Bouw van modulaire Hydrogel Sheets voor micropatterned Macro-schaal 3D Cellular Architecture

Samenvatting

We beschrijven de fabricage van microgepatternde hydrogelvellen met behulp van een eenvoudig proces, dat kan worden geassembleerd en gemanipuleerd in een zelfstandige vorm. Met behulp van deze modulaire hydrogelvellen kan een eenvoudig macro-geschaald 3D-celkweeksysteem worden gegenereerd met een gecontroleerde cellulaire micro-omgeving.

Samenvatting

Hydrogels kunnen worden gevormd op micro-schaal met behulp microfluidic of micropatterning technologieën om een in vivo-achtige drie-dimensionale (3D) weefsel geometrie te verschaffen. Het resulterende 3D-hydrogel gebaseerde cellulaire constructen geïntroduceerd als alternatief voor dierproeven voor geavanceerde biologische studies, farmacologische testen en orgaantransplantatie toepassingen. Hoewel hydrogel gebaseerde deeltjes en vezels gemakkelijk kunnen worden vervaardigd, is het moeilijk om ze te manipuleren voor weefselreconstructie. In deze video, beschrijven we een fabricage methode voor micropatterned alginaat hydrogel lakens, samen met hun vergadering van een macro-schaal 3D celcultuur met een gecontroleerde cellulaire micro-omgeving vormen. Met een nevel vorm van calcium geleermiddel, worden dunne platen hydrogel gemakkelijk gemaakt met een dikte in het bereik van 100 - 200 urn en met nauwkeurige micropatterns. Cellen kunnen daarna worden gekweekt met geometrische leiding van de hydrogel vellenvrijstaande omstandigheden. Bovendien kan de hydrogel vellen gemakkelijk worden gemanipuleerd met een micropipet met een end-cut tip en in meerlagige structuren kan worden samengesteld door ze te stapelen met een patroon polydimethylsiloxaan (PDMS) frame. Deze modulaire hydrogel platen, die kunnen worden vervaardigd met behulp van een gemakkelijk proces hebben potentiële toepassingen in vitro assays geneesmiddelen en biologische studies, met inbegrip van functionele studies van micro- en macrostructuur en weefselreconstructie.

Inleiding

Hydrogels zijn bijzonder veelbelovend biomaterialen en waarschijnlijk belangrijke in basisbiologie, farmacologische assays en geneesmiddel. ¹ Biofabrication van hydrogel gebaseerde cellulaire constructen is voorgesteld om het gebruik van dierproeven verminderen, ^2,3 vervangt transplanteren weefsels, ⁴ en verbeteren celgebaseerde proeven. ^5,6 waterbevattende (hydro-) visco-elastische stoffen (gels) maken een groot aantal cellen worden ingekapseld en in een steigerstructuur de 3D ​​cellulaire micro-omgeving regelen. In combinatie met de begeleiding van microfluïdische of micropatterning technologieën, kan de geometrie van de hydrogel constructen nauwkeurig worden gecontroleerd op het celniveau. Tot op heden diverse vormen van hydrogels, waaronder deeltjes, ^{7 - 9} vezels, ^{10 - 12} en vellen, ^{13 - 15} zijn gebruikt als bouweenheden in bottom-up voorkomendpijn aan de fabricage van macro-schaal meercellige architecturen.

Zowel hydrogel gebaseerde deeltjes en vezels zijn gemakkelijk en snel vervaardigd voor toepassingen microschaal cellulaire omgevingen met fluïde besturing via microfluïdische inrichtingen. Aangezien de basiseenheden van gekweekt weefsel, zou ingewikkeld om te herschikken en hun volume macroschaal constructen vergroten. ¹⁶ Het is moeilijker om macro-schaal constructen bereiken dan micronafmetingen basismodules te produceren. Velvormige eenheden van hydrogel gebaseerde constructen kunnen worden gebruikt om het volume van de steigers te verhogen via een eenvoudige montage. Als gevolg daarvan, gestapelde lagen van hydrogel platen bieden niet alleen een volumetrische toename ook een geometrische extensie in een 3D-ruimte.

