patronen in een Xenopus kikkervisje neurale buis, een eerste stap in de identificatie van het lot bepalen cues. Overwegende dat de waarneming van de flat-gemonteerde weefsels vaak wordt gebruikt in de studie van kippenembryo's 6, het is niet goed beschreven in Xenopus. Manipulatie van genexpressie door het injecteren van synthetisch mRNA of MO in de blastomeren van 2 of 4 cellig stadium embryo maakt programmering van ACexplantaten 4. Bijvoorbeeld remming van Bone Morphogenetic Protein (BMP) route door expressie van het anti-BMP factor Noggin, geeft een neuraal identiteit AC cellen 3. Het protocol wordt gedetailleerd beschreven voor het uitvoeren van lokale en tijd gecontroleerde blootstelling van AC explantaten om extrinsieke signalen via direct contact met een anionenuitwisselingshars kraal. Tenslotte wordt een techniek beschreven voor het testen ontwikkelings kenmerken van neurale voorlopercellen in vivo transplantatie van gemengde explantaten bereid uit verschillende geprogrammeerde cellen gedissocieerd en opnieuw verbonden.

De kikker embryo is een krachtig model voor de vroege gewervelde neurale ontwikkeling te bestuderen. Het combineren van manipulatie van genexpressie in vitro culturen explanteren levert belangrijke informatie bij de studie van neuroepithelium regionalisering, proliferatie en morfogenese 7-12. De programmering van AC explantaten toegelaten ontwikkeling van een functionele hart ex vivo 13,14. Het gebruikvan explantaat enten 15 geleid tot de identificatie van de minimale transcriptionele switch induceren van de neurale differentiatie programma 16. De zona limitans intrathalamica (ZLI) is een signalering centrum dat sonic hedgehog (Shh) om de groei en regionalisering van de caudale voorhersenen controle afscheidt. Bij voortdurende blootstelling aan Shh, neuro-cellen co-expressie van de drie transcriptiefactor genen - Barh-achtige homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (otx2) en Iroquois-3 (irx3) - verwerven van twee kenmerken van de ZLI compartiment: de bevoegdheid om uitdrukken shh, en de mogelijkheid om te scheiden van de voorste neurale plaat cellen. Als modelsysteem, zal de inductie van een ZLI lot in neuro-epitheelcellen gepresenteerd 8.

Deze protocollen zijn gericht op het leveren van eenvoudige, goedkope en efficiënte hulpmiddelen voor ontwikkelingsstoornissen biologen en andere onderzoekers om de fundamentele mec verkennenhanisms van belangrijke neurale cel gedrag. Deze protocollen zijn zeer veelzijdig en laat het onderzoek van een groot aantal extrinsieke en intrinsieke neurale vastberadenheid cues. Het staat op lange termijn in vivo analyse van de neurale lineage inzet, inductieve interacties en cel gedrag.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Experimenten voldoen aan de nationale en Europese regelgeving inzake de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt en met de internationaal vastgelegde beginselen van vervanging, vermindering en verfijning.

