Het kwantificeren van vissen zwemmen gedrag in reactie op acute blootstelling van Waterige Copper Met behulp van Computer Assisted Video en Digital Image Analysis

Samenvatting

Het meten van de effecten van milieuverontreinigende stoffen op vis gedrag is vaak subjectief en uitdagend in het bijzonder bij de behandeling van subletale eindpunten. We beschrijven methoden, waaronder video-technologie om te zwemmen gedrag van de vroege levensfase witte steur (Acipenser transmontanus) te kwantificeren tijdens en na 96 uur acute blootstelling aan verschillende concentraties van koper.

Samenvatting

Gedragsreacties van aquatische organismen op milieuverontreinigingen kunnen voorlopers zijn van andere effecten zoals overleving, groei of reproductie. Deze reacties kunnen echter subtiel zijn en meten kan een uitdaging zijn. Met behulp van juveniele witte steur (Acipenser transmontanus) met koperblootstelling, illustreert dit artikel technieken die worden gebruikt voor het kwantificeren van gedragsreacties met behulp van computerondersteunde video- en digitale beeldanalyse. In eerdere studies werden ernstige beperkingen in zwemgedrag waargenomen bij witte steur in een vroeg levensstadium tijdens acute en chronische blootstelling aan koper. Het gedrag van de steur werd snel beïnvloed en in zo'n mate dat de overleving in het veld in gevaar zou komen, omdat vissen stroomafwaarts zouden worden gevoerd of gemakkelijk door roofdieren zouden worden gevangen. De doelstellingen van dit onderzoek waren om protocollen te illustreren om zwemactiviteit te kwantificeren tijdens een reeks acute koperblootstellingen om de tijd tot effect tijdens de vroege levensfase te bepalen en om de betekenis van deze reacties ten opzichte van de overleving van deze kwetsbare vissen in een vroeg levensstadium te begrijpen. Met sterfte op een tijdscontinuüm, helpt het bepalen wanneer koper voor het eerst de zwemcapaciteit beïnvloedt ons om de implicaties voor effecten op populatieniveau te begrijpen. De gebruikte technieken zijn gemakkelijk aanpasbaar aan experimentele ontwerpen met andere organismen en stressoren.

Inleiding

Begrijpen hoe contaminant blootstelling gedrag van invloed kan zijn is soms zeer uitdagend en subjectief. Gedrag wordt gewoonlijk gedefinieerd als een reeks van openlijke, waarneembare gehele lichaam activiteiten die werken via het centrale zenuwstelsel en maken een organisme om te overleven, te groeien en te reproduceren. Gedragsveranderingen door blootstelling aan een giftige stof tot de meest gevoelige indicatoren van omgevingsstress vaak tussen 10-100 maal gevoeliger in vergelijking met overleving ^1. De meerderheid van deze studies onderzocht zwemmen activiteit, ventilatie en foerageergedrag van vis ^2,3,4. Geschikt activiteit is de meest gebruikte subletale eindpunt bepalen een gedragsverandering reactie op verontreiniging in toxiciteitstesten ^5. Zwemmen variabelen zijn de frequentie en de duur van de beweging, snelheid en afgelegde afstand, de frequentie en de hoek van de bochten, de positie in de waterkolom en het patroon van het zwemmen. Zwemmen activiteiteen effectieve maatregel van het zwemmen gedrag bij de beoordeling van de gevoeligheid van een giftige stof op basis van de in hoofdstuk 9 van Rand ⁶ voorgesteld in het boek Fundamentals of Aquatic Toxicology criteria.

Deze paper presenteert een toxicologisch onderzoek als een voorbeeld van hoe de toxiciteit van koper aan het begin van het leven stadium witte steur (Acipenser transmontanus) in verschillende stadia van de vroege ontwikkeling in water-only blootstelling ten opzichte van de Steur zwemmen gedrag werd geëvalueerd en illustreert methoden voor het kwantificeren van het zwemmen gedrag.

In eerdere studies, gedragsstoornissen reacties waren duidelijk met een vroeg begin in de eerste paar dagen van acute en chronische blootstelling aan koper en werd geleidelijk ernstiger dan blootstellingsduur en concentratie ^7,8,9. De omvang en de timing van het begin van deze gedragsreacties waarschijnlijk voldoende zijn om lange-termijn overleving beperken en derhalve van belang zijn gezien de implicaties voor recruitment mislukking ^10. Om de betekenis van deze gevoeligheid voor metaalblootstelling methoden en procedures te interpreteren zijn ontwikkeld voor het kwantificeren van het tijdsverloop en de omvang van gedrags- stoornissen opzichte koperconcentraties.