We hebben eerder vermeld een werkwijze voor het vervaardigen micropatterned hydrogel sheets, ^{13 - 15} met hun constructie in multi-layEred cellulaire architecturen. De techniek maakt complex micropatterning en modulaire opbouw van cellulaire constructen via een stapeling proces van meerlaagse structuren. Door de fabricage van gestapelde modulaire hydrogel platen, die micropatterned kan een 3D celcultuur systeem met gecontroleerde macroschaal cellulaire micromilieu gerealiseerd. Deze video protocol beschrijft een eenvoudige maar krachtige fabricagemethode die gebruikt kan worden om modulaire hydrogel vellen construeren op basis van de menselijke lever carcinoom cellijn (HepG2). We tonen hierin eenvoudige manipulatie van deze gevormde modulaire hydrogel platen en hun montage in een multi-gelaagde structuur.

Protocol

1. Voorbereiding van de micropatterned Vormen en Hydrogelen

1. Het gewenste micro-schaalpatronen via SU-8 op het oppervlak van een siliciumwafel via een standaard tweestaps fotolithografietechniek ^15,17 PDMS mallen voor het gieten. De getoonde voorbeeld wordt een lever melkklier-achtige mesh patroon (Figuur 1).
2. Weeg PDMS en een hardingsmiddel oplossing met een verhouding van 1: 5 (dat wil zeggen 12,5 g PDMS en 2,5 g hardingsmiddel).
3. Meng 15 g van de oplossing grondig ontgas de bellen in een vacuümkamer, en vervolgens verspreid de gemengde oplossing op een micropatterned oppervlak van de siliciumwafel gelijkmatig bij een folie gegoten schotel.
4. Plaats de siliciumwafel op een 65 ° C verwarmde plaat gedurende 90 minuten op een vlak oppervlak aan het PDMS harden.
5. Verwijder de uitgeharde PDMS van het gietstuk schaal en de siliciumwafel.
6. Snijd de randen van de PDMS en plaats het op een 100-mm diameter petrischaal metde micropatterned kant naar boven.
7. Was de micropatterned uitgeharde PDMS op de petrischaal met behulp van 70% ethanol en gedestilleerd water voor de primaire sterilisatie. Vervolgens volledig gedurende 10 min drogen in een oven bij 65 ° C.
8. Los op en meng O / N 3 g poedervormig ionogene oppervlakteactieve stof in 100 ml gedestilleerd water, waardoor een 3% (w / v) bekledingsoplossing.
9. Plaats de micropatterned PDMS mallen in een plasma schoonmaken en hen 1 min (85 W, 0,73 mbar) op een hydrofiel oppervlak te creëren, de toevoeging van waterige vloeistoffen te vergemakkelijken. Vervolgens laag het oppervlak van het PDMS met 100 ml surfactansoplossing ten minste 3 uur (ORO / N) met een laboratorium rocker.
10. Was de surfactantoplossing van de PDMS mallen en volledig drogen in een oven bij 65 ° C gedurende 10 min. Vervolgens steriliseren elk micropatterned vorm door blootstelling aan ultraviolet (UV) straling dan 30 min.