1. Flat-montage van Xenopus laevis Kikkervisjes voorste neurale buis Na Whole-mount in situ hybridisatie

  1. Verkrijgen X. laevis embryo's volgens standaard procedures 4 en te verouderen tot ze neurula fase 26 en ouder (volgens ontwikkelings tabel 17 Nieuwkoop en Faber bereikt.
  2. Fix X. laevis kikkervisjes door incuberen in een oplossing van 4% paraformaldehyde (PFA). Rock en draai de embryo's in een 2 ml glazen flesje, 1 om 1,5 uur bij kamertemperatuur fase 26 om 38 embryo, 2 uur bij kamertemperatuur embryo's in latere stadia stadium.
    LET OP: PFA is giftig bij contact en een verdacht carcinogeen. Er wordt gemanipuleerd in een zuurkast.
    OPMERKING: One X. laevis kroost isgewoonlijk vastgesteld in een 2 ml glazen flesje maar groter glazen ampul kan worden gebruikt.
  3. Was de embryo's in hetzelfde flesje behulp 1x PBS met 0,1% Tween (PBT), 3 min bij kamertemperatuur, tweemaal.
    OPMERKING: Tenzij anders geef de PBS gebruikt is met of zonder calcium en magnesium.
  4. Dehydrateer de embryo's in 100% methanol (MeOH) gedurende ten minste 12 uur bij KT in hetzelfde flesje. Wijzig de MeOH 100% ten minste tweemaal onder de kap met een kunststof micropipet.
    OPMERKING: De MeOH draait iets geel als lipiden opgelost. Let op de MeOH is giftig bij inademing en moet onder een kap worden gemanipuleerd.
  5. Hydrateren de embryo's met dezelfde flacon via een gegradeerde reeks MeOH baden: MeOH 75% in PBS, 50% MeOH in PBS, 25% MeOH in PBS, PBS tweemaal elk bad 5-10 min bij RT. De MeOH oplossingen worden gewijzigd onder de kap met een kunststof micropipet.
  6. Met behulp van een plastic pipet het embryo te worden ontleed in een 60 mm petrischaal gevuld tot de top met PBT. Met behulp van twee fijne tang zorgogen volledig verwijderen door één fijne tang tussen de ogen en de neurale buis op het niveau van de optische steel. Maak de ogen van de neurale buis. Introduceren zorgvuldig de tang onder de ectoderm bovenop de neurale buis. Met zorg, trek het ectoderm vanaf achter het hoofd en gooi het.
  7. Voer een dubbele of enkele ISH met behulp van digoxigenine-gemerkte of fluoresceïne-gelabelde probes zoals eerder beschreven 18,19.
  8. Na de ISH overdracht van de embryo's in een nieuwe 60 mm petrischaal gevuld tot de top met PBT met een plastic pipet.
  9. Met behulp van fijne tang voorzichtig los van de neurale buis van de rest van het embryo. In dit stadium, de voorste neurale buis loskomt van het achterste neurale buis. Zorgvuldig losmaken overige delen van het ectoderm ligt over de neurale buis, de notochord die losjes is vastgemaakt onder de neurale buis, de otic blaasjes en overige delen van het mesoderm. Zorg ervoor dat de neurale buis is verstoken van eventuele bijlagenin dit stadium.
    LET OP: Om schade aan de neurale buis te voorkomen voeren alle neurale buis / embryo transfer met een plastic overdracht pipet of een micropipet, indien nodig met een tip snee aan zijn einde. De diameter van het uiteinde is aangepast aan de grootte van de neurale buis.
  10. Breng de ontleed neurale buis (zie noot stap 1.9) in een 1,5 ml buis gevuld met 50% glycerol verdund in PBS. Wacht tot de neurale buisjes zijn gedaald tot beneden de glycerol oplossing, gewoonlijk O / N bij 4 ° C.
  11. Verwijder de oplossing van 50% glycerol / PBS met behulp van een micropipet P1000 en voeg dezelfde 1,5 ml tube oplossing van 90% glycerol / PBS met behulp van een micropipet P1000. Wacht tot de neurale buisjes vallen op de bodem van de 90% glycerol / PBS oplossing, gewoonlijk O / N bij 4 ° C.
    NB: voor de lange termijn opslag, gebruik dan 90% glycerol / PBS plus antibiotica om bacteriële ontwikkeling te voorkomen.
  12. Breng de neurale buisjes op een glasplaat of een microscoopglaasje met een plastic pipet overdracht.
  13. Dissekte de neurale buis langs de dorsale en ventrale middellijnen met wolfraam naalden. Tijdens deze stap de neurale buisjes worden bewaard in 90% glycerol / PBS.
  14. Monteer de beide zijden van de neurale buis in 90% glycerol / PBS behulp verstevigingsringen bedekt met een dekglaasje.
  15. Bevestig de dekglaasjes met vernis en houden bij 4 ° C.

