Methodenartikel

Radioactief en kwantificering van cellulaire niveaus van fosfoinositiden door High Performance Liquid Chromatography-gekoppeld Flow Scintillation

DOI:

10.3791/53529

⸱

6 januari 2016

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biology, Program in Molecular Science, Ryerson University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phosphoinositides signaleren lipiden waarvan de relatieve abundantie snel verandert in reactie op verschillende stimuli. Dit artikel beschrijft een methode om de overvloed aan phosphoinositides meten door metabolisch labelen van cellen met 3H-myo-inositol, gevolgd door extractie en deacylering. Geëxtraheerd glycero-inositiden omgezet worden vervolgens gescheiden door hoge-prestatie vloeistofchromatografie en gekwantificeerd door flow scintillatieteller.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fosfo-inositiden (PtdInsP's) zijn essentiële signaallipiden die verantwoordelijk zijn voor het rekruteren van specifieke effectoren en het verlenen van organellen met moleculaire identiteit en functie. Elk van de zeven PtdInsP's varieert in hun verdeling en abundantie, die nauwkeurig worden gereguleerd door specifieke kinasen en fosfatasen. De abundantie van PtdInsP's kan abrupt veranderen als reactie op verschillende signaalgebeurtenissen of verstoring van de regulerende machinerie. Om te begrijpen hoe deze gebeurtenissen leiden tot veranderingen in de hoeveelheid PtdInsP's en hun resulterende impact, is het belangrijk om PtdInsP-niveaus te kwantificeren voor en na een signaalgebeurtenis of tussen controle- en abnormale omstandigheden. Echter, vanwege hun lage abundantie en gelijkenis, kan het kwantificeren van de relatieve hoeveelheden van elke PtdInsP uitdagend zijn. Dit artikel beschrijft een methode voor het kwantificeren van PtdInsP-niveaus door cellen metabolisch te labelen met 3H-myo-inositol, dat wordt opgenomen in PtdInsP's. Fosfolipiden worden vervolgens geprecipiteerd en gedeacyleerd. De resulterende oplosbare 3H-glycero-inositiden worden verder geëxtraheerd, gescheiden door hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC) en gedetecteerd door stroomscintillatie. De label en verwerking van gist-monsters wordt in detail beschreven, evenals de instrumentele setup voor de HPLC en stroomscintillatie. Ondanks het verlies van structurele informatie met betrekking tot acylkettinggehalte, is deze methode gevoelig en kan worden geoptimaliseerd om alle zeven PtdInsP's tegelijkertijd in cellen te kwantificeren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fosfo-inositiden (PtdInsP's) zijn belangrijke signaalfosfolipiden die helpen bij het reguleren van een verscheidenheid aan cellulaire functies, waaronder signaaltransductie, membraanverkeer en genexpressie, die vervolgens hoger orde celgedrag moduleren zoals celdeling, orgaanidentiteit en metabolische activiteit1-3. Er zijn zeven soorten PtdInsP's die zijn afgeleid van de fosforylering van de 3, 4 en/of 5 posities van de inositolkopgroep van fosfatidylinositol (PtdIns), het ouder fosfolipide. Belangrijk is dat de zeven PtdInsP's ongelijk verdeeld zijn en dat de lokale concentratie van elke PtdInsP-soort kan toenemen of afnemen op specifieke subcellulaire locaties waar ze zich binden aan een specifieke set eiwiteffectoren, wat samen elke PtdInsP toestaat om de identiteit en functie van zijn gastvrije membraan te controleren3,4. Bovendien moeten de niveaus van elke PtdInsP strikt worden gecontroleerd, aangezien dit de signaalintensiteit die door een PtdInsP wordt geproduceerd, aanzienlijk kan beïnvloeden. De lokalisatie en niveaus van elke PtdInsP zijn afhankelijk van de targeting en activiteit van talrijke lipidkinasen, fosfatasen en fosfolipidasen die de synthese en omzetting van elke PtdInsP mediëren3,4. Daarom kan een onjuiste regulatie van de PtdInsP-regulatiemachinerie celfuncties verstoren, wat kan leiden tot ziekten zoals kanker en degeneratieve ziekten2,5,6. Om de rollen en functies van PtdInsP's en hun regulerende machinerie volledig te begrijpen, zijn zowel microscopie-gebaseerde als biochemische technieken ontwikkeld om PtdInsP's te volgen en te kwantificeren.

