Functionele klonen behulp van een Xenopus Eicel Expression System

Summary

We beschrijven een Xenopus eicel en dierlijk kapsysteem voor de expressie-klonering van genen die in staat zijn om een respons te induceren in competent ectoderm, en bespreken technieken voor de daaropvolgende analyse van dergelijke genen. Dit systeem is nuttig bij de functionele identificatie van een breed scala aan genproducten.

Abstract

De identificatie van genen die verantwoordelijk zijn voor embryonale inductie stelt een aantal uitdagingen; om er een paar te noemen, kunnen uitgescheiden moleculen van belang laag in abundantie zijn, kunnen ze niet uitgescheiden worden maar vastgebonden zijn aan de signaalcel(len), of kunnen ze de aanwezigheid van bindingspartners of stroomopwaartse regulerende moleculen vereisen. Dus in een zoektocht naar genproducten die in staat zijn om een vroege lens-inductieve respons in competent ectoderm teweeg te brengen, gebruikten we een expressie-kloonse systeem dat de identificatie van paracriene of juxtacrine factoren evenals transcriptionele of andere regulerende eiwitten zou toestaan. Pools van mRNA werden geïnjecteerd in Xenopus eicellen, en het reagerende weefsel werd direct op de eicellen geplaatst en geco-cultiveerd. Na functionele kloning van ldb1 uit een neurale plaat-stadium cDNA-bibliotheek op basis van zijn vermogen om de expressie van de vroege lensplacode marker foxe3 in lens-competent dierlijk kap-ectoderm teweeg te brengen, karakteriseerden we het mRNA-expressiepatroon, en beoordeelden we de ontwikkelingsprogressie na overexpressie of knockdown van ldb1. Dit systeem is geschikt in een zeer brede verscheidenheid aan contexten waar identificatie van een inductor of zijn stroomopwaartse regulerende moleculen wordt gezocht met behulp van een functioneel antwoord in competent weefsel.

Introduction

Voorwaartse genetische benaderingen om genen van belang te identificeren door hun functie of functieverlies^1,2 zijn een integraal onderdeel van het begrijpen van complexe patroonontwikkelingsgebeurtenissen. Gecombineerd met krachtige omgekeerde genetische technieken die beschikbaar zijn voor een steeds groter wordend scala aan systemen en onderzoekers^3-5, is het nu mogelijk om genen met een sleutelfunctie in een pad te identificeren en vervolgens die functie op cellulair niveau en in interactie met andere genproducten te verduidelijken. Een benadering voor het functioneel identificeren van genen van belang die in het verleden veel belangrijke ontdekkingen heeft opgeleverd, is expressie-klonen^6,7.

Ons recente doel⁸ was om vroege lens-inductieve factoren te identificeren, aangezien is aangetoond dat de initiële stappen in het lens-inductieve proces van gewervelde dieren al in de gastrula-stadia optreden. Hiervoor gebruikten we het tijdelijk lens-competente⁹ dierlijke kap-ectoderm (stadium 11-11.5¹⁰) van Xenopus-embryo's als reagerend weefsel voor inductie, en de stadië VI Xenopus-eiceldon als bron van productie voor de inducerende factoren.

Het volgende protocol is gebaseerd op de expressie-klonen en sib-selectieprotocollen van Smith en Harland^6,7, ook met succes gebruikt door anderen^11-13. In ons oöcytexpressiesysteem (voor het eerst gebruikt voor de productie van inducerende factoren door Lustig en Kirschner¹⁴), worden groepen geïnjecteerde transcripten die rechtstreeks of indirect de oöcyten kunnen laten factoren produceren die een lens-inductieve respons in dierlijk kap-ectoderm veroorzaken, geselecteerd en geïdentificeerd. Aangezien het systeem nuttig is voor het rechtstreeks tot expressie brengen van uitgescheiden inducerende moleculen (oöcyt-geïnjecteerd INHBB mRNA veroorzaakt mesoderminductie in mesoderm-competent dierlijk kap-ectoderm⁸), verwachtten we oorspronkelijk dat de screeningsprocedure voornamelijk nuttig zou zijn voor de identificatie van paracriene factoren. Aangezien we echter een nucleair factor in onze screening hebben geïdentificeerd (ldb1⁸), is het duidelijk dat het systeem kan worden gebruikt om een breed scala aan moleculen te identificeren, zoals transcriptionele of translationele regulerende factoren, miRNA's, cofactoren of juxtacriene factoren.

