Isolatie van specifieke genomische regio en identificatie van geassocieerde moleculen door enChIP

Samenvatting

De identificatie van moleculen die geassocieerd zijn met specifieke genomische regio's van belang is vereist om de mechanismen van regulatie van de functies van deze regio's te begrijpen. Dit protocol beschrijft procedures om geëngineerde DNA-bindende molecuul-gemedieerde chromatine immunoprecipitatie (enChIP) uit te voeren voor de identificatie van eiwitten en RNA's die geassocieerd zijn met een specifiek genoomgebied.

Samenvatting

De identificatie van moleculen geassocieerd met specifieke genomische regio's van belang is vereist om de mechanismen van regulatie van de functies van deze regio's te begrijpen. Om de niet-bevooroordeelde identificatie van moleculen die interageren met een specifiek genomisch gebied van belang mogelijk te maken, hebben we onlangs de door ingenieurs ontwikkelde DNA-bindende molecuul-gemedieerde chromatine-immunoprecipitatie (enChIP) techniek ontwikkeld. Hier beschrijven we hoe enChIP te gebruiken om specifieke genomische regio's te isoleren en de geassocieerde eiwitten en RNA's te identificeren. Eerst wordt een genomisch gebied van belang getagd met een transcriptie-activator-achtige (TAL) eiwit of een geclusterde regelmatig geïnterlinieerde korte palindromische herhalingen (CRISPR) complex bestaande uit een katalytisch inactieve vorm van Cas9 en een geleide RNA. Vervolgens wordt het chromatine gecrosslinked en gefragmenteerd door sonicatie. Het getagde locus wordt vervolgens geïmmunoprecipiteerd en de crosslinking wordt omgekeerd. Ten slotte worden de eiwitten of RNA's die geassocieerd zijn met het geïsoleerde chromatine onderworpen aan massaspectrometrische of RNA-sequencing analyses, respectievelijk. Deze aanpak maakt de succesvolle identificatie van eiwitten en RNA's geassocieerd met een genomisch gebied van belang mogelijk.

Inleiding

De identificatie van moleculen geassocieerd met specifieke genomische gebieden van belang is vereist om de regulatiemechanismen van genomische functies zoals transcriptie en epigenetische regulering begrijpen. Hoewel verschillende technieken ontwikkeld voor biochemische analyse van specifieke genomische gebieden ^1-7, zijn deze niet op grote schaal gebruikt in dit stadium vanwege hun intrinsieke problemen zoals beperkte toepassing (bijvoorbeeld alleen bij hoge kopieaantal loci of loci met herhalingen) en te veel tijd en inspanningen nodig.

Om de biochemische analyse van specifieke genomische gebieden gemakkelijk uit te voeren, hebben we twee locus-specifieke chromatine immunoprecipitatie (ChIP) technologieën, namelijk insertionele chip (ichip) ^8-13 en gemanipuleerde DNA-bindende-molecuul bemiddelde chip (enChIP) ontwikkeld ^14-17 . In ichip, wordt een meetkundige plaats gelabeld door het inbrengen herkenningssequenties van een exogeen DNA-bindend eiwit zoals LexA. De locus wordt vervolgens geïsoleerd door affiniteitszuivering met de gelabeld DNA-bindend eiwit. In enChIP, gemanipuleerde DNA-bindende moleculen, zoals zinkvinger eiwitten, transcriptie-activator-achtige (TAL) proteïnen, en geclusterde regelmatig interspaced korte palindroom repeats (CRISPR) complexen worden gebruikt om een meetkundige plaats taggen (figuur 1). Vervolgens wordt het genomische regio geïsoleerd door affiniteitszuivering van het gelabelde DNA-bindende moleculen.

Een van de voordelen van enChIP dan ichip is dat insertie van herkenningssequenties van een exogeen DNA-bindende eiwit niet noodzakelijk. Targeting loci met CRISPR complexen bestaande uit een katalytisch inactieve vorm van Cas9 (dCas9) en een gids RNA (gRNA) is veel gemakkelijker dan de gerichtheid van deze regio's door ichip of enChIP met TAL en zink-vinger eiwitten. Hier beschrijven we een stap-voor-stap protocol voor enChIP gecombineerd met massaspectrometrie en RNA-sequencing (RNA-Seq) naar locus-vereniging te identificerented eiwitten en RNAs, respectievelijk.