Test protocollen voor gedrags-functie en ontwikkeling werden vastgesteld door het analyseren van overhead video monsters van steur in de blootstelling kamers. De video monsters geleverd kwalitatieve beoordeling van de ontwikkeling en functie tussen koper behandelingen gedurende de gehele periode blootstelling. Gedrag en onderdak zoeken naar activiteit werden geëvalueerd tijdens blootstelling aan waterige koper concentraties om de tijd te bepalen om te bewerkstelligen en om de tijdelijke opeenvolging van bijzondere waardevermindering die onderdak zoeken, lethargie beïnvloedt, zwemmen coördinatie, evenwicht, en de ademhaling te karakteriseren. Daarnaast werden video-opnames gemaakt van steur subsampled uit elke repliceren voor het doel van kwantitatief documenteren van spontane zwemmen activiteit. Deze eindpunten opgenomen maatregelen van de duur of de tijd besteed bewegen, zwemmen snelheid en afgelegde afstand ^5,11 met behulp van een commercieel beschikbare digitale beeldanalyse softwarepakket. Deze software bepaalt de omtrek van elk beeld binnen een gezichtsveld en naar definieert het zwaartepunt voor elk beeld. De software kan dan de positie van elk zwaartepunt in een rupsframe frame opvolging in de paden van beweging te bepalen.

Deze studie voldaan aan alle van toepassing zijnde secties van de Final Rules van de Animal Welfare Act regelgeving (9 CFR) en met alle institutionele richtlijnen voor een humane behandeling van de test organismen tijdens cultuur en experimenteren. Bij beëindiging van de studie werden alle vissen gedood volgens passende richtlijnen zoals goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite voor de US Geological Survey, Columbia Environmental Research Center.

Protocol

1. Setup Diluter larven Sturgeon Blootstelling aan Waterige Copper Concentraties

1. Het opzetten van posities met behulp van een flow-through systeem, zoals een aangepaste Mount en Brungs ¹² verdunning systeem volgende richtlijnen door de ASTM International ^13,14,15.
2. Selecteer 25 ug / l als de hoge koperconcentratie op basis van eerdere testresultaten waar de effecten waargenomen ongeveer 4-6 ug / l. Gebruik reagenskwaliteit koper II sulfaat pentahydraat (> 98% zuiverheid) en meng tot een test stock oplossing.
   LET OP: Voorbeeld concentratie serie voor de belichting van 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,0625 en 0 ug / l. Met behulp van 50% seriële verdunningen te beginnen met 25 ug / l als de hoge concentratie zal een reeks concentraties waargenomen gedrags stoornis veroorzaken richten.
3. Bereid de test stock oplossing in een maatkolf van 48 uur voor het begin van de belichting en ingesteld op leveren aan de verdunner mengkamer spike met behulp van eengeautomatiseerde spuit dispenser.
4. Gebruik een spreadsheetsjabloon het gewicht chemische toegevoegd aan 1 L gedeïoniseerd water, die leidt tot 25 ug / L koperconcentratie bij verdunning mengkamer wordt verrijkt met 1 ml van de test stock oplossing te bepalen.
   OPMERKING: Figuur 1 toont een voorbeeld van een spreadsheetsjabloon chemische voorraad voorbereiding verdunning toxiciteitstesten.
5. Weeg 195 mg reagenskwaliteit koper II pentahydraat met een analytische balans en giet in een 1 L maatkolf en meng met 1 L gedeïoniseerd water om een ​​voorraad concentratie van 48,65 mg / l.
6. Plaats de inlaatbuis van de geautomatiseerde spuit dispenser in de test stock oplossing en zet de piek volume tot 1 ml en zet de verdunner door flipping de schakelaar en laat cyclus gedurende 48 uur laat het evenwicht met de overeenkomstige koperconcentratie voorafgaand aan de kous steur.
7. Sluit een in-lijn 4-way stroom splitter 16 elke persleiding waterstroming scheiden naar elk van de vier herhaalde blootstelling kamers in de verdunner waterbad. Zwaartekracht het water. Kringloop van het water door de verdunner wanneer de stroom naar de verdunner wordt ingeschakeld en een elektromagnetische klep wordt geopend waardoor het water te laten stromen naar de verwatering tanks. Stel chiller unit tot 15 ° C en zet de waterpomp om water te circuleren in de verdunner waterbad.
   OPMERKING: Dit proces wordt gereguleerd door het gebruik van een automatische timer.
8. Stel de verdunner fietsen elke 30 min de geautomatiseerde timer en 250 ml testwater leveren bij elke cyclus, wat resulteert in 12 volume toevoegingen per dag voor elke repliceren testkamer.
9. Selecteer blootstelling testkamers gebaseerd op de grootte van de steur tot een aanvaardbaar laden snelheid die <10 g vis nat gewicht / l in elke kamer te handhaven op een bepaald moment. Bijvoorbeeld, om posities met 30 dagen post-luik (DPH) witte steur (gemiddeld gewicht in gram 0,17 g) te gebruiken 12 x voeren21,5 cm ² glazen potten met een 4 cm gat in de zijkant. Bedek deze kant met een 30 micron roestvrijstalen gaas te zorgen voor doorstroming van de test water. Het volume van de test water in de belichting kruiken is 1 L.
10. Met behulp van een 50 ml plastic spuit neem twee duplo 50 ml water monsters bij elke concentratie voor een totaal van 12 monsters en afzien testwater in 100 ml glazen bekers en opgeloste zuurstof (DO), temperatuur, geleidbaarheid, pH, alkaliteit, hardheid meten totale ammoniak, grote kationen, de belangrijkste anionen en opgeloste organische koolstof met behulp van standaard commerciële apparatuur en volg de instructies van de fabrikant.
    LET OP: monsters moeten worden genomen bij het ​​begin en het einde van de blootstelling.
11. Om sub-monsters te verzamelen voor chemische analyse, gebruik dan een 25 ml plastic spuit, het opstellen van ongeveer 24 ml van de test water uit de belichting kamers met een sipper stro verbonden aan de spuit in plaats van een naald.
12. Verwijder de sipper stro van de syringe en plaats een polypropeen filter cassettehuis een 0,45 urn poriegrootte, polyethersulfon membraan op het plastic injectiespuit.
13. Push 4 ml van de test water door de filter en gooi.
14. Verdeel de resterende 20 ml testwater door het filter in een zuur gereinigd polyethyleenfles en zuur tot 1% volume / volume met een hoge zuiverheidsgraad, 16 M salpeterzuur voor de opslag van maximaal 3 maanden.
    OPMERKING: Monsters voor chemische analyse worden genomen bij het ​​begin, midden en einde van blootstelling aan koperconcentraties bevestigen.
15. Voer chemische analyse met behulp van inductief gekoppelde plasma-massaspectrometrie volgende Amerikaanse Environmental Protection Agency Method 6020A ¹⁷
16. Na het nemen van alle watermonsters en de verdunner is fietsen, stock 10 (random, lukraak) steur in elk repliceren testkamer. Verzamel de steur uit de kweek tank waar ze zijn ondergebracht met een kleine maaswijdte niet schurende net. Plaats steur in een kleine bucket met cultuur water. Een totaal van 240 vis nodig om de belichting te starten.
17. Laat de vis niet voeden tijdens de belichting.
    OPMERKING: zie figuur 1 voor een visuele installatie van de verdunner lay-out.
18. Lees de test elke dag voor de duur van de blootstelling en opnemen vissterfte en bewaken zwemmen gedrag.
    LET OP: Andere eindpunten te kijken naar onder meer lethargie, verlies van evenwicht, veranderingen in de ademhaling, veranderingen in de pigmentatie, positie vissen zijn in de waterkolom, het verbergen van de activiteit en alle andere afwijkingen die visueel kan worden geïdentificeerd.
    LET OP: Lees de test op hetzelfde tijdstip elke dag voor consistentie.
19. Meten en te kwantificeren zwemmen activiteit (tijd vis doorgebracht bewegen, de snelheid en de afstand verplaatst) met behulp van een commercieel beschikbare digitale tracking software programma.