Protocol

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de Universiteit van Virginia Institutional Animal Care en gebruik Comite.

Opmerking: Figuur 1 toont een schematisch overzicht van de experimentele procedures.

1. Bereiding van eicellen

1. Pre-prime X. laevis vrouwen met 150 U van drachtige merrie Serum Gonadotropin (PMSG) ongeveer een week van tevoren van eicel isolatie. Injecteer 1 ml 150 U / ml PMSG in dorsale lymfe zak met 1 cc steriele spuit met een 29 G naald.
2. Bereid oplossingen voor injectie en eicel eicel dieren cap assay.
   1. Bereid Ca ⁺⁺ / Mg ⁺⁺ -vrij OR2 (OR2-): 82 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 1,5 mM Na ₂ HPO _4, 50 mM HEPES pH 7,2.
   2. Bereid OR2: OR2- plus 1 mM _CaCl2 en 1 mM _MgCl2.
   3. Bereid OCM: 60% Leibovitz L15, 0,4 mg / ml BSA, 100 ug / ml gentamycine, pH 7,8.
   4. Prepare 1x MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCI, 0,7 mM _CaCl2, 1 mM MgSO _4, 5 mM HEPES (pH 7,8), 2,5 mM NaHCO _3.
   5. Bereid 3% Ficoll in 1x MBS.
   6. Bereid 1x NAM: 110 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM Ca (NO _{3) 2,} 1 mM _MgSO4, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCO _3, 2 mM Na ₃ PO _4, pH 7,4.
3. Verdoven van de vrouw in een oplossing 0,03% van ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaatzout (MS222) in 0,1x MBS (eerste ontbinden 0,3 g MS222 in 10 ml 95% ethanol en vervolgens verdund in 1 L 0,1x MBS) door het plaatsen van kikker in oplossing voor 10 - 15 minuten of tot reageert.
   1. Controleer of de verdoving is voltooid door te draaien verdoofde kikker op zijn rug om ervoor te zorgen dat niet reageert (onvolledig verdoofde kikkers bewegen ledematen of draai lichaam over).
4. Chirurgisch isoleren ovariale fragmenten door een abdominale incisie door de huid en lichaamswand met scalpel, isoleren eierstokweefsel met een pinceten schaar. Plaats ovariële fragmenten in OR2-. Sluit de lichaamswand met een 3-0 zijden hechtdraad op een 24 mm gekromde naald en afzonderlijk sluit de huid met dezelfde hechtingen. Sta herstel van de vrouwelijke in 1 g / l aquarium zout water.
5. Met behulp van fijne tang, scheur eierstokweefsel in kleine (10-20 eicellen) stukken en transfer naar verse OR2-.
6. Defolliculate ovariële fragmenten in 2,0 mg / ml collagenase A in OR2- door roeren zachtjes op shaker gedurende 1 uur, het overbrengen van de frisse collagenase en roeren gedurende een extra uur.
7. Was eicellen 10 keer in OR2 [met Ca ⁺⁺ / Mg ^++], teruggooien kleinere eicellen.
8. Was eicellen in OCM twee keer en over te dragen aan verse OCM. Isoleer Fase VI oöcyten grootteklasse bij visuele inspectie en gooi onrijpe (kleiner) oöcyten: Fase VI oöcyten zijn groter dan onrijpe eicellen met nog pigmentatie in het dier halfrond en ongeveer 1,2-1,4 mm in diameter.
9. Behouden eicellen bij 18-20 ° C in OCM vóór injectie. Opmerking: Agarose-gecoate petrischalen kunnen worden gebruikt om het kleven van eicellen minimaliseren schotel.