In veel gevallen binden PtdInsP's zich aan hun eiwiteffectoren via een specifiek eiwitdomein7-9. Deze eiwitmodules behouden vaak hun juiste vouwing en lipidherkenningseigenschappen wanneer ze apart van het volledige eiwit worden tot expressie gebracht. Dit leidde tot PtdInsP-sondes door een specifiek PtdInsP-bindend eiwitdomein te fuseren met een fluorescerende eiwit (FP) zoals groen fluorescerend eiwit (GFP) voor de subcellulaire detectie van PtdInsP's door microscopie. Inderdaad, zijn veel studies gebruikt FP-gefuseerde PtdInsP-bindende eiwitmodules om de lokalisatie en dynamica van specifieke PtdInsP-soorten te identificeren door live-cell beeldvorming1,10. Bijvoorbeeld, de Pleckstrin homologie (PH) domein van fosfolipase C δ1 (PLCδ1) gefuseerd met GFP herkent specifiek de fosfatidylinositol-4,5-bisfosfaat [PtdIns(4,5)P2] op het plasmamembraan, terwijl tandem kopieën van het FYVE domein van vroeg endosoom antigeen 1 (EEA1) is gebruikt om fosfatidylinositol-3-fosfaat (PtdIns3P) op endosomen te volgen10-13. Over het algemeen zijn microscopie-gebaseerde technieken geweldig om PtdInsP-lokalisatie en dynamica te visualiseren, maar er zijn verschillende waarschuwingen, waaronder dat PtdInsP-bindende domeinen ook kunnen interageren met aanvullende factoren dan de doel-PtdInsP-soorten en dat ze geen veranderingen kunnen detecteren onder de cytosolische fluorescentie van de FP-sondes.

Biochemische technieken inclusief dunne-laagchromatografie, massaspectrometrie en radio-isotooplabeling kunnen ook worden gebruikt om de niveaus van elke PtdInsP te karakteriseren en kwantificeren14-16. Deze methoden vereisen de isolatie van lipiden voor de detectie van cellulaire niveaus van PtdInsP's. Massaspectrometrie kan worden gebruikt om fosfolipiden uit lipide-extracten te karakteriseren en is onschatbaar voor het bepalen van de acylketensamenstelling van PtdInsP's14,17. Echter, massaspectrometrie is meestal semi-kwantitatief en het blijft moeilijk om PtdInsP-soorten van dezelfde moleculaire massa tegelijkertijd op te lossen en te kwantificeren14,17. In vergelijking, radio-isotooplabeling van PtdInsP's gevolgd door hoog prestatie vloeistofchromatografie (HPLC)-gekoppelde flow scintillatie is nuttig voor de scheiding en gelijktijdige kwantificering van alle zeven soorten PtdInsP's18. Het gebruik van HPLC met een sterke anionenuitwisselings (SAX) kolom bereikt scheiding op basis van moleculair gewicht, lading en vorm, waardoor gedeacyleerde PtdInsP's (Gro-InsP's) worden gefractioneerd, zelfs met dezelfde moleculaire massa en lading. Het koppelen van de HPLC-eluent aan een flow scintillator genereert vervolgens radioactief-gebaseerde signaalpieken voor elke Gro-InsP-soort ten opzichte van de oorspronkelijke ouder glycerol-inositol (Gro-Ins)18. Dit komt uiteindelijk overeen met relatieve niveaus van PtdInsP's in cellen.

Radiolabeling van PtdInsP's en HPLC-gekoppelde flow scintillatie is een nuttige tool om de regulatie en functie van fosfatidylinositol 3,5-bisfosfaat [PtdIns(3,5)P2], een PtdInsP dat slechts ~0,1-0,3% van PtdIns uitmaakt16,19,20, te onderzoeken. De synthese van PtdIns(3,5)P2 wordt uitgevoerd door de PtdIns3P 5-kinase genaamd Fab1 in gist en PIKfyve in zoogdieren21. Deze reactie wordt tegengewerkt door een PtdIns(3,5)P2 5-fosfatase genaamd Fig4 in gist of mFig4/Sac3 in zoogdieren22-24. Interessant is dat zowel PIKfyve/Fab1 als mFig4/Fig4/Sac3 in een enkel complex bestaan en worden gereguleerd door de scaffolding-adaptereiwit, Vac14 in gist of mVac14/ArPIKfyve in zoogdieren25,26. In VAC14-gedeleteerde gistcellen functioneert Fab1 niet efficiënt, wat leidt tot een