Protocol

1. Ontwerp van Engineered DNA-bindende moleculen bewust van de Target Locus

1. Voor enChIP gebruik CRISPR complexen, gebruik dan de CRISPRdirect webtool (http://crispr.dbcls.jp) voor kandidaat gRNA doelwit sequenties in de genomische regio van belang beschreven, zoals eerder ¹⁸ identificeren. Deze webtool keert 23 bp genomische plaatsen van de vorm 5'-N ₂₀ NGG-3 'binnen het doelgebied.
2. Synthetiseren een gBlock inclusief U6 promotersequentie en de sequentie van 5'-N ₂₀ in 5'-N ₂₀ NGG-3 'met andere voorzieningen (zie figuur 2) ^19,20. Voor subklonering doeleinden, onder meer geschikte restrictie-enzym plaatsen buiten de gBlock.
3. Plaats de gBlock in een geschikte vector zoals eerder beschreven ^16. Verscheidene retrovirale vectoren voor gBlocks zijn beschikbaar (zie Materials).
4. Voor enChIP gebruik TAL eiwitten, ontwerpen TAL eiwitten herkennen van de target loci. Genereren van plasmiden die coderen TAL eiwitten met behulp van commerciële diensten. Genereer expressievectoren die de TAL eiwitten gefuseerd met één of meer tags zoals 3 x FLAG zoals eerder beschreven ^15.

2. Vaststelling van Cellen voor de enChIP Analyse

1. Versneld 3 × FLAG-dCas9 en de gRNA (CRISPR-gebaseerde procedure) of 3 × FLAG-TAL (TAL basis van eiwitten procedure) in de cellen worden geanalyseerd zoals eerder beschreven ^14-17.
   1. Gebruik transiënte transfectie wanneer de transfectie efficiency hoog. Een expressievector die 3 × FLAG-dCas9 en de CMV-promotor is beschikbaar (zie Materials).
   2. Overwegen om stabiele transformanten met gebruikelijke werkwijzen wanneer de transiënte transfectie-efficiëntie is laag. Naast de eerder genoemde retrovirale vectoren voor gBlock, retrovirale vectoren van 3 x FLAG-dCas9 beschikbaar (zie Materialen).
2. Bevestig de expressie van de 3xFLAG-dCas9 of 3xFLAG TAL-eiwit in de getransfecteerde cellen door immunoblot analyse met een anti-FLAG-antilichaam (Ab) zoals eerder ^14-17 beschreven.
   Opmerking: Expressie van deze gemerkte eiwitten kunnen ook worden bevestigd door intracellulaire kleuring met anti-FLAG-FITC en een daaropvolgende FACS-analyse. Een protocol voor intracellulaire kleuring kan worden gedownload van onze homepage (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html).
3. Bevestigt expressie van het gRNA van standaard RT-PCR-techniek.
4. Voor kwantitatieve identificatie van eiwitten interactie met de genomische regio van belang, overweeg dan het gebruik van een stabiele isotoop labeling van aminozuren in celcultuur (SILAC) analyse gecombineerd met enChIP (enChIP-SILAC).
   Opmerking: middelen voor het SILAC analyse kan worden gekocht bij commerciële leveranciers. SILAC is krachtig in het opsporen van specifieke interacties.
   1. Cultuur cellen in SILAC zwaar medium. Bereid cellen Culturood in SILAC licht medium als een negatieve controle. Gebruik minimaal 5 x 10 ⁷ cellen per SILAC medium (zwaar of licht). Voor een efficiënte labeling, voeg zowel L-lysine-2HCl, ¹³ C _{6 en} L-arginine-HCl, ¹³ C _6, ¹⁵ N _{4 in de} SILAC Heavy media. Opmerking: Minstens vijf celdelingen noodzakelijk label eiwitten.
      1. Zo cultuur menselijke fibrosarcoom HT1080 cellen die stabiel tot expressie 3xFLAG-dCas9 en gRNA bij 37 ° C en 5% _CO2 in DMEM media SILAC en gedialyseerd foetaal runderserum met Lysine-2HCl plus L-Arginine-HCl (Light gemiddeld) of ¹³ C ₆ L-lysine-2HCl plus ¹³ C ₆ ¹⁵ N ₄ L-Arginine-HCl (Heavy gemiddeld) (zie Materials) ^16. Voeg 50 mg lichte of zware L-Lysine en L-2HCl-Arginine-HCl in 500 ml medium.
      2. Trypsinize en replate cellen voordat ze confluent, zodat de cellen te behouden exponentiële growth.

