Melk Collection in de rat met behulp van capillaire buizen en Schatting van melk vetgehalte Creamatocrit

Samenvatting

Melk is een primaire voedingsbron voor de pasgeborene. Analyse van melkcomponenten kan inzicht geven in maternale factoren die de gezondheid van het nageslacht beïnvloeden. Dit protocol beschrijft een handmatige methode voor het verzamelen van melkmonsters van de lacterende rat, die vervolgens kunnen worden gebruikt voor verdere downstream-analyse.

Samenvatting

Melk, als enige voedingsbron voor het pasgeboren zoogdier, levert de nodige voedingsstoffen en energie voor de groei en ontwikkeling van het nageslacht. Het bevat ook een groot aantal bioactieve verbindingen die de ontwikkeling van de pasgeborene sterk beïnvloeden. De analyse van melkcomponenten zal helpen bij het verhelderen van belangrijke factoren die het metabolisme en de gezondheid van de moeder koppelen aan de groei en ontwikkeling van het nageslacht. De laboratoriumrat vertegenwoordigt een populair modelorganisme voor moederstudies, en rattenmelk kan worden gebruikt om het effect van verschillende fysiologische, voedings- en farmacologische interventies van de moeder op melkcomponenten te onderzoeken, wat vervolgens de gezondheid van het nageslacht kan beïnvloeden. Hier wordt een eenvoudige methode beschreven voor het handmatig verzamelen van melk van de lacterende rat die door één onderzoeker kan worden uitgevoerd, geen gespecialiseerde vacuüm- of zuigapparatuur vereist en voldoende melk levert voor latere downstream-analyse. Er wordt ook een methode gepresenteerd voor het schatten van het vetgehalte van melk door het meten van het percentage room in het melkmonster, bekend als de creamatocriet. Deze methoden kunnen uiteindelijk worden gebruikt om inzicht in moeder-kindgezondheid te vergroten en om moederlijke factoren te verhelderen die betrokken zijn bij de juiste groei en ontwikkeling van het nageslacht.

Inleiding

Melk is de enige bron van voeding voor pasgeboren zoogdieren, het verstrekken van energie en voedingsstoffen voor de baby groei en ontwikkeling ^1,2. Terwijl melk bestaat voornamelijk uit cellen, lipiden en eiwitten ^1, bevat het ook een overvloed van bioactieve verbindingen die vroege leven ontwikkeling van nageslacht waaronder enzymen, koolhydraten, hormonen, antilichamen, groeifactoren, cytokines, exosomes, microvesicles en kleine RNA dergelijke moduleren als microRNA ^1,2. De fundamentele rol van de moedermelk in de oprichting van de nakomelingen het immuunsysteem en de gezondheid van de darmen ^3, in combinatie met het bewijs dat borstgevoede baby's zijn minder vatbaar voor ziekten ^2, benadrukt het belang van de identificatie van de bestanddelen van melk in verband met de ziekte van processen in het begin van het leven en de moleculaire mechanismen die betrokken zijn in hun acties. De ontwikkeling van rat is een populair model voor het onderzoeken van het effect van verschillende voedings-, fysiologische en chemische interventies vroege-life ontwikkeling ^4. De analyse van de rat melk kan daarom bieden nieuwe inzicht in de moeder en nakomelingen gezondheid.

De huidige wetenschappelijke vooruitgang bieden nu meer mogelijkheden voor diepgaand onderzoek naar de effecten van specifieke melkbestanddelen op gezondheid en ziekte. Zo heeft sequentiebepaling melk bacteriële profielen hun rol toegelicht begin darmflora van de baby darm ^5, hebben massaspectrometrie analyse melk oligosacchariden inzicht gegeven in de wijziging van melk oligosaccharide profielen via maternale voeding ⁶ en diepe sequencing van microRNA uitgescheiden in de vetbolletjes moedermelk belicht mogelijke rollen in gentranscriptie, het metabolisme en het immuunsysteem ^7.