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: De tekst hieronder in detail beschrijft een methode om PtdInsPs meten in gist. Het biedt de experimentele gegevens voor de etikettering gistcellen met 3 H- myo, het extraheren en deacyleren lipiden en een HPLC-elutie protocol te fractioneren en te kwantificeren gedeacyleerde PtdInsPs. Houd er rekening mee dat de etikettering, deacylering, resolutie en kwantificering van PtdInsPs in zoogdiercellen vereisen optimalisatie en langer HPLC-elutieprofielen. Deze gegevens kunnen elders worden gevonden, hoewel we bespreken een aantal aspecten in de discussie. Kortom, de methode voor lipiden, deacyleren extract en het extract in water oplosbare Gro-InsPs uit gist wordt gegeven en is geïllustreerd in figuur 1.

1. Protocol voor de etikettering en analyseren PtdInsPs in gist

  1. Celcultuur en radioactief
    1. Kweek een 20 ml vloeibare kweek van de giststam SEY6210 bij 30 ° C onder constant schudden in volledig synthetischemedia mid-log fase of optische dichtheid bij 600 nm (OD 600) van ongeveer 0,6-0,7.
      Opmerking: YPD media niet gebruiken als deze 3 H- myo opname kunnen beïnvloeden. Deze cultuur maat zal voldoende materiaal voor 2-3 HPLC runs.
    2. Pellet totaal 10-14 OD van de gistcellen (merk op dat 1 ml kweek een OD 600 = 1 bevat ~ 1x10 7 cellen) door centrifugeren bij 800 g gedurende 5 min in een 12 ml ronde bodem buis. Resuspendeer met 2 ml inositol-vrij medium (IFM) (zie tabel 1 voor samenstelling IFM).
    3. Herhaal centrifugeren en zuig de media. Resuspendeer de pellet met 440 pl IFM en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
    4. Voeg 60 pl 3 H- myo-inositol (1 pi = 1 uCi) aan elk monster en incubeer bij de groeitemperatuur van 30 ° C gedurende 1 tot 3 uur onder constant schudden.
      Let op: 3 H- myo is een radioactief partnerrial dat na een passende opleiding moeten worden behandeld. Bovendien moeten alle verbruiksmaterialen dat contact met 3-H bevattend materiaal maakt op passende wijze aangebracht en aangeduid als radioactief afval.
      Opmerking: De groeitemperatuur kunnen desgewenst worden gewijzigd zolang alle stammen te vergelijken worden gekweekt bij dezelfde temperatuur.
    5. Breng de celsuspensie (500 ui) van een microcentrifugebuis met 500 ul van 9% perchloorzuur en 200 pl zuur gewassen glasparels. Meng door omkeren en incubeer op ijs gedurende 5 min.
    6. Vortex het monster op topsnelheid gedurende 10 min en de lysaten overbrengen naar een nieuwe microcentrifugebuis met een gel-lading-punt met de glaskralen voorkomen.
    7. Pellet het monster bij 12.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en zuig de supernatant.
    8. Resuspendeer de pellet door badsonicatie in 1 ml ijskoude 100 mM EDTA. Pellet opnieuw zoals hierboven beschreven.
  2. Deacylering en extractie
    1. Vers bereiden 5,0 ml van het reagens deacylering door het combineren van 2,3 ml methanol, 1,3 ml 40% methylamine, 0,55 ml 1-butanol en 0,80 ml water. Omkeren om te mengen.
    2. Zuig het EDTA ultrasone trillingen en de pellet in 50 pl water.
    3. Voeg 500 ul van de deacylering reagens en ultrasone trillingen te mengen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
    4. Heat lipiden gedurende 50 min bij 53 ° C in een verwarmingsblok. De monsters volledig door vacuümcentrifugatie dan 3 u of O / N.
      1. Ervoor te zorgen dat een chemische val is geïnstalleerd tussen de vacuüm-centrifuge en de vacuümpomp om dampen te voorkomen dat de lucht.
    5. Resuspendeer de pellet met 300 pl water door badsonicatie en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 20 min. De monsters door vacuüm centrifugatie gedurende 3 u of O / N. Herhaal nog een keer deze stap.