3. verknoping van cellen met Formaldehyde

1. Voor cellen in suspensie cultuur, overdracht 2 x 10 ⁷ cellen die 3xFLAG-TAL eiwitten of 3xFLAG-dCas9 plus gRNA en schorten in 30 ml van de reguliere kweekmedium in een 50 ml centrifugebuis. Wanneer er meer cellen worden gebruikt, stijgen de volumes en hoeveelheden reagentia proportioneel. Voor SILAC experimenten, meng de cellen gekweekt in zware medium of licht middel (5 x 10 ⁷ cellen elk) en verdeel de in totaal 1 x 10 ⁸ cellen in 5 buisjes die 2 x 10 ⁷ cellen.
2. Voeg 810 ul van 37% formaldehyde aan 30 ml van de celsuspensie (eindconcentratie 1%) en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 min. Voor hechtende cellen rechtstreeks cellen in kweekschalen lossen door het toevoegen van 810 pi 37% formaldehyde aan 30 ml kweekmedium.
3. Stop de verknoping door toevoeging van 3,1 ml van 1,25 M glycine-oplossing (eindconcentratie 127 mM), enincuberen bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
4. Verzamel cellen door centrifugatie (300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C). Gooi voorzichtig de bovenstaande vloeistof, waaronder formaldehyde en bewaar het op een passende fles afval.
   1. Voor hechtende cellen los cellen met een cel schraper en oogst in een 50 ml buis en verzamel cellen zoals beschreven in deze stap.
   2. Voor SILAC experimenten, meng de losgemaakte cellen gekweekt in zwaar medium of licht middel (5 x 10 ⁷ cellen elk), verdeel het totaal van 1 x 10 ⁸ cellen in 5 buisjes die 2 x 10 ⁷ cellen en verzamel cellen zoals beschreven in dit stap.
5. Was de celpellet met 30 ml PBS twee keer per buis. Gooi voorzichtig de bovenstaande vloeistof, waaronder formaldehyde en bewaar het op een geschikte afval bottle.Handle de formaldehyde afval volgens chemische veiligheidsrichtlijnen. De gefixeerde cellen kunnen worden ingevroren en opgeslagen bij -80 ° C.

4. Voorbereiding van chromatine (per 2 x 10⁷ cellen)

1. Suspendeer de cellen gefixeerd in 10 ml cellysis buffer (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5% IGEPAL CA-630 en 1 x proteaseremmers) en incubeer op ijs gedurende 10 min.
2. Centrifugeer het monster (830 x g bij 4 ° C gedurende 8 minuten) en de bovenstaande vloeistof voorzichtig.
3. Suspendeer de pellet in 10 ml van nucleaire lysis buffer (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoxycholaat, 0,5% lauroylsarcosine en 1x proteaseremmers). Incubeer op ijs gedurende 10 min en vortex elke 2-3 min.
4. Centrifugeer het monster (830 × g bij 4 ° C gedurende 8 minuten) en de bovenstaande vloeistof voorzichtig.
5. Was de pellet in 10 ml PBS. De pellet (chromatine fractie) kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C onmiddellijk na invriezen in vloeibare stikstof.

5. Sonicatie van chromatine (per 2 x 10 ⁷ cellen)

1. Hang de chromatine fractie in 800 plgemodificeerde lysis buffer 3 (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS en 1x proteaseremmers) en overbrengen in een 1,5 ml buis.
2. Ultrasone trillingen het chromatine met een sonicator (zie Materials) en de volgende voorwaarden: output: 3; duty: 100% (permanent); en tijd: gratis. Voer 10-18 cycli van sonicatie gedurende 10 seconden en koelen op ijs gedurende 20 sec. Om oververhitting te voorkomen, incubeer de monsters op ijs gedurende 2 minuten elke 5-6 cycli. Om schuimvorming te voorkomen, houdt de positie van de tip van de sonde ultrasoonapparaat 0,5 cm boven de bodem van de buis.
3. Centrifugeer het monster (16.000 xg bij 4 ° C gedurende 10 min) en de supernatant over in een 1,5 ml buis. De gesoniceerd chromatine kan worden opgeslagen bij -80 ° C na onmiddellijke bevriezing in vloeibare stikstof.