Ratmodellen vertegenwoordigen een van de meest populaire modelorganismen gebruikt maternale studies ^8,9. Een voordeel is hun korte zwangerschap en borstvoeding periode, van slechts approximatEly 21 dagen elk; dus de totale tijd vanaf het begin van de zwangerschap tot borstvoeding is een korte tijdsperiode waarin waardevolle data kunnen worden gegenereerd. De grotere omvang van ratten in vergelijking met muizen in het kader van melk verzamelen, kan een significant voordeel opleveren met betrekking tot hoeveelheid melk en gemakkelijk melkinzameling; melkproductie in de muis, lijkt bijvoorbeeld afhankelijk totale lichaamsgewicht zwaardere muizen produceren meer melk ¹⁰ te zijn.

Hier wordt een algemene beschrijving voor het handmatig verzamelen van melk van zogende ratten verstrekt. Dit protocol vereist een minimale uitrusting, niet-invasief, goedkoop, en kan worden gebruikt om voldoende hoeveelheden melk te verzamelen voor verdere stroomafwaartse analyses. In het kort, is de dam verdoofd met isofluraan, melkafgifte wordt gestimuleerd door oxytocine, en de melk wordt verzameld in capillaire buisjes via handmatige uitdrukking van de melk. Tot slot, als twee belangrijke componenten van de melk zijn vet en eiwitten, een korte description schatten melkvetgehalte behulp creamatocrit afmetingen ¹¹ en kwantificeren van totale eiwitconcentratie met behulp van een standaard eiwit assay wordt gepresenteerd.

Protocol

Dit protocol werd goedgekeurd door de Universiteit van Calgary Animal Care Comite en voldeden aan de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren.

1. Afzonderlijk Dam van Offspring

1. Scheid de dam van haar nakomelingen gedurende ten minste 5 min voor het melken ^12.
   LET OP: De dam kan worden gemolken 5-6 uur na de scheiding ^1,6,13, maar perioden van scheiding langer dan 4 uur kan melksamenstelling ¹⁴ veranderen. Terwijl de scheiding tijd lijkt geen melk collectie volume ¹² invloed hebben, wordt geadviseerd dat een consequente scheiding moment van het onderzoek worden gehandhaafd. Melksamenstelling kan gedurende de lactatie ¹⁵ te veranderen, dus pogingen moeten worden ondernomen om de dag van de melk collectie consistent te houden. Maximale melkproductie wordt voorgesteld om zich voordoen op het geven van borstvoeding dag 14 ^12.
2. Met behulp van een warming kamer, zorgen voor de pups in staat zijn om de juiste lichaam temperatu behoudenopnieuw zonder de aanwezigheid van de moeder voor de duur van het melken.
   LET OP: In de studie hieronder weergegeven, melken werd uitgevoerd bij het spenen, wanneer de dammen waren ongeveer 22 weken oud en de jongen 21 dagen oud, dus geen opwarming kamer werd gebruikt.

2. Set-up en voorbereiding

1. Verzamel alle materialen die nodig zijn voor het melken procedure.
   LET OP: Alle materialen kunnen worden gevonden in de materialen en apparatuur tafel.
2. Plaats een verwarmingselement op de bank, waar melken zal plaatsvinden en betrekking hebben op de pad met een absorberend bankje onder-pad.
3. Het opzetten van de verdoving systeem. Zorg ervoor dat het systeem voldoende zuurstof en isofluraan voorafgaand aan begin. Bevestig de verdoving masker dat wordt gebruikt voor de initiële anesthesie inductie naar de machine. Plaats het masker dat wordt gebruikt voor anesthesie onderhoud omgeving indien anders dan de oorspronkelijke verdoving masker.
4. Bevestig een 25 G naald naar een 1 ml spuit voor oxytocineinjectie met behulp van aseptische techniek.
5. Zet de verwarming pad zodat moederlichaam temperatuur tijdens het melken wordt gehandhaafd. OPMERKING: Controleer de temperatuur van de verwarming pad om de pad te waarborgen niet te heet worden en brandwonden veroorzaken. Als alternatief gebruikt een warmtebron, zoals een verwarmde operatietafel, die kan worden ingesteld op een bepaalde temperatuur.