2. Opmerkingen en Mortaliteit Tellingen tijdens de blootstelling

1. Inspecteer visueel elke test chamber en note mortaliteit en waarnemingen van abnormaal gedrag met een gedragsmatige checklist (tabel 1) op de notities ongeveer hetzelfde maal daags tijdens de belichting 96 uur, bij voorkeur in de ochtend.
   LET OP: Gedragingen die zijn opvallend, ongewoon, subjectief, kwalitatief verschillend van de controles worden abnormaal beschouwd. Optimaal de waarnemer zich niet bewust van de behandelingen.
   OPMERKING: De evenwichtsverlies wordt gedefinieerd als het onvermogen van de vis rechtop in de waterkolom behouden en immobiliteit wordt gedefinieerd als het onvermogen vissen te verplaatsen of zwemmen tenzij geprikt. Andere afwijkingen zoals lusteloosheid, hyperactiviteit, stijgingen of dalingen in de ademhaling, kleurveranderingen, tremoren, krampen, opgeblazen buik, de positie in de waterkolom en eventuele andere ongebruikelijke zwemmen patronen moeten ook worden opgenomen op de data sheet.
   OPMERKING: Raadpleeg Video 1 voor voorbeelden van abnormalegedrag.
2. Record en het verwijderen van dode steur dagelijks.
3. Met behulp van een draagbare opgeloste zuurstof (DO) meter met sonde meet de opgeloste zuurstof in situ en registreren temperatuur van het water in twee replica's van elke blootstelling concentratie en record op de data sheet.