2. Injectie van Bibliotheek Afschriften

1. Bereid een directionele cDNA-bibliotheek ¹⁵ gebruikt RNA geëxtraheerd in een geschikt stadium van ontwikkeling (bijvoorbeeld neurale plaat stap 14 ^10). Koop een cDNA bibliotheek of de bouw van een met behulp van een commerciële kit per het overzicht in de vier stappen hieronder.
   1. Isoleer ongeveer 5 ug mRNA met behulp van een product te verrijken poly (A) + RNA (zie Tabel Materials) en volgens instructies van de fabrikant. Opmerking: De transcripten worden gebruikt om de cDNA-bibliotheek kan worden beperkt tot een inducerend weefsel te produceren (zoals de neurale plaat na microdissectie van het gewenste weefsel), of kunnen uit vol embryo's in een bepaalde fase.
   2. Opbrengst cDNA met een commerciële kit volgens de aanwijzingen van de fabrikant.
   3. Ligeren ongeveer 20 ng cDNA in een vector die bij de commerciële kit of een andere geschikte vector. Een geschikte plasmidevector sequenties voor stabiliteit van mRNA als 5 'β-globine en 3 poly (A) sequenties (pCS2 +, pTnT, pCS105).
   4. Transformeren ligatie in competente bacteriële cellen met behulp van aanbevolen protocol leverancier voor heat shock transformatie.
      Opmerking: Als alternatief kan een verzameling van open reading frame (ORFeoom) klonen is in de handel verkrijgbaar en kunnen worden gebruikt om transcripten voor injectie genereren.
2. Bereid 10 verzamelingen van plasmiden van 10 om 10 ^{3 4} complexiteit (10 ⁴ 10 ⁵ om de totale complexiteit). Dit vertegenwoordigt 10 platen met 1000 - 10.000 kolonies per.
   1. Plaat bibliotheek cultuur op 10 15-cm LB-ampicilline platen, groeien 12-18 uur bij 37 ° C, en de kolonies van elkaar door zachte druk met een glas spreader verzamelen in 7 ml LB.
   2. Bereid een glycerol voorraad van 0,5 ml (voeg toe aan 0,2 ml steriele glycerol en bewaar bij -20 &# 730, C), en gebruikt de resterende 6,5 ml DNA te bereiden met een in de handel verkrijgbare DNA miniprep kit volgens de aanwijzingen van de fabrikant.
3. Lineariseren samengevoegd plasmide DNA (1,0 - 2,0 ug) met geschikte restrictie-enzym digest ¹⁶ bij 37 ° C gedurende 1 - 1,5 uur. Isoleer het gelineariseerde DNA met fenol / chloroform extractie gevolgd door ethanol precipitatie en resuspensie in water volgens de specificaties van de RNA-polymerase kit gebruikt. Synthetiseren sense RNA met een commerciële kit RNA polymerase volgens de aanwijzingen van de fabrikant.
4. Bereid naalden voor micro-injectie (met een naald trekker met glazen capillaire buis) van ongeveer 20 urn diameter; meten naald tips op een samengestelde microscoop met een gekalibreerde oculaire micrometer. Opmerking: Naald puller instellingen moeten empirisch vastbesloten om een ​​naald te produceren met een fijne punt zodanig dat wanneer gebroken met fijne tang levert de gewenste tip grootte.
5. Bereid (push klei inuniforme laag op de bodem van de schaal) klei bekleed 35 x 10 mm petrischaaltjes met parallelle groeven om eicellen in plaats te houden tijdens de micro-injectie; produceren groeven met een winkelcentrum sonde of pasteurpipet gefuseerd aan het uiteinde in vlam. Als alternatief voor klei bereiden agarose schotels maken indrukkingen met een elastomeer matrijs ^17. Transfer eicellen met een brede boring pipet tot 3% Ficoll in 1 x MBS (ongeveer 2 ml) in rijen in de klei beklede schotels.
6. Met behulp van microinjector, vul naald met 1 ng / nl RNA en pas evenwicht tot lichte positieve druk te produceren (om te voorkomen dat de opstelling van de eicel cytoplasma).
7. Injecteren eicellen met ongeveer 20 nl RNA in de equatoriale regio. Laat 1 uur voor geïnjecteerde oöcyten te blijven Ficoll-MBS, vervolgens over voorzichtig 1x MBS. Incubeer gedurende 8 - 24 uur bij 20 ° C vóór dier cap assay.