2. Bereid de celsuspensie in een Hydrogel Precursor

1. Naarbereiden hydrogel voorloper los 0,1 g natriumalginaat poeder in 10 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), waardoor een 1% (w / v) alginaat precursor. Om het poeder volledig op te lossen, broeden en meng ze O / N.
2. Filtreer de oplossing door een 0,22 urn filter verbonden met een injectiespuit 1 ml.
3. Cultuur van de HepG2-cellen in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine op een gebruikelijke weefselkweekschaal tot 70% - 80% confluentie in een 5% _CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C .
4. Was de cellen eenmaal met behulp PBS, en vervolgens trypsinize ze door toevoegen van 1 ml 0,05% trypsine-EDTA gedurende 4 min in een 5% _CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C. Centrifugeer de geoogst uit de kweekschaal bij 250 xg gedurende 3 min en resuspendeer gebruik 1 ml PBS na verwijdering van de supernatant cellen.
5. Tel het aantal losse cellen verdeeld in PBS met gebruikmaking van een automatische celoogsterteller.
6. Na centrifugatie bij 250 xg gedurende 3 min en PBS verwijderen, voeg 1 ml van de 1% (w / v) natriumalginaat oplossing voor de resterende celpellet en meng zachtjes met pipetteren. De uiteindelijke zaaidichtheid van de cellen moet 5 x 10 ⁶ - 10 ⁷ cellen / ml. Incubeer de cellen / hydrogel suspensie in een 5% _CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C.

3. Laden en verknoping van Cell / Hydrogel Suspension

1. Ontbinden 1,47 g calciumchloride uitdrogen in 100 ml van _DDH 2 O tot een verknopingsreagens produceren (dat wil zeggen, 100 mM _CaCl2 · 2 H _{2 O} in _DDH 2 O).
2. Spoel de binnenkant van een luchtbevochtiger met ultrasone transducer met 70% ethanol, en vul het met 200 ml verknopingsreagens. De luchtbevochtiger is 110 mm breed, 300 mm lang en 170 mm diep (dat wil zeggen, 110 mm x 300 mm x 170 mm (B x H x D)).
3. Plaats de micropatterned PDMSmatrijzen in een plasma schoner en reinigen gedurende 1 minuut bij 85 W met een hydrofiel oppervlak te creëren.
4. Geleidelijk belasting 7,2 gl van de goed gemengde cellen / hydrogel suspensie aan de rand van de micropatroon in de matrijs. De getoonde voorbeeld wordt een lever melkklier-achtige mesh patroon (Figuur 1). Het volume van de suspensie hangt af van het topografisch patroon.
5. Gelering van de cel / hydrogel vering te bereiken, zet de luchtbevochtiger en controleer of de luchtbevochtiger produceert een nevel van de verknopingsreagens. Spuit de verknopingsreagens op de hydrogel voorloper van 5 min, die het topografisch oppervlak van het PDMS vormen binnen een bereik van 5 cm.
   Opmerking: Afstanden langer en korter dan 5 cm zouden onvolledig en ongelijk geleren, respectievelijk. Controleer of de bevochtiger een sproei snelheid van 250 ml / uur, produceren 20 ml nevel van de verknopingsreagens in 5 min.
6. Na de cross-linking proces, schakelt de bevochtiger en vul de PDMS molds met PBS.

4. Behandeling van Single Modulaire Hydrogel Sheets

1. Losmaken elke geharde hydrogel vel uit de micropatterned mallen via pipetteren PBS zachtjes rond de hydrogel plaat met behulp van een 200 ul pipet tip.
2. Pick-up elke zwevende hydrogel plaat met behulp van een end-cut 1000 ul pipetpunt einde. Elke lever lobule-achtige mesh hydrogel plaat heeft afmetingen van 8 mm x 8,7 mm, en wees 100-200 micrometer dik.
3. Breng een enkele laag van de hydrogel plaat in 1 ml DMEM in een 12-well plaat, en de cultuur van de cellen in vitro in een zwevende wijze met de hydrogel construct als componenteenheid in de 12-well plaat gedurende een week in een 5 _% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C. Wisselen het kweekmedium om de andere dag.