2. Animal Cap Explantaten Inductie behulp anionuitwisselingshars Beads

  1. Breng 100 pi van anionen uitwisselingshars bolletjes in een 2 ml buisje met een micropipet P1000. Was de korrels ten minste vijf opeenvolgende keer met steriel gedistilleerd water. Laat de parels bezinken op de bodem van de buis en vervang het steriel gedestilleerd water met behulp van een micropipet P1000. Raak de kralen niet aanraken.
  2. Laat de parels inwerken O / N in een 2 ml buisje gevuld met steriel gedestilleerd water met runderserumalbumine (BSA) (10 mg / ml) bij 4 ° C.
  3. Twee uur voor het verzamelen van de ACS, plaats de helft van de parels in een nieuwe 1,5 mlbuis met behulp van een micropipet P1000. Vervang het steriel gedestilleerd water met 500 ui van het medium dat het molecuul worden getest op de mogelijke inductieve of bekend een bepaald lot induceren. Houd de andere helft van de korrels, zoals ze worden gebruikt als een negatieve controle.
  4. Incubeer de kralen bij 4 ° C gedurende ten minste 2 uur.
  5. Het uitvoeren van alle verdere stappen onder de stereomicroscoop en het uitvoeren van alle AC-overdracht met een micropipet.
  6. Transfer of vroege blastula gastrula embryo's in PBS met calcium en magnesium aangevuld met 0,2% BSA met een plastic pipet overdracht.
    OPMERKING: Embryo's ontwikkelen bij 12 ° C bereik blastula en gastrula stadia 20 tot 24 uur.
  7. Verwijder de embryo's vitellinemembraan behulp van een tang zoals eerder beschreven 20. Bevestig de embryo met een tang. Neem de vitelline-membraan met de zijde van de andere tang. Houdt het membraan langzaam afschilferen het embryo. Voer deze procedure op het ventraal (plantaardige) zijde van het embryo. Heeft het dier kant van het embryo niet beschadigen.
  8. Isoleer kleine ACs zoals eerder beschreven 21. Het dier paal is de embryo's gepigmenteerde deel. Met behulp van fijne tang uitgesneden een klein vierkant van weefsel van het dier paal. De AC weefsel bevat alleen de ectodermale cellen. Zorg ervoor dat het weefsel van uniforme dikte. Zo niet, verwijder de AC uit de analyse.
  9. Plaats elke AC in een Terasaki multiwell platen in 0,5x gewijzigd Barth's Saline (MBS) 4. Plaats de AC in de put met zijn gepigmenteerde dier naar beneden in contact met de ronde bodem van het putje.
    Opmerking coating pipetten met 0,1% BSA-oplossing voorkomt de adhesie van kleine stukjes weefsel lijm aan de kunststof.
  10. Plaats een kraal op elke dop met een micropipet P20. Indien nodig, gebruik dan een tang zorgvuldig plaats de kraal in het midden van de dop.
    OPMERKING: Bij gedrenkt in een geconditioneerd medium worden de korrels gekleurd in roze. Selecteer de meest coLored kralen.
  11. Incubeer bij kamertemperatuur (18-22 ° C) gedurende 6 uur zonder de Terasaki multi-putjesplaat. De kraal kleeft aan het AC in minder dan 2 uur.
  12. Plaats de Terasaki multiwell plaat op de top van papers geweekt in water. Bedek de plaat met een plastic container.
    LET OP: Deze 'vochtigheidskamer' voorkomt vroegtijdige verdamping van de putten.
  13. Cultuur de ACS in 0,5 x MBS of 3/4 NAM (zie stap 4,1) in de vochtige kamer bij 15-20 ° C totdat het embryo sibling het juiste stadium om het effect van factor testen bereikt.
  14. Bevestig de ACS gedurende 1 uur in vers bereide 4% PFA. Dehydrateer de ACS in 100% MeOH zoals eerder beschreven (stap 1,4).