6. Evaluatie van chromatine fragmentatie

1. Meng 10 ul van de gefragmenteerde chromatine met 85 pl gedestilleerd water.
2. Voeg 4 pivan 5 M NaCl en incubeer bij 65 ° CO / N.
3. Voeg 1 pl van 10 mg / ml RNase A en incubeer bij 37 ° C gedurende 45 min.
4. Voeg 2 pl 0,5 M EDTA (pH 8,0), 4 pi 1 M Tris (pH 6,8) en 1 pi 20 mg / ml Proteinase K, en incubeer bij 45 ° C gedurende 1,5 uur.
5. Afzonderlijke 10 gl van het monster door elektroforese in een 1% agarose gel die kleuring kleurstoffen zoals SYBR Green bevat.
6. Vlekken op de gel om de verdeling van de lengtes van de gefragmenteerde chromatine evalueren. Omstandigheden die een gemiddelde lengte van 0,5-2 kbp (bereik van 0,2-4 kbp) genereren aanbevolen.
7. Zuiver DNA van de overige monsters met fenol-chloroform extractie of door een DNA-extractie kit (zie Materialen). Het gezuiverde DNA kan worden gebruikt als input DNA schatting van de opbrengsten aan enChIP analyses (zie 8,11).

7. Bereiding van Dynabeads met geconjugeerde antilichamen (per 2 x 10 ⁷ cellen)

1. Prepare twee 1,5 ml buizen, één voor pre-maaien met normale muis IgG en de andere voor incubatie met het anti-FLAG Ab. Voeg 150 ul Proteïne G geconjugeerde magnetische korrels (zie Materials) aan elke buis.
2. Plaats de buizen op een magneet stand en wacht 3 min. Verwijder het supernatant door pipetteren.
3. Suspendeer de kralen in 1 ml PBS met 0,01% Tween-20 (PBS-T). Plaats de buizen op een magnetische standaard en wacht 2 min. Verwijder het supernatant door pipetteren, en herhaal de stap.
4. Suspendeer de kralen in 1 ml van PBS-T met 0,1% BSA.
5. Voeg 15 ug normale muis IgG of anti-FLAG Ab en roteren bij 4 ° CO / N.
6. Spin down kort en plaats de buizen op een magneet staan ​​en wacht 3 min. Verwijder het supernatant door pipetteren.
7. Suspendeer de kralen in 1 ml PBS-T. Omkeren het monster meerdere malen en spin down kort. Plaats de buizen op een magneet staan ​​en wacht 3 minuten, dan is de bovenstaande vloeistof door pipetteren. Herhaal het wassentwee keer met PBS-T (totaal drie wasstappen).

8. Chromatine Immunoprecipitatie (per 2 x 10 ⁷ cellen)

1. Meng de gefragmenteerde chromatine bereid in 5,3) (ongeveer 800 ui) met een-vijfde van het volume (ongeveer 200 pl) van gemodificeerde lysisbuffer 3 met 5% Triton X-100 (eindconcentratie van 1% Triton X-100).
2. Voeg de chromatine oplossing voor de buis waarin Proteïne G geconjugeerde magnetische korrels geconjugeerd met normale muis IgG werden bereid. Roteren bij 4 ° C gedurende 1 uur.
3. Plaats de buis op een magneet staan ​​en wacht 3 min.
4. Breng de bovenstaande vloeistof in de buis waarin Proteïne G geconjugeerde magnetische korrels geconjugeerd met anti-FLAG Ab bereid. Draai bij 4 ° CO / N.
5. Plaats de buis op een magneet staan ​​en wacht 3 min. Verwijder het supernatant door pipetteren.
6. Suspendeer de korrels in 1 ml buffer met laag zoutgehalte (20 mM Tris (pH 8,0), 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS en 1x proteaseremmers) en roteren bij 4 ° C gedurende 5 min. Plaats de buis op een magneet staan ​​en wacht 3 min. Verwijder het supernatant door pipetteren en herhaal het wassen stap.
7. Was de kralen met hoge zout buffer (20 mM Tris (pH 8,0), 2 mM EDTA, 500 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS en 1x proteaseremmers) tweemaal.
8. Was de kralen met LiCl buffer (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 250 mM LiCl, 0,5% IGEPAL CA-630, 0,5% natriumdeoxycholaat en 1x proteaseremmers) tweemaal.
9. Was de kralen met TBS-IGEPAL CA-630 (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1% IGEPAL CA-630 en 1x proteaseremmers) eenmaal.
10. Suspendeer de kralen in 200 ui elutiebuffer (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1% IGEPAL CA-630, 1x proteaseremmers, en 500 ug / ml 3 x FLAG peptide) en incubeer bij 37 ° C 20 min. Plaats de buis op een magneet staan ​​en wacht 3 min. Breng de bovenstaande in een nieuwe 1,5 ml buis en herhaal de elutkolomion stap.
11. Zuiver DNA van klein gedeelte (bijvoorbeeld 5%) van het eluaat door middel van fenol-chloroform extractie of door een DNA-extractie kit (zie Materialen). Het gezuiverde DNA kan worden gebruikt voor PCR met specifieke primer sets voor het schatten van de opbrengst aan enChIP analyses door vergelijking met input-DNA bereid in Stap 6,7 zoals eerder beschreven ^14,16.

