Optische controle van levende cellen elektrische activiteit van geconjugeerde polymeren

Samenvatting

Een methode voor stimulatie van in-vitro celcultuur elektrische activiteit met zichtbaar licht, gebaseerd op het gebruik van organische halfgeleidende polymeren, wordt beschreven.

Samenvatting

Hybride interfaces tussen organische halfgeleiders en levende weefsels vertegenwoordigen een nieuwe tool voor in-vitro en in-vivo toepassingen. Met name geconjugeerde polymeren vertonen verschillende optimale eigenschappen als substraten voor biologische systemen, zoals goede biocompatibiliteit, uitstekende mechanische eigenschappen, goedkope en eenvoudige verwerkingstechnologie en de mogelijkheid om te worden afgezet op lichte, dunne en flexibele substraten. Deze materialen zijn gebruikt voor cellulaire interfaces zoals neurale sondes, transistors voor excitatie en registratie van neurale activiteit, biosensoren en actuatoren voor medicijnafgifte. Recente experimenten hebben ook de mogelijkheid aangetoond om geconjugeerde polymeren te gebruiken voor volledig optische modulatie van de elektrische activiteit van cellen. Verschillende in-vitro studie gevallen zijn gerapporteerd, inclusief primaire neuronale netwerken, astrocyten en secundaire lijncellen. Bovendien is aangetoond dat signaalfoto-transductie gemedieerd door organische polymeren de lichtgevoeligheid in gedegenereerde netvliezen kan herstellen, wat suggereert dat deze apparaten in de toekomst kunnen worden gebruikt voor kunstmatige retinale prothesen. Kortom, lichtgevoelige geconjugeerde polymeren vertegenwoordigen een nieuwe aanpak voor optische modulatie van cellulaire activiteit.

In dit werk worden alle stappen beschreven die nodig zijn om een bio-polymeerinterface voor optische excitatie van levende cellen te fabriceren. De functie van de actieve interface is om het lichtstimulus om te zetten in een modulatie van het celmembraanpotentiaal. Als studie geval, nuttig voor in-vitro studies, wordt een polythiofeendunne film gebruikt als de functionele, lichtabsorberende laag, en Human Embryonic Kidney (HEK-293) cellen worden gebruikt als de biologische component van de interface. Praktische voorbeelden van succesvolle controle van het celmembraanpotentiaal bij stimulatie met lichtpulsen van verschillende duur worden geboden. In het bijzonder wordt aangetoond dat zowel depolariserende en hyperpolariserende effecten op het celmembraan kunnen worden bereikt, afhankelijk van de duur van het lichtstimulus. Het gerapporteerde protocol is van algemene geldigheid en kan eenvoudig worden uitgebreid naar andere biologische preparaten.

Inleiding

De mogelijkheid om de cellulaire activiteit een nauwkeurige ruimtelijke en temporele resolutie manipuleren is een belangrijke strategie neurowetenschappelijk onderzoek en bij de behandeling van neurologische en psychiatrische stoornissen. ¹ traditionele methoden berusten op elektrische stimulatie van cellen met behulp positioneringen nabijheid of in contact met het beoogde systeem ² die kunnen van verschillende complexiteit (enkele cel, cellulair netwerk hersencoupes in-vivo hersenweefsel). Tijdens de afgelopen eeuw, hebben het gebruik van de patch-clamp, metaal en substraat geïntegreerde elektroden een gedetailleerd beeld van de fysiologie en pathofysiologie van enkele neuronen en van de werkingsmechanismen van neurale netwerken voorzien. Echter, elektrische stimulatie lijdt aan belangrijke beperkingen. De eerste heeft betrekking op een algemeen slechte ruimtelijke resolutie door de fysieke afmetingen van de elektroden en hun vaste geometrie, die niet gemakkelijk kan worden aangepastcomplexe bestuurde achtige biologische weefsels. Ook kunnen problemen met de elektroden impedantie en overspraak tussen stimulatie en opnamesystemen de uiteindelijke signaal-ruisverhouding van de meting afnemen. ³ Aan de andere kant kan het gebruik van licht voor het stimuleren helpen vele beperkingen te overwinnen van de elektrische benadering. Ten eerste biedt het ongekende ruimtelijke (<1 um) en temporele resolutie (<1 msec), waardoor specifieke celtypen of zelfs sub-celcompartimenten richten. Bovendien is sterk niet-invasief aangezien het vermijdt contact komen met het weefsel van belang en ontwart stimulatie van opname. Bovendien kunnen zowel lichtsterkte en de golflengte nauwkeurig worden geregeld en daarmee diverse stimulatie protocollen kunnen worden toegepast. ^3,4