3. Videotaping Zwemmen Activity

1. Capture videogegevens monsters met behulp van een draagbare videocamera gemonteerd op een statief geplaatst direct boven de testkamer te gedragsafwijkingen documenteren.
2. Zwemmen activiteit te kwantificeren, snijd een stuk PVC-pijp 13 cm in diameter en 13 cm hoog te zijn als de test arena (figuur 1). Plaats de PVC pijp in de verdunning binnen elk overeenkomen koperconcentratie blootstelling tanks. Gebruik het gebied binnen de PVC pijp als de test arena als deze is groot genoeg voor steur om vrij rond te zwemmen.
3. Aan het einde van de belichting 96 uur, willekeurig subgroep 5 overlevende steur uit elke koper concentration te meten om te zwemmen activiteit en plaats ze in op de proef arena met een kleine mesh net.
   LET OP: In de hogere testconcentraties, waar steur sterfte heerste, moeten alle resterende overlevende steur worden gebruikt om te zwemmen activiteit te meten en in sommige gevallen misschien wel minder dan 5.
4. Na het plaatsen van de vissen in de proef arena, zodat de vis te acclimatiseren gedurende 30 min.
   LET OP: Succesvolle, foutloze analyse van de video een hoog contrast beeld van de vissen tegen een achtergrond met een minimum aan structuur die zou kunnen verduisteren of verbergen van de afbeelding van de vis nodig heeft. Het beeld van de vis moet in goede focus en moeten vrij zijn van het oppervlak glans of vrij is van verstoringen als gevolg van het verplaatsen van water zodat de verdunning systeem moet uitgeschakeld zijn.
5. Na 30 min, zet de videocamera aan en ingesteld op REC om het zwembad activiteiten vast te leggen voor een periode van 2 min.
6. Euthanaseren de vis na het nemen van de video-opnames te bepalendrag.
7. Plaats steur in een geconcentreerde oplossing van tricaïne methaansulfonaat (MS222) water gedurende minstens 10 minuten om voor de beëindiging van opercular beweging.
   OPMERKING: Een concentratie van ten minste 250 mg / l wordt aanbevolen en veel hoger voor bepaalde soorten.
8. Plaats de geëuthanaseerd steur in een plastic zip-lock zakje en plaats het in de vriezer voor verwijdering op een later tijdstip. Schakel de videocamera uit en de overdracht van alle video bestanden naar een computer voor nabewerking met behulp van digitale tracking software.