9. SDS-PAGE, kleuring en massaspectrometrische analyse

1. Meng het eluaat (400 pl) met 1 ml 2-propanol, 50 pl 3 M natriumacetaat (pH 5,2) en 5 ui 20 mg / ml glycogeen. Neerslaan van de chromatine bij -20 ° CO / N.
2. Centrifugeer het monster (16.000 xg bij 4 ° C gedurende 30 minuten) en de bovenstaande vloeistof. Spoel het pellet met 1 ml 70% ethanol en opnieuw centrifugeren (16.000 x g bij 4 ° C gedurende 10 min). Verwijder het supernatant volledig door pipetteren.
3. Suspendeer de pellet in 40 ul 2x monsterbuffer (125 mM Tris (pH 6,8), 10% 2-mercaptoethanol, 4% SDS, 10% sucrose, en 0,004% broomfenolblauw). Vortex gedurende 5 min op de korrel volledig op te lossen, en incubeer bij 100 ° C gedurende 30 min om de eiwitten te denatureren en omgekeerde verknoping.
4. Voor SDS-PAGE, run 40 ul van het monster op de gel totdat de kleurstof bereikt 1 cm onder de put. Opmerking: We gebruiken meestal 4-20% gradiënt gelen, maar andere% gels worden gebruikt.
5. Vlekken op de gel met Coomassie Brilliant Blue of zilver vlek.
6. Snijd de gel in vijf stukken (2 mm hoogte).
7. Voeren in gel spijsvertering en massaspectrometrische analyse zoals eerder ^13-16 beschreven.
8. Voor SILAC experimenten met 5 x 10 ⁷ cellen elk (totaal 1 x 10 ⁸ cellen), schorsen pellet van de eerste vijf buizen 40 ui 2x monsterbuffer (het is niet nodig op te schalen).

10. Zuivering van RNA en RNA-Seq Analysis

1. Om het RNA na enChIP zuiveren, voeg 5 U / ml RNase Inhibitor (see Materials) om alle bufferoplossingen, behalve gemodificeerde lysisbuffer 3 en elutiebuffer, waaraan 40 U / ml RNase Inhibitor voegen.
2. Meng het eluaat (400 pl) met 16 pl 5 M NaCl en incubeer bij 65 ° C gedurende 2 uur.
3. Voeg 1 ml zuur guanidinium-fenol gebaseerde reagens (zie Materials) aan het monster. Vortex gedurende 15 seconden en vervolgens incuberen bij kamertemperatuur 5-15 min. Centrifugeer het monster gedurende 15 minuten bij 12.000 x g en kamertemperatuur.
4. Breng het supernatant naar een nieuwe 1,5 ml buis en voeg 5 ul p-broomanisool. Vortex gedurende 15 seconden en vervolgens incuberen bij kamertemperatuur 3-5 min. Centrifugeer het monster gedurende 10 min bij 12.000 xg en RT.
5. Breng de bovenstaande vloeistof (ongeveer 1 ml) in een nieuwe 2 ml buis en voeg 1 ml 2-propanol. Keer de buis en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Laad het mengsel op een kolom in een RNA-zuivering kit (zie Materials). Centrifugeer de kolom gedurende 1 min bij 12.000 x g en RT.
6. Wassende kolom met 400 ui wasbuffer RNA in een RNA zuiveringskit (zie Materialen).
7. Voeg 80 ul DNase I cocktail (mengsel van 5 gl DNase I (1 U / pl), 8 pi 10 x DNase I Reaction Buffer, 3 gl DNase / RNase-vrij water en 64 ui RNA Wash Buffer in een RNA zuiveringskit (zie Materialen)) naar de kolom. Incubeer het monster bij 37 ° C gedurende 15 minuten en centrifugeer gedurende 30 seconden bij 12.000 x g en kamertemperatuur.
8. Was de kolom met 400 ul van RNA voorwas buffer in een RNA-zuivering kit (zie Materials) tweemaal.
9. Elueer het RNA met 50 ui DNase / RNase-free water. De geëlueerde RNA kan worden gebruikt voor RNA-sequencing.