3. Animal Cap Assay

1. Bereid 3 / 4x NAM en het verkrijgen van fijne tang, haar loop, gebogen dekglaasje fragmenten, met klei bekleed dishes met komvormige inkepingen om eicellen te houden. Maak gebogen dekglaasje fragmenten door het breken van elkaar dekglaasjes in kleine fragmenten (ongeveer 1-2 mm x 2 - 4 mm) en passeren van de vlam tot randen polish en hangen, het produceren van een gebogen stuk.
2. Bevruchten X. laevis eieren ¹⁸ door middel van in vitro of natuurlijke bevruchting en cultuur podia gastrula (10 - 11 uur na de bevruchting bij RT) in 0,1x MBS voorafgaand aan het sorteren op het podium; verzamel mid-gastrulastadium (fase 11-11,5) ¹⁰ embryo's.
3. Transfer embryo's naar een petrischaaltje ongeveer de helft vol met 3 / 4x NAM. Met behulp van twee paar fijne tang, verwijder de bevruchting (vitelline) membraan van gastrulae.
4. Transfer eicellen tot 3 / 4x NAM (ongeveer 2 ml) in klei bekleed gerechten en immobiliseren in individuele indrukken in de klei, het produceren van indrukken individuele embryo geschikt als groeven hierboven zijn beschreven.
5. Transfer embryo's naar de klei beklede gerechten en snijd dier caps off gastrulae gebruik van twee paar fijne tang. Zorg ervoor dat dier dop ectoderm alleen en niet equatoriale weefsel ¹⁸ te isoleren.
6. Plaats een dier dop op het dier halfrond van elke oöcyt met het binnenvlak van het dier dop met de eicel. Houd recombinanten elkaar door toepassing gebogen glazen dekglaasje fragment en het aanbrengen neerwaartse druk op het glas, afvlakking van de ectoderm als dekglaasje contacten klei (dier caps kunnen openen met de binnenlaag blootgesteld aan het oppervlak van de eicel tot 6 blijven - 8 uur of langer ).
   Opmerking: Als alternatief, plaats het dier dop in een klei inkeping met zijn binnenste oppervlak naar boven en zet een eicel op de dop; zet de recombinante met kleine uitbreidingen van klei.
7. Kweken bij 20 ° C totdat control embryo reach gewenst stadium voor de test.
8. Aparte recombinant door het verwijderen van dekglaasje / klei en isoleren ectoderm met een tang en een haar lus.
9. Fix ectodermale fragmenten gedurende 1 uur in MEMFA (3,8%formaldehyde in MEM [0,1 M MOPS pH 7,4, 2 mM EGTA en 1 mM MgSO _4]).
10. Transfer fragmenten (en controle embryo's) uit MEMFA in ethanol en bewaar bij -20 ° C.