    6. Ultrasone trillingen de pellet met 450 pl water. Dit is de waterige fase tijdens de extractie.
    7. Vers bereiden 10 ml van de extraction reagens door toevoeging van 8,0 ml 1-butanol, 1,6 ml ethyl ether en 0,40 ml ethylformiaat. Omkeren om te mengen.
    8. Voeg 300 ul van de extractie reagens aan de waterfase. Vortex het mengsel op topsnelheid gedurende 5 minuten en scheid de lagen door centrifugeren bij topsnelheid (18.000 xg) gedurende 2 min.
    9. Verzamel de onderste waterlaag in een nieuwe microcentrifugebuis met vermijding van de bovenste organische laag, de interface en de pellet. Herhaal de extractie van de waterige fase tweemaal met verse extractie reagens.
    10. Drogen van de verzamelde waterige laag door vacuümcentrifugatie. De verspreiding van de pellet in 50 ul van het water door badsonicatie.
    11. Voeg 2 pi van elk monster tot 4 ml scintillatievloeistof in een 6 ml polyethyleen scintillatieflesje. Bepaal het aantal tellingen (in CPM) in elk monster met vloeistofscintillatietelling met behulp van een open venster.
    12. Bewaar de monsters bij -20 ° C tot klaar voor HPLC.
  3. Scheiding van3 H-glycero-inositiden omgezet met HPLC
    1. Bereid buffer A door het filteren van 1 liter ultrapuur water met een fles top 0,22 pm vacuüm-filter, gevolgd door ontgassen.
    2. Bereid buffer B door een 1 L oplossing van 1 M ammonium dibasisch (APS, MW 132,06) in water en breng de pH op 3,8 met fosforzuur. Filter de ammoniumfosfaat met een fles top 0,22 pm vacuüm-filter, gevolgd door ontgassen.
    3. Monteer de injectieflacon door afbouw een 2 ml flesje met een veerbelaste 250 gl klein volume insert. Laad 10 miljoen CPM en voeg water tot een totaal volume van 55 pl. Bereid een leeg flesje met 55 ul van water.
    4. Cap de flesjes met schroefdoppen uitgerust met een PTFE / siliconen septa (rode zijde naar de binnenkant van de flacon). Plaats elke flacon in de automatisch bemonstering tray van de HPLC, beginnend met de lege ampul.
    5. Gebruik een HPLC en bijbehorende software die controleert buffer flow, ontgast buffers en controles monster injectiop. Gebruik van een online stroom scintillator en de bijbehorende software om de scintillatiemiddel stroomsnelheid te regelen en de 3 H-verval signaal volgen.
      1. Gebruik een SAX vloeistof chromatografiekolom met afmetingen van 250 mm x 4,6 mm en met 5 urn silicahars in de HPLC. Rust de kolom met een guard kolom injectie van verontreinigingen te voorkomen.
      2. Installeer een 3 H-compatibele 500 pi doorstroomcel in de stroom scintillator.
        OPMERKING: Fractionering kan worden uitgevoerd met een Agilent 1200 serie HPLC systeem oneindig bestuurd door Chemstation software of andere commercieel beschikbare HPLC systemen. Flow scintillatie van het HPLC eluaat kan met een β-RAM stroming scintillator bestuurd door Laura software of andere commercieel beschikbare stroom scintillator besturingskaartversie.
    6. Initialiseer de quaternaire pomp met een stroomsnelheid van 1,0 ml / min met 100% buffer A.
    7. Het opzetten van een verevening profiel op de HPLCde gradiënt van buffers A en B (noemen dit "protocol A evenwichtsinstelling") regelen: 1% buffer B gedurende 5 minuten, 1-100% B gedurende 5 min, 100% B gedurende 5 min, 100-1% B gedurende 5 min, 1% B gedurende 20 min. Stel de druk limiet bij 400 bar, 1,0 ml / min debiet en 30 min looptijd.