Resultaten

Kortom, kan 1-30% van het doel genoomgebieden worden gezuiverd met enChIP. Figuur 3 omvat representatieve data die de opbrengst van enChIP analyses richten telomeren en de promotor van de interferon (IFN) regulerende factor-1 (IRF-1) gen. Als voorbeelden van de typische resultaten, tabel 1 staan ​​de eiwitten in verband met de IRF-1 promotor in een IFNy-specifieke wijze geïdentificeerd door enChIP-SILAC, Tabel 2 geeft de telomeer bindende eiwitten geïdentificeerd door enChIP gecombineerd met massaspectrometrie (enChIP-MS) en Tabel 3 vermeldt de RNA's geassocieerd met telomeren geïdentificeerd door enChIP-RNA-Seq.

Figuur 1. Overzicht van enChIP. enChIP met CRISPR (A, B) en TAL (C, D, E ) wordt weergegeven. Een locus van belang wordt gelabeld met gemanipuleerde DNA-bindende moleculen zoals TAL eiwit of CRISPR bestaande uit een katalytisch inactieve vorm van Cas9 (dCas) en geleiden RNA (gRNA). De moleculaire interacties worden gefixeerd met formaldehyde of andere verknopingsmiddelen, indien nodig. Vervolgens wordt vastgesteld chromatine gefragmenteerd door sonificatie of enzymatische digestie. De tag genomische gebieden worden gezuiverd door affiniteitszuivering. Tenslotte wordt verknoping omgekeerd, en interactie moleculen (genomische regio's, RNA en eiwitten) worden geïdentificeerd met behulp van next generation sequencing en massaspectrometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Volgorde van gBlock. De U6 promotor (in het zwart), de G nucleotide before de gids sequentie (in het blauw), de gids sequentie (gRNA spacer) (in het rood), het schavot volgorde (in het groen), en de terminatorsequentie (oranje) getoond.

Figuur 3. Opbrengsten van representatieve enChIP analyses. (A) Percentage ingangen voor het doel IRF-1 locus en de niet-target Sox2 locus. (B) Percentage ingangen voor het doel telomeren en non-target γ-satellieten. De cijfers zijn aangepast en gewijzigd ten opzichte van eerdere publicaties ^15,16.

Categorieën	Eiwitten
Transcriptie	DDX1, PARP1, CKAP4, Pescadillo homoloog, PURβ, geactiveerde RNA polymerase II transcriptie-activator p15, BTF3, Myb bindendeiwit 1A
Histondeacetylering, corepressor componenten	RBBP4, PA2G4, TBL3
Acetyltransferase	Protein arginine N-methyltransferase 1
DNA topoisomerase	DNA topoisomerase 2α
Histonen	Histon H2A.Z, histon H3.2

Tabel 1:. Voorbeelden van eiwitten geassocieerd met het humane IRF-1 promotorgebied in een IFNy-specifieke wijze geïdentificeerd door enChIP-SILAC is de tabel aangepast van een voorgaande publicatie ^16.

Categorieën	Eiwitten
Zoogdieren telomeren bindende eiwitten	PML, RPA, CDK1, PARP1, PCBP1
Telomeer-binding eiwitten in gist of andere organismen	IMAP4
Eiwitten interactie met telomeren bindend eiwitten [geassocieerd-telomeer bindend eiwit]	DNA polymerase α (POLA1) [Cdc13p], ARMC6 [TRF2], CTBP1 [FoxP2-POT1] exportin-5 [TERT] GNL3L [TRF1], exportin-1 [TERT], 14-3-3 [TERT]
Eiwitten te lokaliseren heterochromatine	BEND3
Eiwitten die epigenetische merken	KDM5C
Eiwitten waarvan mutaties invloed telomeer functie	DNA polymerase α (POLA1), hat1, Nup133, Cdk7, DPOE1, PRDX1, TYSY, glutamaat-cysteïne ligase, glutaredoxin, SMRC1

Tabel 2:. Voorbeelden van eiwitten in verband met de muis telomeren geïdentificeerd door enChIP-MS De tafel heeft adapte geweestd uit een eerdere publicatie ^15.