4. Maatregelen van het Zwemmen activiteit uit Video Playback

1. Zoek de data sheet en videogegevens-bestanden voor het experiment te analyseren. Converteren van videobestanden naar een compatibel formaat van de digitale analyse software kan omgaan.
2. Upload alle bestanden die moeten worden verwerkt tot software. Open tracking software door te klikken op het pictogram. Klik op de "Nieuwe standaard experiment" in het "Maak een nieuw experiment" option op het hoofdscherm.
3. Voer de naam voor het experiment in "New Experiment" dialoogvenster dat op het scherm verschijnt. Kies locatie experiment bestand moet worden opgeslagen. Klik op "OK". Kies "Experiment Settings" optie onder "Setup" .Kies "Van videobestand" onder "Video Source".
4. Selecteer "1" voor "Aantal arena's". Selecteer "3" voor "Aantal patiënten per arena". Selecteer "Center-point detectie" onder "op rupsbanden Features". Selecteer de gewenste eenheden.
5. Selecteer "Trial lijst" optie onder "Setup". Klik op "Video toevoegen" aan de bovenkant van het scherm. Kies "alfabetische orde" onder optie 'Sort order' op 'Video's toevoegen "dialoogvenster dat op het scherm verschijnt. Klik op "Browse". Ga naar de map waar de video-bestanden zich bevinden.
6. Markeer alle videobestanden. Klik op "Open". Klik op "Add Variable" aan de bovenkant van het scherm. Enter "Concentratie" in "Label "box. Enter" Koper-concentratie in microgram / L "in" Beschrijving box ".
7. Kies "Numerieke" uit de keuzelijst voor "Type". Klik op de box "voorgedefinieerde waarden". Kies 'Definieer Individuele waarden "optie in het" Definieer vooraf numerieke waarden "dialoogvenster dat verschijnt.
8. Voer "0", "3", "6", "13", "25" en "50" in "vooraf gedefinieerde waarde" ruimte. Klik op "Add >>" tussen elk nummer toevoeging. Verwijder het vinkje "Allow andere waarden" optie. Klik op "OK".
9. Kies "Trial" van drop-down menu in box "Scope". Voer geschikte concentratie voor elke proef in vakken. Klik op "Add Variable" aan de bovenkant van het scherm. Enter "repliceren" in het vak "Label". Voer "repliceren nummer" in "Beschrijving" box. Kies "Numerieke" uit de keuzelijst voor "Type".
10. Klik op "Pgeherdefinieerd waarden "box. Kies" Individuele waarden definiëren "optie in het" Definieer vooraf numerieke waarden "dialoogvenster. Voer" 1 "," 2 "," 3 "en" 4 "in" Vooraf gedefinieerde Value "ruimte. Klik op" Add >> "tussen elk nummer toevoeging. Verwijder het vinkje" Allow andere waarden "option.Click" OK ".
11. Kies "Trial" van drop-down menu in box "Scope". Voer de juiste repliceren nummer voor elke proef in vakken. Kies "Arena Settings" onder het tabblad "Setup" aan de bovenkant van het scherm. Noem de eerste instelling "Trial 1". Klik optie 'Grab achtergrondbeeld "uit" Arena Settings (Trial 1) "dialoogvenster.
12. Klik op "Bladeren" op de "Grab Background Image" dialoogvenster. Zoek videobestand voor Trial 1 en klik op "Open". Klik op "Grab" optie in de "Grab Background Image" dialoogvenster nadat video verschijnt. Klik op de cirkel icoon witte buurt bovenkant van het scherm under "Arena-instellingen".
13. Manipuleren cirkel die lijkt zo die hele zwemgedeelte is ingesloten in de cirkel. Hatch merken verschijnen waar de arena gebied wordt gedefinieerd. Klik op het pictogram "Calibration Scale" in de buurt van de top van het scherm onder 'Arena-instellingen ". Klik met de linkermuisknop op een rand van de arena. Houd en sleep de muis over aan andere kant van de arena. Laat de linker muisknop.
14. Enter "10.5" in "Real world afstand 'box aan de" Calibration Distance "dialoogvenster dat verschijnt. Klik op "OK". Indien nodig, aan te passen kalibratie lijn, zodat het beslaat de gehele diameter van de cirkelvormige arena.
15. Klik op "Bevestigen Arena Settings" optie op "Arena Settings (Trial 1)" dialoogvenster. Alle kwesties als de instellingen niet worden gevalideerd. Klik met de rechtermuisknop "Arena Settings" onder optie "Setup" van het "Experiment Explorer" werkbalk aan de linkerkant van het scherm en kies "Nieuw" uit het menu.
16. Herhaal stap 4,11-4,15 tot arena instellingen have gemaakt voor elke proef. Zorg ervoor dat u de juiste video-bestand voor elk onderzoek te kiezen. Kies "Detection Settings" onder optie "Setup" van het "Experiment Explorer" werkbalk aan de linkerkant van het scherm.
17. Kies "Dynamic Aftrekken" van dropdown menu onder 'Method "in het" Detection Settings: Detection Settings 1 "dialoogvenster dat verschillende opvulkleuren voor elk onderwerp onder" Subject Identification "appears.Choose in de" Detection Settings: Detection Settings 1 "dialoog doos.
18. Kies "Select Video" en video voor Trial 1.Click "Open" rechtenmenu.Selecteer "5,9941" van "Sample rate" vakje onder "Video" vinden in de "Detection Settings: Detection Settings 1" dialoogvenster. Klik op 'Instellingen' voor de optie 'afbeelding Reference "onder" Detection "in het" Detection Settings: Detection Settings 1 "dialoogvenster.
19. Klik op "Start Learning (C)4; optie in de "Reference Image" dialoog box.Wait voor het programma om de afbeelding verwijzing te leren. Zodra de afbeelding in "Reference Afbeelding" dialoogvenster verschijnt zonder dieren, klikt u onder "Verwerving instellingen", "image dynamische verwijzing gebruiken" in het dialoogvenster.
20. Klik op "Close". Kies "Donkerder" uit het drop down menu voor "Het onderwerp is" onder "Detection" in het "Detection Settings: Detection Settings 1" dialoogvenster. Stel kleiner aantal naar "33" en groter aantal naar "153" voor "Dark contrast" onder "Detection" "Detection Settings: Detection Settings 1" dialoogvenster.
21. Klik op 'Wijzigingen opslaan' onderaan rechts van "Detection Settings: Detection Settings 1" dialoogvenster. Klik op de play-knop op de "Playback Control" dialoogvenster en bevestigen dat de software wordt met succes bijhouden van dieren in tegenstelling tot schaduwen of puin. Pas nummers voor "Dark contrast "nodig.
22. Zodra het bijhouden van de juiste is, klikt u op "Wijzigingen opslaan" onderaan rechts van "Detection Settings: Detection Settings 1" dialoogvenster. Kies "Acquisition" onder optie "Setup" van het "Experiment Explorer" werkbalk aan de linkerkant van het scherm.
23. Klik op 'Track volgende geplande trial "in de" Overname Settings "dialoogvenster. Bevestig het juiste proces, video en arena instelling wordt onder "Settings" wordt weergegeven in de "Overname Settings" dialoogvenster.
24. Controleer de "Detection bepaalt speed" optie in het "Acquisition Control" dialoogvenster. Klik op de knop met de groene cirkel ingesloten in een wit vierkant van de overname te starten. Herhaal stap 4,22-4,23 totdat alle proeven zijn gevolgd.
25. Klik op "Data Profiles" onder optie "analyse" van de "Experiment Explorer" werkbalk aan de linkerkant van screen.Choose "Time" onder "Het nestelen" option in de "componenten" toolbar. Adjust "aan" naar "0:02:00" in het "Select spoor tijdsinterval" rubriek in de "Time" dialoogvenster. Klik op "OK".
26. Sleep de "Nest" box tussen de box "Start" en het vakje "Resultaat 1" in de "Data Profiles" gebied aan de rechterkant van het scherm. Klik op "Analyse Profiel" onder de optie "analyse" van de "Experiment Explorer" werkbalk aan de linkerkant van het scherm. Klik op "Velocity" onder de "Afstand en tijd" rubriek in de "afhankelijke variabelen" werkbalk die wordt weergegeven.
27. Klik op de "Velocity" dialoogvenster "Toevoegen". Klik op "Afstand verplaatst" in het "Afstand en tijd" rubriek in de werkbalk "afhankelijke variabelen". Klik op de "Distance verplaatst" dialoogvenster "Toevoegen". Klik op "beweging" in het "Individual Behavior" rubriek in de "afhankelijke variabelen 'toolbar.
28. Adjust "Het gemiddelde interval" op "1" in het "Outlier filter" rubriek in de "beweging" dialoogvenster. Pas "Start velocity" naar "2.00" en "Stop velocity" naar "1.75" in het "Threshold" rubriek in de "beweging" dialoogvenster.
29. Controleer beide dozen voor "Moving" en "niet in beweging" in het "Bereken statistieken voor" rubriek in de "beweging" dialoogvenster. Klik op "Add" aan de onderkant van de "beweging" dialoogvenster. Klik op "Analyse Output" onder "Results" optie in het "Experiment Explorer" werkbalk aan de linkerkant van het scherm. Klik op "Bereken" aan de bovenkant van het scherm.
30. Zodra afhankelijke variabelen worden berekend, klikt u op "Exporteren" aan de bovenkant van het scherm. Kies doelmap in "Export Analysis Output" dialoogvenster. Selecteer "Excel" van "File type" dropdown menu in de "Export Analysis Output "dialoogvenster. Klik op" OK ".
31. Klik op 'Experiment Opslaan "onder het tabblad" File "aan de bovenkant van het scherm. Sluit de digitale tracking software. De data die op een spreadsheet en geanalyseerd met een commerciële statistische analyse softwarepakket.