3. Verdoven de Dam behulp Isoflurane

1. Open de zuurstoftank en zet de stroom naar 1 L (1000 cc) per min. Schakel de stroom van isofluraan en ingesteld op 5%. LET OP: Vermijd directe inademing van verdoving en accumulatie van verdoving dampen te voorkomen.
2. Verdoven de dam.
3. Schakel over naar het onderhoud masker indien nodig, het plaatsen van de dam liggende op het absorberende bank pad. Bevestig verdoving door een gebrek aan pedaal reflex.
4. Verminder de stroom van isofluraan 2-3% voor het onderhoud van anesthesie. Voortdurend toezicht dam gedurende de procedure om ervoor te zorgen depression van de ademhaling niet optreedt. OPMERKING: Eenmaal onder narcose, moet de ogen van de dam worden beveiligd met behulp van een steriele oog smeermiddel om te voorkomen dat de ogen tegen uitdrogen of gekrast.

4. Oxytocine Injection

1. Zorg ervoor dat de oxytocine (20 USP eenheden / ml) is niet voorbij de vervaldatum. Ontsmet de flacon van oxytocine met een steriel alcoholdoekje / alcohol reiniging pad.
2. Met behulp van aseptische techniek, het opstellen van 2 IE (0,1 ml) van oxytocine in de spuit. Gebruik een nieuwe naald en spuit voor elke dam die zal worden gemolken.
   OPMERKING: Oxytocin doses variëren in het algemeen uit één injectie van 1 tot 5 IU ^1,6,12,16. Als alternatief kan een dosering van 4 IU / kg lichaamsgewicht worden gebruikt ^12. Een enkelvoudige dosis van 2 IE eenmaal worden herhaald wanneer moeilijkheden melken optreedt.
3. Injecteer de oxytocine intraperitoneaal. Steek de naald in de rechter kwadrant van de buik met de naald wijst naar het hoofd, schuinvan 15-30 °, ongeveer 0,5 cm diep.
4. Trek de zuiger om negatieve druk voorafgaand aan de injectie te garanderen. Als een vloeistof (bloed, urine, darminhoud, etc.) wordt opgezogen in de spuit, verwijder de naald en probeer de injectie met een nieuwe naald en spuit. Als er geen vloeistof wordt opgezogen injecteer de oxytocine en de naald en spuit gooi onmiddellijk in een biohazard container.
5. Wacht ongeveer 5-15 minuten voor de oxytocine melk teleurstelling te stimuleren.

5. Voorbereiding van de melken sites

1. Kies de sites / spenen die melk zal worden verzameld. Melk kan worden verzameld uit elke speen ^12.
2. Verwijder voorzichtig de vacht rond de spenen worden gemolken met de trimmers, zoals bont moeite met monstername kan veroorzaken door wicking van de melk. Wees lief - de huid rond de spenen is uiterst gevoelig en kunnen droog zijn en als zodanig is gevoelig voor krassen en scheuren.
3. Sterilisatie van de speen iis niet noodzakelijk, maar eventueel reinigen van de speen met lauw water na de vacht wordt verwijderd. Bereid ten minste twee locaties als meer dan een site nodig kunnen zijn voor de melk collectie.
   OPMERKING: Als de analyse van melk bevat microbiële profilering, kan de speen gebied sterilisatie met jodium ⁵ vereisen.