Categorieën	RNA's
Telomerase componenten	TERC, Rmrp
Telomerische RNA's	Terras
scaRNAs	Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2
H / ACA snoRNAs	Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a
C / D snoRNAs	Snord17, Snord15a, Snord118
lncRNA	Neat1

Tabel 3: Voorbeelden van RNA geassocieerd met muis telomeren geïdentificeerd door enChIP-RNA-Seq tabel werd aangepast van een voorgaande publicatie ^17..

Discussie

Hier beschrijven we de zuivering van specifieke genomische regio's met behulp van gemanipuleerde DNA-bindende moleculen zoals het CRISPR-systeem en TAL-eiwitten, en de identificatie van eiwitten en RNA's die gebonden zijn aan deze genomische regio's. Binding van gemanipuleerde DNA-bindende moleculen aan het genoom kan de chromatinestructuur beïnvloeden, inclusief de positionering van nucleosomen, en kan genomische functies afschaffen, zoals beschreven in CRISPR-interferentie-experimenten²¹. Om deze potentiële afwijkende effecten te vermijden, stellen we specifieke richtlijnen voor voor het kiezen van doelgenomen regio's. Ten eerste, om potentiële remming van de rekrutering van RNA-polymerasen en transcriptiefactoren te voorkomen, evenals verstoring van de positionering van nucleosomen rond de transcriptiestartplaats, moeten de doelregio's voor analyses van promotorregio's enkele honderden basenparen stroomopwaarts van (5' tot) de transcriptiestartplaats zijn. Daarentegen, bij het analyseren van genomische regio's met duidelijke grenzen, zoals enhancers en silencers, kunnen genomische regio's die direct naast deze regio's liggen, worden getipt omdat het minder waarschijnlijk is dat de binding van gemanipuleerde DNA-bindende moleculen hun functies zal beïnvloeden. Verder is het het beste om doelregio's te vermijden die onder verschillende soorten geconserveerd zijn, omdat belangrijke DNA-bindende moleculen vaak binden aan evolutionair geconserveerde regio's en remming van hun binding kan de functies van de doelgenomen regio's verstoren. In dit opzicht is het altijd noodzakelijk om te controleren of de functie van de doelgenomen regio in de gevestigde cellen die worden gebruikt voor enChIP-analyses behouden blijft. Omdat meerdere gRNA's gemakkelijk kunnen worden getest en het vervelend en duur is om meerdere versies van TAL of zinkvingereiwitten te genereren die verschillende doelgenomen regio's herkennen, is enChIP met behulp van CRISPR voordeliger dan enChIP met behulp van andere eiwitten.

Het is aangetoond dat dCas9 bindt aan off-targetlocaties, hoewel de affiniteit voor die locaties zwakker kan zijn dan voor de doellocaties^22-25. Er zijn verschillende manieren om de besmetting van moleculen die aan die off-targetlocaties zijn gebonden, te beheersen. Ten eerste wordt het gebruik van verschillende, ten minste twee, verschillende gRNA's aanbevolen. Die moleculen die vaak worden waargenomen in enChIP met verschillende gRNA's zouden echte positieven zijn. Ten tweede zou vergelijking van verschillende omstandigheden voor enChIP effectief zijn in het opheffen van besmetting van niet-specifieke moleculen en moleculen die aan off-targetlocaties zijn gebonden. Voorbeelden van die vergelijkingssets zouden zijn (i) stimulatie (-) en (+), of (ii) verschillende celtypen zoals T-cellen versus B-cellen. Ten slotte moet een kwantitatieve analyse van de binding van kandidaatmoleculen worden uitgevoerd om hun specifieke binding aan de doellocaties te bevestigen. Het is wenselijk om cellen te bereiden die alleen dCas9 tot expressie brengen maar geen gRNA als negatieve controle.