4. Analyse van de respons in Ectoderm door in situ hybridisatie (ISH)

1. Bereid oplossingen voor het ISH.
   1. Bereid 1x PBS: 0,01 M fosfaat gebufferde zoutoplossing, 0,138 M NaCl, pH 7,4
   2. Bereid PBS-Tween (PTW): 1x PBS, 0,1% Tween-20
   3. Bereid 100x Denhart's oplossing: 2% BSA, 2% polyvinylpyrrolidon, 2% Ficoll
   4. Bereid Hybridization Buffer: 50% formamide, 5x SSC, 1 mg / ml Torula gist RNA, 1 ug / ml Heparine, 1 x Denhart's oplossing, 0,1% Tween-20, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA, _DEPC-H2O
   5. Bereid maleïnezuur buffer (MAB): 100 mM maleïnezuur, 150 mM NaCl, pH 7,5
   6. Bereid MAB + blok: MAB, 2% blokkerende reagens (warmte tot 60 ° C op te lossen)
   7. Bereid alkalisch fosfatase (AP) buffer: 100 mM TrispH 9,5, 50 mM _MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween, dH ₂ O
2. Maak de RNA-Probe.
   1. Met behulp van een commercieel RNA polymerase kit en graven-NTP mix, aan een 1,5 ml buis (50 pi reactie): 25,5 pi _DEPC-H2O, 10 ui 5X Transcription Buffer, 2,5 gl 10x dig-NTP mix, 5 pl 100 mM DTT, 2 pl RNAsin, 2 pl gelineariseerd DNA matrijs (~ 1 ug / ul), 3 ui RNA polymerase en incubeer 37 ° C gedurende 90 min.
   2. Voeg 2 pi RNA Polymerase en incubeer 37 C gedurende 60 min.
   3. Controle 2 pl reactiemengsel op 1% agarose gel.
   4. Voeg 1 ul RQ1 RNase-Free DNase en incubeer 37 ° C gedurende 20 minuten.
   5. Precipiteren de probe door toevoegen 50 ui _DEPC-H2O, 25 gl 10 M ammoniumacetaat en 313 pl ethanol. Bewaren bij -20 ° C gedurende de nacht (O / N), dan herstellen RNA door centrifugeren bij 13.800 xg gedurende 20 minuten. Wassen met 500 ul 75% ethanol, kort draaien, verwijderenethanol en laat de pellet aan de lucht drogen. Voeg 50 pi _DEPC-H2O
   6. Voeg Hybridization Buffer tot een uiteindelijke concentratie van ~ 0,5 ug / ul.
3. Bereid weefsel voor hybridisatie. Tenzij anders vermeld, vul ampullen boven met elke oplossing veranderingen beschreven (ongeveer 4 ml).
   1. Verwijder ethanol uit flesjes en overdracht van embryo's in 75% ethanol / PTW, dan is 50% ethanol / PTW gedurende 10 minuten elk, horizontaal op de wip.
   2. Was drie keer in PTW gedurende 5 minuten elk op rocker.
   3. Transfer naar 10 ug / ul proteïnase K behandeling PTW; rots buizen verticaal 15 min.