3. Animal Cap celdissociatie en Reaggregation Voordat enten in een Xenopus laevis neurula

  1. Coat petrischalen (60 mm) of 12 wells platen met 3% agarose in steriel water of PBS zonder calcium en magnesium. Voeg genoeg agarose aan de b dekkenottom van de petrischaal of de put. Vooraf verwarmen de platen bij kamertemperatuur (18-22 ° C). Eventueel opgeslagen de platen paar dagen bij 4 ° C om uitdroging te voorkomen.
  2. Bereid calciumvrije Holtfreter's zout (60 mM NaCl, 0,7 mM KCI, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA (A-7888 Sigma pH 7,6)) en Holtfreter's zout (60 mM NaCl, 0,7 mM KCI, 0,9 mM CaCl2, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA pH 7,6) 5. Opmerking: de oplossing van CaCl 2 kan niet worden geautoclaveerd.
  3. Vul het-agarose gecoate goed aan de top met calcium vrije Holtfreter's zoutoplossing.
  4. Bereid blastula of vroeg gastrula embryo hun ACs geïsoleerd zoals eerder beschreven (stap 2,5 tot 2,7).
  5. Isoleer ten minste 15 of tot 30, kleine ACs 21. Met behulp van fijne tang uitgesneden een klein vierkant van weefsel van het dier paal. De AC weefsel bevat ectodermale cellen en dus een uniforme dikte. Zo niet, verwijder de AC uit de analyse.
    NB: Het dier pool is de embryo's gepigmenteerde deel.
  6. Breng de ACS in een agarose-gecoate goed gevuld tot de top met calcium vrije Holtfreter's zoutoplossing. Plaats de AC's met hun gepigmenteerde kant naar boven.
    OPMERKING: De dissociatie proces begint snel in calciumvrij Holtfreter's zoutoplossing.
  7. Wacht een paar minuten voor de cellen om te beginnen dissociatie. Acht dit door de uitsplitsing van de weefsels. Met behulp van fijne tang, scheid de gepigmenteerde laag van de rest van de AC en gooi ze met een micropipet P20. Volledige cel dissociatie werkwijze geeft afscheiding van cellen van elkaar.
    LET OP: Een of twee gepigmenteerde lagen kunnen binnen de re-geaggregeerde explant worden overgelaten aan de visualisatie te helpen tijdens het enten.
  8. Centreer de cellen met cirkelvormige bewegingen van de plaat. Met behulp van een micropipet P1000 verwijder voorzichtig zoveel medium mogelijk. Wees niet naar de cellen te raken.
  9. Voeg 1 ml Holtfreter's zoutoplossing met calcium om de put. Breng de los ACSin een 1,5 ml buis.
    OPMERKING: 2 ml buisjes kunnen niet worden gebruikt vanwege hun ronde bodem.
  10. Pellet de cellen door centrifugatie, 5 min bij een maximale snelheid van 2000 rpm een ​​bank centrifuge (500 xg). Verwijder voorzichtig de bovenstaande vloeistof met een micropipet P1000.
  11. Naar de gedissocieerde cellen 20 pl Holtfreter's zoutoplossing met calcium (60 mM NaCl, 0,7 mM KCI, 0,9 mM CaCl2, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA (Sigma A-7888 pH 7,6) 5.
  12. Houd de gedissocieerde ACS, 3-6 uur bij kamertemperatuur (18-22 ° C).
    Opmerking: Dit is voldoende tijd voor de cellen opnieuw aggregaat. De re-aggregatie zichtbaar als cellen vormen een kleine bal op de bodem van de buis.
  13. Maak de explantaat voorzichtig van de bodem van de buis door toevoeging van 1 ml 0,5 x MBS of 1 ml 3/4 NAM (zie stap 4,1). Breng de explant in een niet-gecoate plaat met een plastic overdracht pipet.
  14. Stadium de explantaten met hun controle broers en zussen. Voor de lange termijn cultuur gebruik antibiotica: kanamycin (50 ug / ml), ampicilline (50 ug / ml) en gentamycine (50 ug / ml).