Resultaten

Handmatig verwerken van de visuele waarnemingen toonden procent afwijkingen toe met toenemende kopergehalte na slechts 72 uur van blootstelling ingeleid 2 dagen na uitkomst (DPH) steur (figuur 2). De video monsters documenteerde de extreme gevolgen van blootstelling aan koper op steur zwemmen gedrag (Video 2) en geholpen bij het bepalen van de gedrags stoornis als gevolg. In een ander voorbeeld, steur op 30 dph bleek gevoelig voor koper belichting met een 96 hr mediane letale effect concentratie (LC50) van 40,3 ug / L gebaseerd op slechts sterfte. Echter, wanneer subletale behavioral eindpunten van het verlies van evenwicht en immobilisatie zijn inbegrepen, samen met de sterfte de gevoeligheid neemt toe met een geschatte 96 uur mediane effect concentratie (EC50) die varieert 2,4-5,0 ug / l. Videodocumentatie veroverde deze subletale effecten en verder gevalideerd menselijke waarnemingen van gedragsafwijkingen opgenomentijdens de belichting. Het gebruik van digitale tracking software verminderde de nabewerking tijd aanzienlijk bij het analyseren van het zwemmen activiteit. Vissen zwemmen snelheid, de tijd te bewegen, en de afgelegde afstand al aanzienlijk gedaald (figuur 3) met een toenemende concentratie koper. Geschikt paden werden gereduceerd met toenemende koperconcentratie (figuur 4).

Figuur 1:.. Computer screenshot van een spreadsheet template gebruikt om test stock oplossing concentratie Chemical voorraad voorbereiding van de verdunner toxiciteitstests werd bepaald met behulp van een spreadsheet template op basis van een doel concentratie vast te stellen Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2:. Diluter setup en experimenteel design Diverse levensstadia van de witte steur werden blootgesteld aan koper. De grootte van verdunner voor de blootstelling werd geselecteerd op basis van de grootte van de vis. (A) Het vroege leven stadium steur werden blootgesteld met behulp van een kleine diluter setup en (b) oudere life-traps steur werden blootgesteld met behulp van een grote diluter setup.

Figuur 3: Zwemmen gedrag vloeit voort uit een vroege levensfase witte steur (Acipenser transmontanus) 72 uur koper blootstelling (beginnend met 30 dagen na uitkomst [DPH] vis). Zwemmen activiteit eindpunten (a) de duur van de beweging onder 30 DPH witte steur; (B) snelheid van het zwemmen; en (c ) afstand verplaatst daalde met toenemende concentratie koper onder witte steur blootgesteld gedurende 96 uur. Asterisk geeft significant verschil met controle foutbalken standaardafwijking.

Figuur 4: Resultaten uit een vroeg life-stadium witte steur (Acipenser transmontanus) 96 hr koper blootstelling (beginnend met 2 dagen na uitkomst [DPH] vis) Overleven witte steur op 2 DPH tentoonstellen verlies van evenwicht en immobilisatie na 72 uur of een. 96 uur blootstelling met toenemende kopergehalte. Asterisk geeft significant verschil met controle foutbalken standaardafwijking.

Figuur 5: Voorbeeld zwemmen pad voortvloeit uit een vroege levensfase witte steur (Acipenser Transmontanus) 96 hr koper blootstelling (staren met 30 dagen na uitkomst [DPH] vis). Zwemmen paden van steur gedigitaliseerd met behulp van digitale software voor het bijhouden van (a) controle repliceren (n = 5 vis) en (b) van een hoge behandelingskosten (50 ug / L) repliceren (n = 3 vis) na 96 uur blootstelling. Noteer het nummer van het zwemmen paden niet het aantal vissen aanwezig te vertegenwoordigen in de kamer vanwege een vis inactief waren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