   4. Twee keer 10 minuten elk spoelen in 0,1 M Triethanolamine pH 7,8 - rock buizen verticaal.
   5. Voeg 12,5 pi azijnzuuranhydride buizen en Rock verticaal 5 min. Herhaal extra 12,5 pi azijnzuuranhydride gedurende 5 min.
   6. Wassen in PTW 5 min verticaal op rocker.
   7. Refix in 4% paraformaldehyde 20 min op rocker. Heat Hybridization Buffertot 60 ˚C.
   8. Was drie keer in PTW gedurende 5 minuten elk op rocker.
   9. Verwijder alles behalve ~ 1 ml PTW van elke buis en voeg 250 ul Hyb Buffer; zachtjes wervelen buizen te mengen. Rock buizen verticaal 5 min.
   10. Vervangen door 60 ˚C Hyb Buffer (0,5 ml) en schud zachtjes op 60 ° C 10 min. Vervang met verse Hyb Buffer en schud bij 60 ˚C twee tot 4 uur.
   11. Warmtesonde (1 ml bij 0,5 ug / ul in Hyb buffer) tot 60 ° C (3 min). Verwijder Hyb Buffer toevoegen probe buizen. Schud zachtjes O / N op 60 ˚C.
4. Bereid weefsel voor antilichaam.
   1. Warm Hyb buffer en 2 x SSC + 0,1% Tween-20 oplossing tot 60 ° C.
   2. Vervang sonde oplossing Hyb Buffer (sparen sondes bij -20 ° C gedurende 2 - 3x hergebruik). Wassen bij 60 ° C gedurende 10 min.
   3. Was drie keer met 60 ° C in 2 x SSC-Tween (20 min elk onder roeren).
   4. Was drie keer met 60 ° C in 0,2 x SSC-Tween (20 min elk onder roeren).
   5. Was tweemaal in MAB (RT) gedurende 15 minuten elk horizontaal op rocker.
   6. Voeg 1 ml MAB + blok. Was 2 uur verticaal op rocker.
   7. Transfer naar 1 ml MAB + blok met daarin een 1/2000 Anti-digoxygenine-AP. Rock verticaal op 4 CO / N.
5. Bereid weefsel voor Color reagens.
   1. Vervang antilichaam oplossing met MAB; Was driemaal in MAB 5 minuten elk horizontaal op rocker.
   2. Was driemaal MAB 1 uur elk horizontaal op rocker.
   3. Was tweemaal in AP-buffer 10 min elk horizontaal op rocker.
   4. Transfer weefsel om meerdere goed plastic bakje, verwijder AP buffer en voeg BM Purple reagens (~ 1 ml). Laat reactie te laten verlopen in het donker 5 min op O / N.
   5. Wanneer geschikte kleuring wordt bereikt, transfer weefsel flacons van PTW. Was twee keer 10 minuten elk in PTW op rocker.
   6. Fix in oplossing Bouin bij 4 CO / N op de rocker.
   7. Spoel Bouin met drie 70% ethanol / 30% PTW wasbeurten bij RT. Overgaan to beeld vast te leggen met behulp van epi-verlichting en een microscoop gemonteerde camera, bleken indien nodig ^18.