4. enten van Animal Caps Explantaten in de neurale plaat van X. laevis Embryo

  1. Bereid 3/4 NAM (110 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO4, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCO 3, 0,2 x PBS, 50 ug / ml gentamycine). Houd niet langer dan 1 week voor de dissectie en bewaar bij 4 ° C. Oudere NAM kan worden toegepast voor het bereiden-agarose gecoate dissectie gerechten (hieronder).
  2. Jas petrischalen (60 mm) met 3% agarose in 3/4 NAM waarin kleine gaten zijn gemaakt met behulp van een siliconen mal, of de cover van een tafel tennis racket.
    OPMERKING: De agarose bedekt de bodem van de petrischaal. Laat wat ruimte zodat de petrischaal te vullen met 3/4 NAM. Alternatief maken dissectie gerechten met niet-drogende boetseerklei. Binnen de klei, knijp de embryo iets tijdens de dissectie procedure. Graven kleine gaatjes in deagarose met afgeronde tang Deze 'dissectie gerecht' helpt om de embryo's te houden tijdens de dissectie procedure.
  3. Verzamel dissectie instrumenten: plastic overdracht pipetten, een 'wenkbrauw mes' (gemaakt met wenkbrauw haren ingebed in paraffine op het puntje van een glas Pasteur pipet) 22, twee fijne dissectie pincet, P1000 micropipet en tips, een stereosmicroscope met vergroting 8-40X, een heldere lichtbron met optische vezel gidsen. Houd alle ontleden gereedschappen schoon; Na elk experiment, spoel ze tweemaal met gedestilleerd water, eenmaal met 100% ethanol en laten drogen. Uit de buurt van stof en indien nodig autoclaaf het metaal ontleden gereedschappen.
  4. Laat het los en opnieuw samengevoegd ACS (protocol 3), en hun broers en zussen X. laevis embryo's te ontwikkelen tot ze stadium 13 (neurula) te bereiken volgens ontwikkelingsstoornissen tabel 17 Nieuwkoop en Faber. Voor transplantatie binnen de neurale plaat fase 13 tot 15 embryo stadium worden gebruikt.
  5. Het uitvoeren van alledaaropvolgende stappen onder de stereomicroscoop.
  6. Met behulp van een plastic overdracht pipet de embryo's in PBS met calcium en magnesium aangevuld met 0,2% BSA. Verwijder de embryo's vitellinemembraan zoals eerder beschreven 20. Bevestig de embryo met een tang. Neem de vitelline-membraan met de zijde van de andere tang. Houdt het membraan stevig langzaam afschilferen het embryo.
    LET OP: Doe deze procedure aan de ventrale (plantaardige) zijde van het embryo. Beschadig de embryo's neurale plaat. Wanneer embryo's werden beschadigd tijdens de vitelline membraan verwijderingsstap, breng de embryo's in een 60 mm petrischaal die 3/4 NAM met een plastic pipet overdracht en wacht 15 minuten, voldoende tijd voor het genezingsproces plaatsvindt.
  7. Vul de dissectie schotel naar de top met verse 3/4 NAM.
  8. Met behulp van een plastic overdracht pipet de embryo zonder hun vitelline membraan in de dissectie schaal. Plaats de embryo dorsale zijde omhoog inde putjes. Tijdens de overdracht niet toestaan ​​dat de embryo in contact met de lucht-vloeistof-interface sinds X. te gaan laevis worden gelyseerd door oppervlaktespanning.
  9. Breng de AC explant te worden geënt in de dissectie plaat met behulp van een plastic overdracht pipet of een micropipet P1000. Zodra de pipet is in de vloeistof, zodat de explantaten om langzaam te zinken door de zwaartekracht, of duw heel voorzichtig.
  10. Handhaving van de embryo's met afgeronde tang. Met de wenkbrauw mes een insnijding in de neurale plaat waar u van plan om stuk van uw explant enten.