kwantificeerbare Parameter	observationele parameters
Snelheid	Lethargie / Hyperactivity
Afstand Verplaatst	Verlies van evenwicht
Duur van de tijd doorgebracht in de zone	Spasmen / trillingen / upsidenaar beneden
Zone transitie-aantal keren organisme beweegt tussen geselecteerde zones	Positie in de waterkolom
Ik ben op weg naar point-berekent de afwijking van het pad van het dier naar een bezienswaardigheid	Ademhaling (snel / langzaam)
Heading berekent de titel van de geselecteerde lichaam punt	Kleur
Turn angle-verschil in rubriek tussen twee monsters	Hiding
Hoeksnelheid berekend door de draaihoek van de monsterinterval
Meandervormige berekend door de draaihoek van de afgelegde afstand. Gebruikt voor de vergelijking draaien bij dieren bewegen met verschillende snelheden
Tijdsbesteding bewegende
Mobiliteit state-berekent hoe lang dit gebied gedetecteerd als dier verandert, zelfs als de centER punt blijft hetzelfde
Rotatie-één omwenteling is voltooid wanneer het geselecteerde orgaan onder een cumulatief draaihoek van 360 °. Draait in de tegengestelde richting kleiner is dan de drempelwaarde worden genegeerd.
Mobiliteit continue berekening van het percentage van mobiliteit voor dit gebied van het waargenomen dier, zelfs als het middelpunt gelijk blijft.
Afstand tussen de onderwerpen-berekent de afstand tussen alle actoren en de geselecteerde ontvangers
Proximity-berekent de duur waarvoor de acteur is of niet in de nabijheid van de ontvanger
relatieve beweging
Net gewogen beweging-De beweging van de acteur om (positief) en uit (negatieve) de ontvanger, gewogen op basis van de afstand tussen hen
Gewogen beweging uit-moveme nt van de actor van de ontvanger, gewogen met de afstand tussen hen.
Gewogen beweging to-beweging van de acteur naar de ontvanger, gewogen op basis van de afstand tussen hen
Trial controle state periode tussen twee gebeurtenissen van het proces controle-elementen, of binnen een element
Trial controle event-moment waarin een gebeurtenis binnen een element dat je in het proces controle hebt gedefinieerd optreedt.

Tabel 1:. Behavioral endpoints gekwantificeerd via digitale tracking software Deze eindpunten kunnen worden uitgeoefend op personen of groepen en ook dienen als een lijst voor visuele observatie controles gedrags- stoornissen tijdens de belichting.

/www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477video1.avi "> Video ^1:. Visuele definitie van afwijkend gedrag vertoond door aangetaste witte steur (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden) Een dagelijkse observationele checklist werd gebruikt om afwijkingen document voor. verlies van evenwicht en immobilisatie waren de meest voorkomende afwijkingen waargenomen tijdens de blootstelling. Modified van Calfee et al. ⁷

Video 2: Visuele documentatie benadrukkend een voorbeeld van de witte steur zwemmen gedrag. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden) Witte steur zwemmen activiteit werd sterk verminderd met de blootstelling aan toenemende koperconcentratie. De steur afgebeeld in deze video zijn van een controle, matig laag, en een hoge behandeling aan het einde van een 96 hr waterige koperblootstelling. Hoewel de witte steur nog leefden blijkt de vis werd sterk geremd bij behandelingen vergeleken met de controles. Modificatie van Calfee et al. ⁷

Discussie

Gedragsveranderingen door blootstelling aan een verontreiniging worden vaak gebruikt als eindpunt voor sublethale toxiciteit, maar moeilijk te meten. In het algemeen zijn gedrag responsen gemeten door visuele waarneming en handmatige gegevensanalyse die veel verwerkingstijd nodig. Maar met de vooruitgang van de technologie, hebben methoden voor het kwantificeren van het zwemmen activiteiten gericht op het gebruik videografie ¹⁸ en bewegingsanalyse of digitale tracking software die de verwerking en analyse tijd vermindert. Tijdens de analyse van de video vastgelegde gegevens, het kwantificeren van het zwemmen variabelen handmatig zou veel tijd geweest zijn in beslag, zodat het gebruik van video-opnames data en vis tracking software voorzien van een effectievere en efficiëntere manier voor het analyseren van steur zwemmen gedrag. Hoewel de procedure benadrukte zwemmen gedrag van een vis, het aanpassen van andere organismen zoals amfibieën en ongewervelde zou eenvoudige aanpassingen vereisen. Afhankelijk van wat behavioral Eindpunts worden aangepakt, experimenteel ontwerp en camera systemen kunnen worden ontwikkeld voor gebruik met zowat elke commercieel beschikbare tracking software pakket.

De werkwijze wordt aangetoond door middel opgelost koper, maar is toepasbaar op andere waterige verontreinigingen of eigenschappen zoals temperatuur of zuurstofgehalte. De ontwikkeld en gepresenteerd in dit document protocollen gebruik gemaakt van een eenvoudige digitale video camera als het opnameapparaat. De digitale bestanden kunnen eenvoudig overgezet naar een computer en geüpload in om de beweging analyse software. De werkwijzen worden voortdurend gemodificeerd en verfijnd om de kwantificering te stroomlijnen. Het is noodzakelijk dat de beeldkwaliteit in high definition zodat de analysesoftware elke afzonderlijke vis identificeren volgen. Elke achtergrond die niet contrasteren met de vis zal problemen veroorzaken wanneer het proberen om de gegevensbestanden te verwerken. Een ander veel voorkomend probleem met twee dimensionale video-tracking is het identificeren van individuentijdens het zwemmen paden kruisen. Dit kan handmatig worden gecorrigeerd door het identificeren van elke vis tijdens de overtocht pad en het koppelen van het pad segmenten binnen de software. Als alternatief kan de totale activiteiten worden bepaald uit elke repliceren kamer als groep gemiddeld. Verschillende afzonderlijke kamers met elk een met een vis kan worden gefilmd in hetzelfde gezichtsveld van de bewegingen van de individuele vis te berekenen.