5. Sib Selectie en klonen

1. Selecteer zwembad met de hoogste activiteit (grootste respons in ectodermale weefsel).
2. Titreer (verdunnen met LB passende dichtheid) de glycerol voorraad voor het zwembad met de hoogste activiteit en de plaat uit tien nieuwe platen met ongeveer een tiende van de kolonies van de vorige stap (met behulp van deel 2 in protocol hierboven).
3. Verminder grootte van het zwembad totdat activiteit wordt herleid tot enkele kolonie.
4. Verkrijgen DNA-sequentie met standaard primers in de vector.

Results

In reactie op expressie van mRNA geïnjecteerd in oöcyten, reageert dierlijk cap weefsel werd onderzocht op expressie van otx2 door in situ hybridisatie (Figuur 2 en Tabel 1) otx2 wordt uitgedrukt in de vermoedelijke lens ectoderm (PLE) van neurale buis sluiting door lens placode verdikking ^19. Aangezien otx2 zich ook in de voorste neurale ectoderm als niet-neurale head ectoderm buiten de PLE wordt geassocieerd met zowel neur...

Discussion

De hier beschreven methode voor de functionele klonering van genen kan induceren reaktie bevoegde ectoderm kan worden gebruikt om een ​​breed scala van genproducten te identificeren. Deze methode breidt uit op het verleden door het combineren van werk-tissue-inducerende assays met expressie kloontechnieken. We maken gebruik van de metabole routes van de Xenopus oöcyt als bron van productie inducerende factoren, direct of indirect volgende RNA injectie. Dit, in combinatie met het gebruik van vastgestelde werkwij...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12/101 Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	12/101	Monoclonaal antilichaam voor detectie van spierweefsel
20x SSC Buffer	Sigma	S6639	voor ISH
Acetic anhydride	Sigma	A6404	voor ISH
Anti-Dig-AP	Roche	11093274910	voor ISH
Aurum Plasmid Mini Kit	Bio-Rad	732-6400	Plasmid DNA-zuivering
Blocking Reagent	Roche	11096176001	voor ISH
BM Purple	Roche	11442074001	voor ISH
Boekel Hybridization Oven	Fisher Scientific	13-245-121	voor ISH
Bouin's Solution	Sigma	HT10132	voor ISH
BSA	Sigma	A9647	voor OCM
CHAPS	Sigma	C3023	voor ISH
Collagenase A	Roche	10103578001	Defolliculatie van eicellen
Cysteine	Sigma	C121800	Dejelly-embryo's
DEPC-H2O	Fisher Scientific	BP5611	voor ISH
Dig-RNA Labeling Mix	Roche	11277073910	voor ISH-probes
Dumont #5 forceps	World Precision Instruments	500233	voor het verwijderen van de vitelline-omhulsel
Ethyl 3-aminobenzoate	Sigma	A5040	MS222 anesthetisch middel
Ficoll PM 400	Sigma	F4375	voor injectiemedia
Formamide	Sigma	F9037	voor ISH
Gentamicin sulfate	Sigma	G1914	voor OCM
Glass capillaries	World Precision Instruments	4878	3,5" lang, I,D, 0,530 mm
Glass sample vials	Fisher Scientific	06-408B	voor ISH
Hair loop			Haar bevestigd in pasteurpipet voor weefselmanipulatie
Heparin sodium salt	Sigma	H4784	voor ISH
Injector Nanoliter 2010	World Precision Instruments	Nanoliter 2010	Microprocessorgestuurde micro-injector
Instant Ocean	Carolina	972433	Aquariumzout voor kikkerherstel
IRBG XGC Xenopus geverifieerde volledige lengte cam cDNA	Source Bioscience	989_IRBG	cDNA-bibliotheek
LB Agar platen met 100 µg/ml Ampicilline	Teknova	L5004	150 mm voorgegoten LB-Amp platen voor sib selectie
LB Luria Broth	Teknova	L8650	LB voor het verzamelen van kolonies in sib selectie van platen en verdunning van culturen
Magnetic mRNA Isolation Kit	New England BioLabs	S1550S	voor isolatie van poly(A)-verrijkt RNA
Maleic Acid	Sigma	M0375	voor ISH
Manual Microfil Micromanipulator	World Precision Instruments	M3310R	Manuele micromanipulator
Nutating Mixer	Fisher Scientific	22-363-152	Rocker voor ISH
Permoplast	Nasco	SB33495M	Klei voor injectie- en dissectiekommen
Phosphate Buffered Saline	Sigma	P5368	voor ISH
PMSG	Sigma	G4877	om oöcyte-ontwikkeling te stimuleren
Polyvinylpyrrolidon	Sigma	PVP40	voor ISH
Programmable Puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Micropipet-naaldtrekker
Proteinase K	Sigma	P6556	voor ISH
pTnT Vector	Promega	L5610	cDNA-bibliotheekconstructie
Riboprobe Combination System	Promega	P1450	in vitro transcriptie
Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit	Life Technologies	18248013	kit voor cDNA-bibliotheekconstructie
Sutures, 3-0 zijde	Fisher Scientific	19-037-516	Sutuurdraad en naald voor post-oöcyte-verwijdering
Torula RNA	Sigma	R3629	voor ISH
Triethanolamine	Sigma	T1502	voor ISH
Tween 20	Sigma	P9416	voor ISH
Universal RiboClone cDNA Synthesis System	Promega	C4360	alternatieve kit voor cDNA-bibliotheekconstructie
Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration	Source Bioscience	5055_XenORFeome	ORFeome-klonen
XL2-Blue Ultracompetent Cells	Agilent Technologies	200150	cellen voor transformatie van cDNA-bibliotheek