    Opmerking: In stap 14 het voorste buigen van de neurale plaat gebruikt als landmark kan zijn, markeert het diencephalon gebied (figuur 4).
  11. Knip een klein stukje neuroepithelium, met afgeronde pincet en een wenkbrauw mes. Snijd een klein stukje van de explant met de wenkbrauw mes.
    Opmerking: Het stukje explantaat moet ongeveer dezelfde grootte en vorm als de neuroepithelium geablateerd gebied.
  12. Plaats het stuk explant in de neuroepithelium incisie met behulp van de wenkbrauw mes en fijne tang. Zorg ervoor dat de explant snel hecht aan het embryo.
  13. U kunt ook plaats een stuk glas dekglaasje op de geënte embryo om het transplantaat op zijn plaats te houden. Om dit te doen, snijd een goed glas dekglaasje in zeer kleine stukjes met behulp van grof tang. Zorg ervoor dat de grootte is ongeveer 1,5 mm 2. Dompel de stukjes in een petrischaal met 3/4 NAM of PBS behulp van een tang. Kies een stuk glas groter is dan het embryo om beschadiging te voorkomen. Het embryo zal een klein beetje afgevlakt.
  14. Wacht minstens 30 minuten zonder te bewegen, of alleen verplaatsen de dissectie plaat voorzichtig. Laat het embryo te herstellen gedurende 30 minuten tot 2 uur en verwijder voorzichtig het dekglaasje indien nodig. Pipet zorgvuldig de geënte embryo's in een schone schotel gevuld met 3/4 NAM, met behulp van de plastic overdracht pipet.
    OPMERKING: Geënte embryo vaak bacteriën of schimmels besmetting ontwikkelen. Voor de lange termijn cULTUUR gebruik antibiotica kanamycine (50 gg / ml), ampicilline (50 ug / ml) en gentamycine (50 ug / ml).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Gebaseerd op morfologische overwegingen bij diverse soorten, embryologische manipulaties en het expressiepatroon van regulerende genen een conceptueel model houdt de neurale plaat wordt verdeeld in transversale en longitudinale segmenten die een ontwikkelingsstoornis raster genereren afzonderlijke histogenic velden definiëren. In de neurale plaat, de primordia van de voorhersenen, middenhersenen, achterhersenen en het ruggenmerg zijn allemaal al langs de antero-posterior (AP) as vastgest...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Neurale ontwikkeling georkestreerd door een complex samenspel van cellulaire ontwikkelingsprogramma's en signalen van de omringende weefsels (besproken in 3,31,32). Hier beschrijven we een set protocollen die gebruikt kunnen worden in X. laevis embryo's extrinsieke en intrinsieke factoren betrokken bij neurale lot bepalen en neurale morfogenese in vitro en in vivo onderzoeken. Deze protocollen kunnen worden gebruikt als zodanig op X. tropicalis embryo echter X. ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteur bedankt Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef en Anne Hélène Monsoro-Burq voor hun hulp en advies, en de Animal Facility van het Institut Curie. De auteur bedankt Paul Johnson voor zijn redactiewerk aan het manuscript. Dit werk werd ondersteund door het Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS UMR8197, INSERM U1024) en door subsidies van de "Association pour la Recherche sur le Cancer" (ARC 4972 en ARC 5115; FRC DOC20120605233 en LABEX Memolife) en de Fondation Pierre Gilles de Gennes (FPGG0039).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ParaformaldehydeVWR 20909.290Toxisch
anion exchange resin beadsBiorad140- 1231
Bovine Serum Albumin SIGMAA-7888Voor cultuur van dierlijke cappH 7.6
Gentamycine GIBCO15751-045 antibioticum
Bovine Serum AlbuminSIGMAA7906 voor bereiding van bead