6. Melk Collection

1. Knijp de basis van de speen, handmatig het verdrijven van de melk voor de collectie.
   OPMERKING: Als de analyse van melk bevat microbiële profileren, moet de eerste paar druppels melk worden weggegooid.
2. Verzamel de druppels melk in een capillaire buis, het vullen van de capillaire buis. Capillaire buisjes die grotere hoeveelheden (bijvoorbeeld 50 pi) vergemakkelijken het proces tegemoet.
   OPMERKING: Indien moeilijk melkverzameleenheid is aangetroffen, kan een tweede dosis oxytocine toegediend. Het wordt aanbevolen de dosis niet hoger zijn dan 4 IE totaal.
3. Verdeel de melk de capillaire buis in een steriele microcentrifugebuis vanaanraken van het uiteinde van de buis die werd gebruikt om melk te trekken uit de speen naar de zijkant van de microcentrifugebuis - observeert de melk uit het capillair getrokken via capillaire werking.
   OPMERKING: 'blow out' de melk die niet in de buis wordt getrokken met behulp van een 18 G naald bevestigd aan een 1 ml spuit.
4. Voortdurend toezicht op de dam op tekenen van pijn of respiratoire depressie en stel de stroom van isofluraan dienovereenkomstig.
5. Blijven om melk te verzamelen, zoals beschreven in deze sectie totdat voldoende melk heeft verzameld voor de gekozen analyse van melk. Voor de hieronder beschreven creamatocrit en eiwit concentratie bepaling, het verzamelen van 0,25 ml melk.
   OPMERKING: Gebruik een andere melken site als melk afknapper vertraagt ​​of de gekozen locatie niet voldoende melk te verdrijven. Een maximum van ongeveer 2,5 ml melk per dier kan worden ^tot 17, of tot 0,5 ml per speen. De auteurs bevelen aan dat de totale tijd onder narcose worden beperkt tot ongeveer 45-60 min, or 45 min van het melken.
6. Verzamel melk in een microhematocrit buis creamatocrit meting van verse melkmonsters, en sluit het uiteinde van de buis met klei kit. Label de microhematocrietmethode buis met de dam-ID en rechtop op te bergen het melkmonster.
7. Wanneer het melken is voltooid, schakelt u de stroom van isofluraan en zuurstof. Verwijder het masker van de dam en blijven volgen dam tot wakker. Het wordt aanbevolen dat als niet volledig bewust, de dam moet worden op een absorberend bankje kussen geplaatst tijdens de herstelperiode, in plaats van direct op de kooi beddengoed, om te voorkomen dat het beddengoed van wordt opgezogen of krassen op de ogen van de dam tijdens het herstel.
   OPMERKING: de dam onbeheerd verlaten totdat het voldoende bewustzijn heeft herwonnen aan borstbeen recumbancy handhaven.
8. Indien geen verdere analyse nodig, melk bevriezen bij -80 ° C. Anderen hebben voorgesteld dat de melk kan worden bewaard tot 3 uur bij 4 ° C of 5 maanden bij -20 ° C ^18.

7. Creamatocrit Meting

1. Schatten het vetgehalte in de melk door het berekenen van de melk creamatocrit (het percentage van de room in het melkmonster) ^19.
   OPMERKING: Metingen met moedermelk hebben aangetoond dat zowel vers of bevroren melk kan worden gebruikt voor een creamatocrit meting echter verse melk meer sterk gecorreleerd (r = 0,92 versus r = 0,90) met lipideconcentratie ^11. Het gebruik van verse of bevroren melk voor creamatocrit metingen moeten consistent worden gehouden over de studie, als ontdooide melk wordt geassocieerd met een kleine afname in creamatocrit waarden ^11.
2. Voor verse melk, het verzamelen van een monster van melk uit de speen in een microhematocrietmethode buis; Vul ten minste ¾ vol (ongeveer 15-20 pi). Als alternatief, trekken verse melk uit de verzamelde monster in het capillair na goed mengen. Verzegelen het einde met klei kit.
3. Plaats de capillaire buis in de hematocriet spinner, met deafgedichte wijst naar buiten, zodat de centrifuge in balans.
4. Begin de hematocriet draai (120 sec bij 13.700 xg).
   OPMERKING: Spin tijd of snelheid kan veranderen, afhankelijk van het model van de centrifuge gebruikt.
5. Haal de buis uit de centrifuge na de spin is voltooid en voert de metingen voor de berekening van creamatocrit. Observeren de scheiding van het monster in een crème laag en een heldere laag.
6. Meet en registreer de totale lengte van fluïdum in de buis en de lengte van het vet (room) laag behulp van beugels of een liniaal.
   Opmerking: De creamatocrit wordt uitgedrukt als het percentage van de crèmelaag binnen het melkmonster ^19, berekend als (lengte crèmelaag / totale kolomlengte melk) x 100 (Figuur 1A). Bereken vetconcentratie en energiewaarden van de creamatocrit meting als volgt: Vet concentratie (g / L) = (creamatocrit (%) - 0,59) /0.146 (Figuur 1B) ^19; Energie waarde (kcAl / L) = 290 + (66,8 * creamatocrit (%) (Figuur 1C) ^19.