Echter, de meeste dierlijke cellen geen specifieke lichtgevoeligheid presenteren. Verschillende strategieën voor optische stimulation zijn dus voorgesteld, hetzij benutten lichtgevoelige moleculaire mediatoren nabij of binnen de cellen of middels fotoactieve extern apparaat geplaatst nabij de cel. De eerste categorie betreft endogene mechanismen zoals stimulatie via zichtbaar of infrarood (IR) licht, alsmede het gebruik van hetzij fotoisomeriseerbare / splitsbare verbindingen of de genetische expressie van lichtgevoelige moleculaire actuators (optogenetics). De laatste klasse omvat technieken exogene stimulering bereikt met het gebruik van anorganische nano / micro-deeltjes of fotogeleidende siliciumsubstraten. ⁵ Desalniettemin, al deze systemen lichte kanten en nadelen. Vooral endogene opname van cellen in het zichtbare gebied zwak en onbetrouwbaar, en de gelijktijdige vorming van reactieve zuurstofsoorten kan schadelijk zijn voor de cel. In het algemeen wordt IR gebruikt voor het induceren van lokale thermische opwarming door waterabsorptie, maar de extinctiecoëfficiënt van water klein is, waardoor het nodig strong infrarood licht (van tientallen tot honderden W / mm ²⁾ dat moeilijk te leveren via standaardmicroscoop optica en kunnen veiligheidsoverwegingen in vivo toepassingen opleveren. Anderzijds, foto-schakelbare kooien verbindingen hebben een tijd beperkte werking en vereisen vaak UV licht dat moeilijk te leveren als gevolg van beperkte weefselpenetratie. Verder zij lijden aan diffusieprobleem van de geactiveerde verbindingen bij fotolyse buiten de verlichte zone. Tenslotte hebben optogenetic hulpmiddelen mogen wetenschappers subpopulatie specifieke cellulaire en sub-compartimenten targeten en worden sterk opkomende als een van de belangrijkste technologieën neurowetenschappelijk onderzoek. Echter, het inbrengen van een exogeen DNA-segment via een virale vector roept belangrijke veiligheidskwesties, met name met het oog op goedkeuring op menselijke patiënten. ^5,6 Om deze redenen, onderzoek naar nieuwe materialen en apparaten staat cel optische manipulatie is een zeer hot topic.

Onlangs is een nieuwaanpak gebaseerd op het gebruik van lichtgevoelige geconjugeerde polymeren, efficiënt kunnen transduceren optische stimulus in een modulatie van cel elektrische activiteit, is voorgesteld. De cel stimulatie door Polymer fotoexcitatie (CSPP) techniek maakt gebruik van een groot aantal key-enabling typische kenmerken van organische halfgeleiders: ze zijn intrinsiek gevoelig voor licht in het zichtbare ^gebied, 7 ze zijn biocompatibel, zacht en gelijkvormig en hun mechanische flexibiliteit maakt een intieme-interface met weefsel zowel in-vitro en in-vivo ^8-10. Daarnaast, kunnen zij gemakkelijk worden gefunctionaliseerd om beter aan te passen aan de interface met levende cellen en specifieke excitatie schakelen indringende en sensing capaciteiten. ^11,12 Bovendien ondersteunen zij zowel elektronische als ionentransport, waardoor ze ideaal voor de combinatie Elektronica ad biologie. ^13,14 Interessant is dat ze werken in fotovoltaïsche modus, het vermijden van de noodzaak een extern voorspanning f toepassingof efficiënte cel optische stimulatie. ¹⁵

De betrouwbaarheid van CSPP techniek is eerder aangetoond in diverse systemen, waaronder primaire neuronen, ^15,16 astrocyten, ¹⁷ secundaire cellijnen ^{18 en} geëxplanteerd netvlies weefsels. ¹⁶ In dit werk, alle stappen die nodig zijn om een lichtgevoelige bio-polymeer fabriceren -interface ¹⁹ voor optische stimulatie van in vitro-systemen worden beschreven. Als een studie geval een prototypische organische fotovoltaïsche mix van regio-reguliere poly (3-hexylthiophene) (rr-P3HT), functioneren als het elektron donor, en fenyl-C61-boterzuur-zuur-methyl ester (PCBM), als de elektronenacceptor wordt toegepast. Als het biologische systeem, zijn humane embryonale nier (HEK-293) cellen gebruikt. Een voorbeeld van een fotostimulering protocol met de relatieve opname van celactiviteit via elektrofysiologische metingen wordt geleverd.