5. Montage van multi-layered Hydrogel Sheets

1. Herhaal stap 1,1 tot 1,5 op een PDMS frame met afmetingen van 18 mm x 18 mm x 4 mm produceren (B xH x D), en die 170 urn hoog zuil structuren ten het onderoppervlak. Gebruik 42 g van het mengsel van PDMS en verharder, met dezelfde verhouding als in stap 1,2. Plaats een gespecialiseerde polycarbonaat schimmel op het silicium wafer voor het PDMS frame een interieur frame met afmetingen van 8 mm x 9 mm x 2 mm te maken (B x H x D).
2. Steriliseer de PDMS frame 180 um porie nylon filterpapier ondergedompeld in gedestilleerd water en pincet in een autoclaaf gedurende 15 minuten bij 121 ° C.
3. Plaats het gesteriliseerde PDMS lijst op een kwart van een stuk nylon filterpapier (met een diameter van 5 cm) in een 60-mm petrischaal.
4. Breng een modulair vel hydrogel in het inwendige van het frame met behulp van een PDMS-end cut 1000 ul pipetpunt. De hydrogel platen gebruikt voor montage worden gekweekt gedurende ten minste één dag nadat ze werden gefabriceerd.
5. Lijn de rand van elke modulaire hydrogel blad met de PDMS frame met behulp van een lege 200 ul pipetpunt.
6. Herhaal de stappen 5.4 en 5.5 met behulp van modulaire hydrogel sheets om een ​​stapel te vormen 4 - 6 lagen.
7. Verwijder het kweekmedium door uitstromende het door de zuil structuren op de bodem van de PDMS frame. Voeg vervolgens 2 pl alginaatoplossing (2% w / v) bij een hoek van de meerlaagse constructie.
8. Spuit een nevel van de verknoping reagens voor 30 sec op de meerlaagse constructie aan de randen van elke laag vast met die van een andere. Gebruik 2 ml nevel van de verknopingsreagens (bij sproeisnelheid van 250 ml / uur).
9. Spoel de multi-layered constructie voorzichtig met 400 ul DMEM en verwijder het PDMS frame met behulp van een pincet.
10. Maak de multi-layered constructie van de filter papier door het voorzichtig af te vegen met een mobiele tillift na de toevoeging van 4 ml DMEM.
11. Breng de meerlaags construct een 6-wells plaat met 3 ml DMEM gebruik filtreerpapier en cultuur van de cellen in vitro op een zwevende wijze, met de hydrogel construct alseen meerschalige cellulaire scaffold in de 6-well plaat gedurende een week in een 5% _CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C. Wisselen het kweekmedium om de andere dag.

Resultaten

We hebben de fabricage en manipulatie van vrijstaande cellulaire hydrogel bladen beschreven. Zoals getoond in figuur 1, we gefabriceerd micropatterned PDMS mallen en celbevattende hydrogel werd op het hydrofiele oppervlak van deze schimmels en geladen verknoopt met een luchtbevochtiger tot een aërosol nevel geleermiddel genereren. Na afgifte uit de mallen, HepG2-cellen werden gekweekt in vrijstaande hydrogel platen met verschillende patronen (figuur 2). ...

Discussie

Dit protocol verschaft een eenvoudige werkwijze voor het vervaardigen van modulaire hydrogel vellen en assembleren 3D cellulaire scaffolds vormen.

Om duidelijke patroon structuren alginaat construeren korte tijd moeten we een verknoping proces dat voldoende stijf structuren kunnen creëren om het complex micropatterns houden van de matrijs, alsmede de levensvatbaarheid en metabolisme cellen behouden identificeren. We hebben een verknoping proces ontwikkeld met een sol-gel overgang naar een ve...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning Corporation	000000000001064291
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	Poederachtige niet-ionogene oppervlakteactieve stof
Alginic acid sodium salt, low viscosity	Alfa Aesar	B25266
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902
Ultrasonic humidifier	MediHeim	MH-2800	Gemodificeerd apparaat, Maximale verstuikingssnelheid: 250 ml/uur
Nylon net filter hydrofilic, 180 μm	EMD Millipore	NY8H04700
Polycarbonate mold			Aangepaste mal voor het maken van een PDMS frame patroon