    8. Maak een elutieprofiel (figuur 2) op de HPLC om de gradiënt van buffers A en B (noemen dit "Protocol A") regelen: 1% B gedurende 5 min, 1-20% B gedurende 40 min, 20-100% B gedurende 10 min, 100% B gedurende 5 min, 100-1% B gedurende 20 min, 1% B gedurende 10 min. Stel de druk limiet bij 400 bar, 1,0 ml / min debiet, en 90 min looptijd.
    9. Het opzetten van een detectie-protocol op de stroom scintillator (noemen dit 'Protocol A detectie ") te lopen voor 60 min, met een scintillatievloeistof debiet van 2,5 ml / min en een 8.57 sec verblijftijd.
    10. Programmeer een geautomatiseerde injectie volgorde op het HPLC beginnen met de water blanco in "Protocol A evenwichtsinstelling", gevolgd door each radioactief gelabeld monster op "Protocol A". Initialiseren de volgorde als klaar.
    11. Terwijl de run is nog steeds op het evenwicht protocol, maakt u een batch op de stroom scintillator om alle van de monsters met het meten van "Protocol Een detectie." De injectie van elk nieuw monster wordt geïnitialiseerd "Protocol A" op de HPLC terwijl triggering de stroom scintillator te beginnen "Protocol A detectie."
    12. Bij de voltooiing van alle runs, spoel de HPLC kolom en de stroom scintillator met 100% buffer A gedurende 30 minuten bij 1,0 ml / min stroomsnelheid.
  4. Data-analyse
    1. Gebruik Laura-software of andere software die de chromatografie spectra kunnen kwantificeren. De stappen in dit hoofdstuk beschreven zijn weergegeven in figuur 3.
    2. Open de bestanden door te klikken op "File", "Open" en selecteer het ruwe data bestand voor elk monster.
    3. In het tabblad "chromatogrammen", Zoom in elk van de kleinere pieken (ongeveer 1000 counts [y-as]) met behoud van tijdresolutie te rekken. Inzoomen op elke individuele piek indien nodig.
    4. Markeer elk van de pieken voor analyse met behulp van "toevoegen ROI" tool. Identificeer pieken by tijd van elutie: Parental Gro-Ins op 10 min, Gro-Ins3P op 18 min, Gro-Ins4P op 20 min, Gro-Ins (3,5) P 2 op 29 min en Gro-Ins (4,5 ) P 2 32 min.
    5. In het tabblad "regio's tafels", noteer de "gebied (tellingen)" van elke piek. Let op de "start (mm: ss)" tijd en "end (mm: ss)" tijd van elke piek.
    6. Voor achtergrond aftrek Markeer een gebied grenzend aan de piek spanning evenveel tijd. Trek het aantal tellingen van de corresponderende piek.
    7. Normaliseren van de oppervlakte van elke piek tegen ouderlijke Gro-Ins (uitgedrukt als "% van de totale PtdIns"). Vervolgens normaliseren elk van de pieken in elke experimentele conditie tegen de controleconditie (uitgedrukt als "nvoudige toename ten opzichte van controle ").
      OPMERKING: Normalisatie van elke piek kan ook tegen totaaltellingen maar omdat de parentale Gro-Ins veel overvloediger dan alle andere PtdInsPs de resultaten lijken vergelijkbaar.
    8. De gegevens voor de chromatografen exporteren door op "Bestand", "Opslaan als ..." en kies de "CSV (comma separated)" bestandsformaat. Plot de gegevens op een spreadsheet en presenteren als nodig.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met deze methode werden gist PtdInsPs metabolisch gelabeld met 3H-myo-inositol. Na labeling werden de fosfolipiden geprecipiteerd met perchloorzuur gevolgd door deacylering fosfolipide en extractie van de in water oplosbare Gro-InsPs (figuur 1). In deze fase is het belangrijk om de totale radioactieve signaal geassocieerd met de geëxtraheerde Gro-InsPs door vloeistofscintillatietelling gekwantificeerd voldoende signaal-ruisverhouding voor de lage abun...