De beschreven platformechter algemene geldigheid, en kan gemakkelijk worden uitgebreid naar het gebruik van andere geconjugeerde polymeren (door juiste instelling van de oplossing voorbereidingsproces en de depositie parameters), verschillende celtypen (door naar behoren het veranderen van de celkweek protocol, plating procedure en de gevraagde voor mobiele zaaien en proliferatie) en verschillende stimulatie protocollen (licht golflengte, stimuli frequentie en duur, foto-excitatie dichtheid).

Protocol

1. Voorbereiding van Fotoactieve Substrates

1. Bereid een P3HT: PCBM oplossing (1: 1 w / w) in chloorbenzeen bij een P3HT concentratie van 20 g / l. Meng de oplossing met een magnetische roerder gedurende ten minste 4 uur bij 60 ° C. Beschouw een volume van 150 ul oplossing voor elk substraat te bereiden.
2. Clean-ITO beklede objectglaasjes _(Rs = 10 Ω / vierkant, 18x18 mm ^2, dikte 170 pm) met opeenvolgende baden gedeïoniseerd water, aceton en isopropanol in een sonicator (10 min voor elke stap). Droog de dekglaasjes met een stikstof pistool. Doe de monsters in een plasma cleaner bij 100 W vermogen gedurende 10 min.
3. Deponeren van een dunne film van de actieve laag op de gereinigde substraten via spin-coating.
   1. Met een diamantpunt, snijd een microscoop glasplaatje, (≈ dikte 1 mm) aan dezelfde laterale afmetingen van de ITO-beklede substraten. Verwijder de P3HT: PCBM oplossing van de verwarmingsplaat en laat het afkoelen tot omgevingstemperatuur.
   2. Stel een twee-steps spin-coater programma: i) 30 sec bij 800 rpm; ii) 30 sec bij 1600 rpm. Plaats de dia op de boorkop van de spin-coater en start de stofzuiger om het te repareren. Een druppel van aceton op de dia en het gereinigde substraat met de ITO-gecoate zijde naar boven. Start de spin-coater draaien om zich te ontdoen van de overtollige aceton.
   3. Put 150 ui P3HT: PCBM oplossing op de substraten en opnieuw beginnen de spin-coater (hetzelfde protocol in 1.3.2).
   4. Na de spin-coater is voltooid, verwijdert u het monster en voorzichtig los te maken van de gecoate substraat van het glaasje. Reinig de achterkant van het substraat met een cleanroom doekje gedrenkt in aceton.
      Opmerking: De fotoactieve substraten kunnen worden bewaard paar dagen in een donkere doos tot gebruik. Voor langere periodes, bewaar ze in een dashboardkastje met een inert gas.

2. Voorbereiding van celcultuurmedium en Elektrofysiologie Solutions

1. Bereid de volledige groeimedium (CGM) voorHEK-293-cellen: Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) niet warmte geïnactiveerd, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine. Steriliseer het medium met een 0,2 urn filtratie en bewaar bij 4 ° C.
2. Bereid de extracellulaire oplossing in ultrapuur water (concentraties in mm): 135 NaCl, 5,4 KCl, 5 HEPES, 10 Glucose, 1,8 _CaCl2, 1 _MgCl2. Stel de pH tot 7,4 met NaOH. Steriliseer de oplossing met een 0,2 urn filtratie en bewaar bij 4 ° C.
3. Bereid de intracellulaire oplossing in ultrazuiver water (concentraties in mM): 12 KCl, 125 K-gluconaat, 1 _MgCl2, 0,1 _CaCl2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 _ATP-Na2. Merk op dat ATP-Na ₂ is warmtegevoelig en voeg deze laatste. Stel de pH tot 7,4 met NaOH. Steriliseer de oplossing met een 0,2 urn filtersysteem, aliquot in 1 ml buizen en bewaar bij -20 ° C.