Met behulp van enChIP-analyses konden we met succes een aantal bekende en nieuwe moleculen identificeren die interageren met specifieke genomische regio's (Tabellen 1-3)^14-17. Deze techniek slaagde er echter niet in om enkele andere bekende eiwitten te detecteren die met deze regio's interageren. Bijvoorbeeld, STAT1 zou volgens meldingen associëren met de IRF-1 promotor bij IFNγ stimulatie⁸, maar onze enChIP-SILAC-analyse detecteerde STAT1 niet als een eiwit geïnduceerd om te interageren met deze genomische regio¹⁶. Bovendien, in de enChIP-MS-analyse van telomeren, detecteerden we geen shelterine-eiwitten bestaande uit TRF-1 en TRF-2¹⁵, die zijn aangetoond om met telomeren te interageren²⁶. Er zijn een paar mogelijke redenen voor deze discrepanties. Ten eerste, de stoichiometrie van de binding van Stat1 aan de IRF-1 promotor zou erg laag kunnen zijn. Het is redelijk dat enChIP-MS, inclusief enChIP-SILAC, eiwitten detecteert die meer abundant geassocieerd zijn met doelgenomen regio's; daarom kan de analyse van meer cellen nodig zijn om deze eiwitten te detecteren. Toename van de gevoeligheden van MS-instrumenten zou ook bijdragen aan de efficiënte detectie van eiwitten met lage stoichiometrische binding. Ten tweede, sommige eiwitten, mogelijk inclusief Stat1 en shelterinen, zouden moeilijke doelen kunnen zijn voor MS-analyses. Ten derde, in onze analyse van telomeren-bindende eiwitten¹⁵, zouden de 3×FLAG-TAL-eiwitten die telomeren herkennen (3×FN-Tel-TAL) mogelijk de binding van shelterinen aan telomeren op een competitieve manier hebben geblokkeerd.

In tegenstelling tot de relatieve moeilijkheid om transcriptiefactoren te detecteren die aan specifieke genomische regio's binden met behulp van enChIP, hebben we met succes epigenetische regulatoren zoals histonmodificatie-enzymen geïdentificeerd met behulp van enChIP-analyses. Het succes van deze techniek kan te wijten zijn aan het feit dat epigenetische regulatoren aan een breed scala van genomische regio's binden; daarom zijn er meer eiwitten per genomische regio beschikbaar voor MS. Omdat epigenetische regulatoren steeds meer worden erkend als belangrijke doelen voor geneesmiddelen tegen onhandelbare ziekten zoals kanker, zou enChIP een nuttig hulpmiddel zijn voor de identificatie van epigenetische geneesmiddeldoelen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
gBlock-syntheseservice	Life Technologies	Genesynthese door GeneArt
gBlock-syntheseservice	IDT (Integrated DNA Technologies)	gBlocks Gene Fragments
pSIR-neo	Addgene	51128
pSIR-GFP	Addgene	51134
pSIR-DsRed-Express2	Addgene	51135
pSIR-hCD2	Addgene	51143
TAL-syntheseservice	Life Technologies	GeneArt Precision TALs
3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1	Addgene	47948
3×FLAG-dCas9/pMXs-puro	Addgene	51240
3×FLAG-dCas9/pMXs-IG	Addgene	51258
3×FLAG-dCas9/pMXs-I2	Addgene	51259
3×FLAG-dCas9/pMXs-neo	Addgene	51260
anti-FLAG M2 Ab	Sigma-Aldrich	F1804
FITC-geconjugeerd anti-FLAG M2	Sigma-Aldrich	F4049
DMEM-medium voor SILAC	Life Technologies	89985	Ander medium kan worden gekocht bij Life Technologies
Gedialyseerd FBS voor SILAC	Life Technologies	89986
L-Lysine-2HCl voor SILAC	Life Technologies	89987	Voor Light medium
L-Arginine-HCl voor SILAC	Life Technologies	89989	Voor Light medium
L-Lysine-2HCl, 13C6 voor SILAC	Life Technologies	89988	Voor Heavy medium
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 voor SILAC	Life Technologies	89990	Voor Heavy medium
Complete, mini, EDTA-vrij	Roche Diagnostics	4693159
Ultrasoon Disruptor UD-201	Tomy Seiko
ChIP DNA Clean & Concentrator	Zymo Research	D5205
Dynabeads-Protein G	Life Technologies	DB10004
RNasin Plus RNase Inhibitor	Promega	N2611
Isogen II	Nippon Gene	311-07361
Direct-zol RNA Miniprep kit	Zymo Research	R2050
LTQ Orbitrap Velos	Thermo Fisher Scientific		Een onderdeel van een nanoLC-MS/MS-systeem voor MS-analyse
nanoLC	Advance, Michrom Bioresources		Een onderdeel van een nanoLC-MS/MS-systeem voor MS-analyse
HTC-PAL autosampler	CTC Analytics		Een onderdeel van een nanoLC-MS/MS-systeem voor MS-analyse