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft de experimentele protocol nodig om de cellulaire niveaus van PtdnsPs kwantificeren door HPLC gekoppeld stroom scintillatie uit gist. De methodologie maakt het metabolisch merken van PtdInsPs met 3H-myo-inositol gevolgd door lipiden verwerking en extractie van in water oplosbare 3 H-Gro-InsPs HPLC fractionering en analyse. Met deze methode kan de relatieve niveaus van PtdInsPs in cellen onder verschillende omstandigheden worden gekwantificeerd, zoals getoond voor Ptdl...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.Y.H. kreeg steun van een Ontario Graduate Scholarship van de regering van Ontario. Dit artikel werd mogelijk gemaakt door financiering van R.J.B. van de Natural Sciences and Engineering Research Council, het Canada Research Chairs Program en Ryerson University.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1-ButanolBiobasicBC1800Reagent grade
Ammonium phosphate dibasicBioshopAPD001ACS grade
Ammonium sulfateBiobasicADB0060Ultra Pure grade
AutosamplerAgilentG1329BAgilent 1260 infinity series
BiotinSigmaB4501
Boric acidBiobasicBB0044Molecular biology grade
Calcium ChlorideBiobasicCT1330Ahydrous, industrial grade
Calcium pantothenateSigmaC8731
Copper(II) sulfateSigma451657Anhydrous
D-GlucoseBiobasicGB0219Anhydrous, biotech grade
Dulbecco's modification of Eagle's MediumLife11995-065Met 4,5 g/L glucose, 110 mg/L pyruvaat, L-glutamine
Dulbecco's modification of Eagle's MediumMP biomedicals0916429 Met 4,5 g/L glucose, zonder L-glutamine, zonder inositol
EDTABiobasicEB0107Zuurvrij, ultra pure grade
Ethyl etherCaledon labs1/10/4700Anhydrous, reagent grade
Ethyl formateSigma112682Reagent grade
Fetal bovine serumWisent080-450US origin, premium quality, heat inactivated
Fetal Bovine Serum, DialyzedLife26400044US origin
FlowLogic ULabLogic Systems LtdSG-BXX-05Scintillatievloeistof voor flow scintillatie 
Folic acidBiobasicFB0466USP grade
HEPES buffer solutionLife156300801 M oplossing
Inositol, Myo-[2-3H(N)]Perkin ElmerNET114005MC9:1 ethanol naar water
Insulin-Transferrin-Selenium-EthanolamineLife51500056100x oplossing
Iron(III) chlorideSigma157740Reagent grade
Laura - Chromatography data collection and analysis softwareLabLogic Systems LtdVersion 4.2.1.18Flow scintillator software
L-glutamineSigmaG7513200 mM, oplossing, sterieel gefilterd, BioXtra, geschikt voor celkweek
Magnesium ChlorideSigmaM8266Anhydrous
Manganese sulfateBiobasicMB0334Monohydraat, ACS grade
MethanolCaledon labs6701-7-40HPLC Grade
Methylamine solutionSigma42646640% (v/v)
Monopotassium phosphateBiobasicPB0445Anhydrous, ACS grade
Nicotinic acidBiobasicNB0660Reagent grade
OpenLAB CSD ChemStation AgilentRev. C.01.03 HPLC software
p-aminobenzoic acid (PABA)BioshopPAB001.100Vrije zuur
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333100X, vloeistof, gestabiliseerd, sterieel gefilterd, celkweek getest
Perchloric acidSigma244252ACS reagens, 70%
PhenoSpher SAX columnPhenomenex00G-315-E05 µm, 80 Å, 250 x 4,6 mm
Phosphoric acidCaledon labs1/29/8425Reagent grade
Potassium ChlorideBiobasicPB0440ACS grade
Potassium iodideBiobasicPB0443ACS grade
Pyridoxine hydrochlorideSigmaP9755
Quaternary pumpAgilentG1311CAgilent 1260 infinity series
RiboflavinBioshopRIB333.100USP grade
Sodium ChlorideBiobasicDB0483Biotech grade
Sodium molybdateSigma243655
Thermostatted Column CompartmentAgilentG1316AAgilent 1260 infinity series
Thiamine hydrochlorideSigmaT4625Reagent grade; maak oplossing van 0,02% (w/v), vormt een suspensie. mix en bevries aliquoten
Ultima GoldPerkin Elmer6013321Scintillatiecocktail voor liquid scintillatie counting
Zinc sulfateBiobasicZB2906Heptahydraat, reagent grade
β-RAM 4IN/US systemsModel 4Flow scintillator - 500 µl flow cell; alternatieve Radiomatic Flow Scintillator Analyser by Perkin Elmer 