3. Plating HEK-293 cellende actieve substraten

1. Plaats de fotoactieve substraat in een glazen beker bedekt met aluminium of een afgesloten petrischaal en in een oven bij 120 ° C gedurende 2 uur voor sterilisatie. Vanaf dit moment, voeren alle bewerkingen in steriele omstandigheden. Zet de monsters in een steriele kap en laat ze afkoelen.
2. Coat de fotoactieve substraat een hechtlaag aan het oppervlak hydrofobiciteit verminderen en celadhesie bevorderen.
   1. Plaats de actieve substraten in een P35 petrischaal of een 6 multiwell plaat. Gezien de hydrofobiciteit van het geconjugeerde polymeerlaag, maak een polydimethylsiloxaan (PDMS) en het monster vast en beperken de oplossingen.
      1. Meng PDMS en katalysator in een 10: 1 verhouding met een glazen staaf naar een viskeuze slurry te verkrijgen.
      2. Giet de slurry in een 6 multiwell plaat, het afgeven van een hoeveelheid die voldoende is om de helft van iedere afdekken.
      3. Wacht PDMS polymerisatie bij kamertemperatuur.
      4. Snijd de uitgeharde PDMS in het midden voor obtaining een vierkante vorm van dezelfde afmeting van het polymeer monster.
      5. Steriliseer de PDMS putten door onderdompeling in een 70% ethanol-water mengsel gedurende tenminste 30 minuten.
   2. Bij gebruik van de PDMS goed, krassen op de fotoactieve laag langs de gehele rand van de put met spitse pincet, zodat losraken van de gehele laag te voorkomen bij het verwijderen van PDMS lang na celkweek.
   3. Bedek het gehele oppervlak van elk monster met een fibronectine-oplossing (2 mg / l in PBS). Een volume tussen 500-750 ul per monster is meestal voldoende als een PDMS goed wordt gebruikt (helder oppervlak van de put: 15x15 mm ^2). Zonder de PDMS goed, ongeveer 2 ml van fibronectine oplossing nodig is om het monster volledig ondergedompeld zijn; let dat de ondergrond niet zweven, terwijl het toevoegen van de oplossing. Incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende tenminste 1 uur.
   4. Verwijder de fibronectine-oplossing met een glazen pipet en eenmaal wassen met 2 ml PBS.
3. Plat HEK-293-cellen op de fibronectine-behandelde monsters bij een dichtheid van 15.000 cellen / ^cm2 in compleet groeimedium. Gebruik een volume van 750-1000 pl van CGM voor elk monster als een PDMS goed gebruikt, anders 2-3 ml CGM nodig. Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% _CO2 gedurende 24-48 uur.

