Beeldverwerking en flowcytometrie-gebaseerde analyse van de Cel standpunt en de celcyclus in 3D Melanoom Sferoïden

Kimberley A. Beaumont; Andrea Anfosso; Farzana Ahmed; Wolfgang Weninger; Nikolas K. Haass

doi:10.3791/53486

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Beeldverwerking en flowcytometrie-gebaseerde analyse van de Cel standpunt en de celcyclus in 3D Melanoom Sferoïden

12.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53486

⸱

28 december 2015

Kimberley A. Beaumont¹^,² , Andrea Anfosso¹^,² , Farzana Ahmed³ , Wolfgang Weninger^*¹^,⁴^,⁵ , Nikolas K. Haass^*¹^,³^,⁵

¹The Centenary Institute, ²Sydney Medical School, University of Sydney, ³The University of Queensland Diamantina Institute, Translational Research Institute, The University of Queensland, ⁴Department of Dermatology, Royal Prince Alfred Hospital, ⁵Discipline of Dermatology, University of Sydney

^* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven twee complementaire methoden met behulp van de fluorescentie ubiquitinatie celcyclus indicator (FUCCI) en beeldanalyse of flowcytometrie om cellen in de binnenste G1-gearresteerde en buitenste proliferatieve regio's van 3D-sferoïden te identificeren en isoleren.

Samenvatting

Driedimensionale (3D) tumor-sferoïden worden in kankeronderzoek gebruikt als een nauwkeuriger model van de in vivo tumormicro-omgeving, in vergelijking met traditionele tweedimensionale (2D) celcultuur. Het sferoïdmodel kan de effecten van cel-cel interactie, hypoxie en nutriëntendeprivatie, en drugpenetratie nabootsen. Een kenmerk van dit model is de ontwikkeling van een necrotisch centrum, omgeven door een ring van G1-geremde cellen, met proliferende cellen op de buitenste lagen van de sferoïd. Van belang in het kankerveld is hoe verschillende regio's van de sferoïd reageren op medicamenteuze therapieën evenals genetische of omgevingsmanipulatie. We beschrijven hier het gebruik van het fluoresceine ubiquitinatie celcyclus indicator (FUCCI) systeem samen met cytometry en beeldanalyse met behulp van commerciële software om de celcyclusstatus van cellen te karakteriseren met betrekking tot hun positie binnen melanoom-sferoïden. Deze methoden kunnen worden gebruikt om veranderingen in celcyclusstatus, gen/eiwitexpressie of celviabiliteit in verschillende subregio's van tumor-sferoïden te volgen over tijd en onder verschillende condities.

Inleiding

Multicellulaire sferoïden 3D zijn bekend als een tumormodel decennia, maar het is pas onlangs aan dat zij vaker gebruik als een in vitro model voor vele vaste kankers zijn gekomen. Ze worden steeds vaker gebruikt in high-throughput drug discovery schermen als intermediair tussen complexe, kostbare en tijdrovende in vivo modellen en de eenvoudige, goedkope 2D monolaag model ^1-6. Studies in 2D cultuur zijn vaak niet in staat om te worden gerepliceerd in vivo. Bolvormige modellen van vele soorten kanker kunnen de groeikenmerken, drug gevoeligheid, geneesmiddelpenetratie, cel-cel interacties, beperkte beschikbaarheid van zuu....