Op dit moment hebben we een upgrade naar het gebruik van een reeks van overhead bewakingscamera's boven de belichting kamers die zijn gekoppeld aan een high-definition digitale video-opname-apparaat (HD-DVR). Echter, het gebruik van een camerasysteem dat high definition MPEG-4 video kan opnemen werken. De HD-DVR kan ingesteld worden om op te nemen op een bepaald tijdstip en geprogrammeerd voor maximaal 7 dagen. Deze hands-off geautomatiseerde aanpak maakt het mogelijk de vangst van verschillende video's op hetzelfde moment om de consistentie te behouden, terwijl het minimaliseren van externe verstoringen die vis gedrag in gevaar kunnen brengen. De HD-DVR systems aansluiting op een netwerk, zodat het overbrengen van bestanden is relatief eenvoudig. Terwijl de automatische camerasysteem een ​​veel betere werkwijze voor het kwantificeren zwemgedrag, is het nog steeds voordelig voor visuele waarneming voeren als aanvullende ondersteunende informatie voor het documenteren behavioral impairment in toxiciteitsproeven dienen.

Er is een lange geschiedenis van de literatuur documenteren veranderde vis gedrag als gevolg van blootstelling aan metalen die teruggaat tot de vroege jaren 1960 ^19,20,21. Koper is aangetoond dat veranderingen in de activiteit zoals hypoactiviteit in zonnebaars ²² veroorzaken (Lepomis macrochirus Rafinesque) en de veranderingen in het bewegingsapparaat en het voeden van de activiteit van de beek forel ²³ (Salvelinus fontinalis). Ten minste een aantal jonge vis vertrouwen op hun gevoel van geur op te sporen en te voorkomen dat roofdieren, en koper-geïnduceerde chemosensory ontbering kan gedrag met betrekking tot het opsporen van alarm chemicaliën ^24,25,26 invloed . De reukepitheel is beschadigd als gevolg van blootstelling aan koper daardoor zintuiglijke mechanismen die kunnen leiden tot desoriëntatie, gedragsmatige vermijding, verminderde voeding en andere gedragingen die worden geleid door de reukzin ²⁷ beïnvloeden. Deze gewijzigde gedrag waren consistent met wat tijdens de blootstelling waargenomen.

De zwemgedrag witte steur werd sterk beïnvloed tijdens subletale blootstelling aan waterige koperconcentraties .. Deze resultaten illustreren hoe gedrag beïnvloed op subletale concentraties van koper en kan worden gebruikt als een indicator van toxische stress. De video gebaseerde analyse bleek effectief bij het kwantificeren zwemmen gedrag en diende ook als kwalitatieve visuele documentatie van de ernstige gevolgen voor de steur blootgesteld aan koper. De analysesoftware kan ook kwantificeren andere gedrags- eindpunten. Zie tabel 1 voor een lijst. Het belichtingssysteem kan worden aangepast aan elk eindpunt in te pakkenreal-time gecontroleerd en kan worden gebruikt om verschillen in gedrag van blootstelling aan diverse verontreiniging bezorgdheid kwantificeren.

Het gebruik van gedrags- eindpunten in aquatische toxicologisch onderzoek steeds werknemer en moet worden beschouwd als de effecten van verontreinigingen omdat adaptieve gedragsfuncties cruciaal is bij het ​​bepalen van het milieu schade ^9. De effecten van milieuverontreinigende stoffen te vissen gedrag is vaak subjectief en uitdagend in het bijzonder als het gaat om subletale eindpunten in de afwezigheid van standaardmethoden ..

Geschikt activiteit gekwantificeerd met behulp van deze werkwijzen kan streng worden gecontroleerd, niet destructief met minimale belasting van het organisme en kan worden herhaald. Geschikt gedrag is geldig en consistente index subletale toxiciteit die in testprotocollen moeten worden opgenomen om de gevoeligheid van standaard toxiciteitstests ⁵ vergroten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
koper II sulfaat pentahydraat	Sigma-Aldrich		zorgwekkend verontreinigingsmiddel
spuitdispenser	Hamilton MicroLab 600 Series		apparaat om chemicaliën te spiken
2 L volumetrische kolf			container voor het bewaren van voorraadoplossing
24-1,5 L glazen potten			testkamer voor 2 dph steur
videocamera	Sony Handycam HDR-CX550V
digitaal trackingsoftware	Noldus Ethovision
3-17" flatscreen monitoren
24 bewakingscamera's	Model CL101
3-16 kanaals digitale opnameapparaten
DO meter	YSI
pH meter	Orion 940
pH sonde	Orion
ammoniakmeter
ammoniaksonde	Orion
koelunit
recirculerende waterpomp