Referenties

  1. Nieuwkoop, P. D. IIB, Pattern formation in the developing central nervous system (CNS) of the amphibians and birds (English). Proceedings of the Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen. 94, 121-127 (1991).
  2. Nieuwkoop, P. D. The neural induction process; its morphogenetic aspects. Int J Dev Biol. 43, 615-623 (1999).
  3. Harland, R. Neural induction. Curr Opin Genet Dev. 10, 357-362 (2000).
  4. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
  5. Hoppler, S., Vize, P. D. Xenopus protocols : post-genomic approaches. Hoppler, S., Vize, P. D. , Humana Press; Springer. New York. (2012).
  6. Franklin Hughes, W., La Velle, A. The effects of early tectal lesions on development in the retinal gonglion cell layer of chick embryos. J Comp Neurol. 163, 265-283 (1975).
  7. Theveneau, E., Mayor, R. Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays. Methods Mol Biol. 769, 449-460 (2011).
  8. Juraver-Geslin, H. A., Gomez-Skarmeta, J. L., Durand, B. C. The conserved barH-like homeobox-2 gene barhl2 acts downstream of orthodentricle-2 and together with iroquois-3 in establishment of the caudal forebrain signaling center induced by Sonic Hedgehog. Dev Biol. 396, 107-120 (2014).
  9. Green, J. B., New, H. V., Smith, J. C. Responses of embryonic Xenopus cells to activin and FGF are separated by multiple dose thresholds and correspond to distinct axes of the mesoderm. Cell. 71, 731-739 (1992).
  10. Wallingford, J. B., Ewald, A. J., Harland, R. M., Fraser, S. E. Calcium signaling during convergent extension in Xenopus. Curr Biol. 11, 652-661 (2001).
  11. Kiecker, C., Niehrs, C. A morphogen gradient of Wnt/beta-catenin signalling regulates anteroposterior neural patterning in Xenopus. DEVELOPMENT. 128, 4189-4201 (2001).
  12. Wilson, P. A., Hemmati-Brivanlou, A. Induction of epidermis and inhibition of neural fate by Bmp-4. Nature. 376, 331-333 (1995).
  13. Afouda, B. A., Hoppler, S. Xenopus explants as an experimental model system for studying heart development. Trends in cardiovascular medicine. 19, 220-226 (2009).
  14. Afouda, B. A. Stem-cell-like embryonic explants to study cardiac development. Methods Mol Biol. 917, 515-523 (2012).
  15. Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of Xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2014).
  16. Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 5528-5533 (2013).
  17. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).
  18. Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
  19. Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
  20. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Removing the Vitelline Membrane from Xenopus laevis Embryos. CSH protocols. , (2007).
  21. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Animal Cap Isolation from Xenopus laevis. CSH protocols. , (2007).
  22. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH protocols. , (2007).
  23. Wilson, S. W., Houart, C. Review: Early Steps in the Development of the Forebrain. Developmental Cell. 6, 167-181 (2004).
  24. Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
  25. Heasman, J. Patterning the early Xenopus embryo. Development. 133, 1205-1217 (2006).
  26. Rubenstein, J. L., Martinez, S., Shimamura, K., Puelles, L. The embryonic vertebrate forebrain: the prosomeric model. Science. 266, 578-580 (1994).
  27. Puelles, L., Rubenstein, J. L. R. Forebrain gene expression domains and the evolving prosomeric model. Trends in Neurosciences. 26, 469-476 (2003).
  28. Martinez-Ferre, A., Martinez, S. Molecular regionalization of the diencephalon. Frontiers In Neuroscience. 6, 73-73 (2012).
  29. Scholpp, S., Lumsden, A. Review: Building a bridal chamber: development of the thalamus. Trends in Neurosciences. 33, 373-380 (2010).
  30. Coffman, C., Harris, W., Kintner, C. Xotch, the Xenopus homolog of Drosophila notch. Science. 249, 1438-1441 (1990).
  31. Pera, E. M., Acosta, H., Gouignard, N., Climent, M., Arregi, I. Active signals, gradient formation and regional specificity in neural induction. Exp Cell Res. 321, 25-31 (2014).
  32. Stern, C. D. Neural induction: old problem, new findings, yet more questions. Development. 132, 2007-2021 (2005).
  33. Juraver-Geslin, H. A., Ausseil, J. J., Wassef, M., Durand, B. C. Barhl2 limits growth of the diencephalic primordium through Caspase3 inhibition of beta-catenin activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2288-2293 (2011).
  34. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Dissociation and Reaggregation of Xenopus laevis Animal Caps. CSH protocols. , (2007).
  35. Harland, R. M., Grainger, R. M. Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics. Trends Genet. 27, 507-515 (2011).
  36. Beccari, L., Marco-Ferreres, R., Bovolenta, P. The logic of gene regulatory networks in early vertebrate forebrain patterning. Mech Dev. 130, 95-111 (2013).
  37. Pani, A. M., et al. Ancient deuterostome origins of vertebrate brain signalling centres. Nature. 483, 289-294 (2012).
  38. Holland, L. Z., et al. Evolution of bilaterian central nervous systems: a single origin? Evodevo. 4, 27(2013).
  39. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease models & mechanisms. 6, 1057-1065 (2013).
  40. Sasai, Y., Ogushi, M., Nagase, T., Ando, S. Bridging the gap from frog research to human therapy: a tale of neural differentiation in Xenopus animal caps and human pluripotent cells. Development, growth & differentiation. 50, s47-s55 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Blastocoel dakexplantatendierpolexplantatenassay voor neurale ontwikkelinganalyse van lotbepalingcelmigratiegedragcelautonome eigenschappenniet autonome eigenschappenin vitro cultuurin vivo transplantatie

Gerelateerde artikelen