4. Optische Stimulatie Protocol en elektrofysiologische metingen

1. Zet de extracellulaire oplossing in een waterbad bij 37 ° C te thermaliseren; dooi de intracellulaire oplossing, zet het in een 1 ml spuit met een 34 gauge naald en houd het in contact komt met ijs om degradatie van de ATP te voorkomen.
2. Neem een ​​cel-gecoate substraat uit de incubator, zorgvuldig verwijderen van de PDMS goed indien aanwezig. Verwijder het groeimedium met een glazen pipet en spoel het monster met extracellulaire oplossing. Overgaan langzaam naar cel onthechting te voorkomen.
3. Zet het apparaat in de monster-houder van de elektrofysiologie station met extracellulaire solution en de referentie-elektrode. Bereid vers glas micropipetten voor patch-klem met een trekker (ideaal weerstand in het bereik 2-4 MQ). Vul de helft van de pipet met intracellulaire oplossing en monteren op de micromanipulator.
4. Kijk voor een gezonde cel te patchen op het apparaat. Om ongewenste excitatie van de fotoactieve substraat te voorkomen, gebruikt IR verlichting voor beeldvorming, het plaatsen van een lange-golflengte doorlaatfilter (bijvoorbeeld een cut golflengte λ = 750 nm worden gebruikt voor polymeren absorberen in het zichtbare) voor de microscoop belichtingstoestel.
5. Patch de geselecteerde cel en het gewenste protocol voor optische stimulatie toepassing leveren licht op het monster via de fluorescentie excitatie weg van de microscoop (Figuur 1). Een gedetailleerde beschrijving van de patch-clamp-protocol is te vinden in referentie 20.
   1. Plaats de patch pipet in de nabijheid van het celmembraan een micrometrische manipulator. Tijdens het positioneren van toepassing overpressure de pipet om vuil kleven aan het uiteinde te voorkomen. De pipet moet enkele microns boven de cel.
   2. Start verlagen van de pipet naar het celmembraan, terwijl het regelen van de pipet weerstand op de patch besturingssoftware. Wanneer de pipet weerstand van 1 MQ is toegenomen, verwijdert de overdruk uit de pipet onder toepassing van een zachte zuiging, om de gigaseal tussen de pipet en het celmembraan te vormen (dat wil zeggen de gemeten weerstand moet toenemen met waarden groter dan 1 GQ) .
   3. Breng een negatieve potentiaal op de pipet dicht bij de verwachte cel rustpotentiaal (voor HEK293 cel een potentiaal van -40 mV worden gebruikt) om de afdichting te stabiliseren. Compenseren capacitieve transiënten vanwege de pipet capaciteit met relatief opdrachten op de patch versterker en / of de pleister besturingssoftware.
   4. Breek het membraan elektrisch toegang tot het cytoplasma toe door een korte, intense afzuiging pulsede pipet. Stel de patch clamp versterker actuele stand (I = 0, dat wil zeggen zonder stroom geïnjecteerd in de cel) het celmembraanpotentiaal volgen. Wacht enkele minuten om te zien of de celpotentiaal stabiel.
   5. Breng de gewenste belichting protocol naar de cel en neem het effect op de membraanpotentiaal.
      Opmerking: De verlichting kan worden afgegeven aan het monster ofwel van onderen of van boven, afhankelijk van de microscoop architectuur.
      1. Selecteer een excitatiegolflengte die goed wordt geabsorbeerd door het actieve materiaal; de P3HT: PCBM mengsel, kan een golflengte 450-600 nm worden gebruikt. Geschikte foto-excitatie dichtheden in het bereik van 10-100 mW / ^mm2.
         Opmerking: Korte lichtpulsen (hierna 10-20 msec) leiden tot een tijdelijke depolarisatie van de cel, terwijl bij langdurige belichting (honderden milliseconden of meer pulsen) een aanhoudende hyperpolarisatie wordt waargenomen tot het licht wordt uitgeschakeld.

Resultaten

Cellen kunnen eenvoudig worden gekweekt op P3HT: PCBM substraten, mits er een geschikte hechtlaag is aangebracht (zoals fibronectine gebruikt in stap 3.2 van de beschreven protocol). P3HT: PCBM optische absorptie pieken in het groene deel van het zichtbare spectrum; maar andere lichtgevoelige geconjugeerde polymeren kunnen worden geselecteerd volgens de gewenste fotostimule- golflengte bereik (figuur 2). Biocompatibiliteit van deze substraten is aangetoond niet alleen ce...

Discussie

Kritische stappen van de gerapporteerde protocol voor in-vitro optische stimulatie van cellen voornamelijk betrekking op de keuze van de lichtgevoelige polymeer, de thermische sterilisatie parameters, de intensiteit en de duur van het licht stimuli. Een P3HT: PCBM dunne film werd hier gekozen, omdat het garandeert een goede tijd en elektrochemische stabiliteit. Echter, men moet opmerken dat niet alle lichtgevoelige polymeren analoge optredens meer specifiek kan bieden, ²² bij belichting. Bovendien, i...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
rr-P3HT	Sigma Aldrich	698989-5G
ITO-gecoate substraten	Nano-CS	IT10300100
Fibronectin	Sigma Aldrich	F1141
chlorobenzeen	Sigma Aldrich	319996
PCBM	Nano-C	Nano-CPCBM-BF
aceton	Sigma Aldrich	270725
isopropyl alcohol	Sigma Aldrich	563935
HEK-cellen	LGC standards srl	ATCC-CRL-1573
HEPES	Sigma Aldrich	H0887
PBS	Sigma Aldrich	P5244
E-MEM	LGC standards srl	ATCC-30-2003
EDTA	Sigma Aldrich	E8008-
FBS	LGC standards srl	ATCC-30-2020