8. Eiwit concentratiebepaling

1. Met behulp van runderserumalbumine als standaard eiwit, vaststellen van totaal melkeiwit concentratie met een standaard- eiwitanalyse, zoals een Lowry eiwit assay ^6.
   OPMERKING: Verdunning van de melk noodzakelijk zijn voor melkeiwit metingen binnen de standaardcurve van de assay valt.

Resultaten

Melk werd verzameld zoals beschreven spenen van Wistar dammen (ongeveer 22 weken oud, met een gewicht 350-400 g) die een controle verbruikt (AIN-93G, n = 5) hoog eiwitgehalte (40% caseïne wt / wt, n = 5) of hoge prebiotische vezels (21,6% w / w, 1: 1 verhouding van oligofructose en inuline, n = 4) voeding tijdens de zwangerschap en borstvoeding. De dosis oxytocine werd 2 IU. Melk werd verzameld met behulp van capillaire buisjes, en één buis werd gecentrifugeerd met een hematocriet spinner creamatocrit (figuur 1A...

Discussie

Onderzoek naar de componenten van moedermelk is toegenomen naarmate de belangstelling voor onderzoek naar vroege levensontwikkeling toeneemt. Als enige bron van voeding tijdens de neonatale periode zijn de bioactieve stoffen in melk essentieel voor een ideale groei en ontwikkeling, vooral in de context van darm- en immuungezondheid³. De hier gepresenteerde methode is een eenvoudige, niet-invasieve methode om melk te verzamelen van de lacterende rat in hoeveelheden die voldoende zijn voor downstream-analyse, zo...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Equipment - Melken
1 ml spuiten	BD-Canada	309602
25 G naalden	BD-Canada	305122
18 G naalden	BD-Canada	305196
50 μl Microdispenser capillaire buizen	Fisher Scientific	21-169D
Oxytocine (20 USP eenheden/ml)	Bimeda-MTC	1OXY015
PPC Vet Isofluraan Inhalatieanesthesie, 250 ml	Fresenius Kabi	M60302	Wordt gebruikt op verzoek van een dierenarts
Steriele alcohol preparaat pad	Dukal	853
Absorbeerbare onderlegger	VWR	82020-845
Maxi-Therm Hyper/Hypothermie deken	Cincinnati Sub-Zero	274
Rodent Anesthesie Machine met Verdamper	Benson Medical Industries Inc.		Afhankelijk van de individuele laboratoriumbehoeften
Dieren maskers	Benson Medical Industries Inc.	50100/50102
Microcentrifuge buizen	Axygen	MCT-060-C
ChroMini Professional Trimmer	Wahl
Equipment - Creamatocrit
StatSpin SafeCrit Plastic Microhematocrietbuizen (Onbehandeld)	Fisher Scientific	22-274-914
Critoseal Capillaire buis sealant tray	VWR	470161-478
StatSpin CritSpin Microhematocriet centrifuge	Beckman Coulter, Inc	X00-004999-001