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
  2. Bridges, D., Saltiel, A. R. Phosphoinositides and Disease. Curr. Top. Microbiol. Immuno. 362, 61-85 (2012).
  3. Botelho, R. J. Changing phosphoinositides "on the fly": How trafficking vesicles avoid an identity crisis. BioEssays. 31 (10), 1127-1136 (2009).
  4. Simonsen, A., Wurmser, A. E., Emr, S. D., Stenmark, H. The role of phosphoinositides in membrane transport. Curr. Opin. Cell. Biol. 13 (4), 485-492 (2001).
  5. Katso, R., Okkenhaug, K., Ahmadi, K., Timms, J., Waterfield, M. D. Cellular Function of Phosphoinositide 3-Kinases: Implications for Development, Immunity, Homeostasis, and Cancer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 615-675 (2001).
  6. Lenk, G. M., Meisler, M. H. Mouse models of PI(3,5)P2 deficiency with impaired lysosome function. Methods. Enzymo. 534, Elsevier Inc. (2014).
  7. Lemmon, M. A. Phosphoinositide recognition domains. Traffic. 4 (4), 201-213 (2003).
  8. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains-their role in signalling and membrane trafficking. Curr. Biol. 11 (21), R882-R893 (2001).
  9. Balla, T. Inositol-lipid binding motifs: signal integrators through protein-lipid and protein-protein interactions. J. Cell. Sci. 118 (Pt 10), 2093-2104 (2005).
  10. Burd, C. G., Emr, S. D. Phosphatidylinositol(3)-phosphate signaling mediated by specific binding to RING FYVE domains. Mol. Cell. 2 (1), 157-162 (1998).
  11. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 (23), 10472-10476 (1995).
  12. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J. Cell. Biol. 169 (1), 139-149 (2005).
  13. Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO J. 19 (17), 4577-4588 (2000).
  14. Haag, M., Schmidt, A., Sachsenheimer, T., Brügger, B. Quantification of Signaling Lipids by Nano-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry (Nano-ESI MS/MS). Metabolites. 2 (1), 57-76 (2012).
  15. Furutani, M., Itoh, T., Ijuin, T., Tsujita, K., Takenawa, T. Thin layer chromatography-blotting, a novel method for the detection of phosphoinositides. J. Biochem. 139 (4), 663-670 (2006).
  16. Cooke, F. T., et al. The stress-activated phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase Fab1p is essential for vacuole function in. 8 (22), 1219-1222 (1998).
  17. Milne, S. B., Ivanova, P. T., DeCamp, D., Hsueh, R. C., Brown, H. A. A targeted mass spectrometric analysis of phosphatidylinositol phosphate species. J. Lipid. Res. 46 (8), 1796-1802 (2005).
  18. Rusten, T. E., Stenmark, H. Analyzing phosphoinositides and their interacting proteins. Nat. methods. 3 (4), 251-258 (2006).
  19. Ho, C. Y., Alghamdi, T. A., Botelho, R. J. Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphate: no longer the poor PIP2. Traffic. 13 (1), 1-8 (2012).
  20. Samie, M., et al. A TRP channel in the lysosome regulates large particle phagocytosis via focal exocytosis. Dev. Cel. 26 (5), 511-524 (2013).
  21. Shaw, J. D., Hama, H., Sohrabi, F., DeWald, D. B., Wendland, B. PtdIns(3,5)P2 is required for delivery of endocytic cargo into the multivesicular body. Traffic. 4 (7), 479-490 (2003).
  22. Botelho, R. J., Efe, J. A., Emr, S. D. Assembly of a Fab1 phosphoinositide kinase signaling complex requires the Fig4 phosphoinositide phosphatase. Mol. Biol. Cell. 19, 4273-4286 (2008).
  23. Rudge, S. A., Anderson, D. M., Emr, S. D. Vacuole size control: Regulation of PtdIns(3,5)P2 levels by the vacuole-associated Vac14-Fig4 complex, a PtdIns(3,5)P2-specific phosphatase. Mol. Biol. Cell. 15, 24-36 (2004).
  24. Sbrissa, D., et al. Core protein machinery for mammalian phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate synthesis and turnover that regulates the progression of endosomal transport: Novel Sac phosphatase joins the ArPIKfyve-PIKfyve complex. J. Biol. Chem. 282 (33), 23878-23891 (2007).
  25. Alghamdi, T. A., et al. Vac14 protein multimerization is a prerequisite step for Fab1 protein complex assembly and function. J. Biol. Chem. 288 (13), 9363-9372 (2013).
  26. Ikonomov, O. C., Sbrissa, D., Fenner, H., Shisheva, A. PIKfyve-ArPIKfyve-Sac3 core complex: Contact sites and their consequence for Sac3 phosphatase activity and endocytic membrane homeostasis. J. Biol. Chem. 284 (51), 35794-35806 (2009).
  27. Dove, S. K., et al. Vac14 controls PtdIns(3,5)P(2) synthesis and Fab1-dependent protein trafficking to the multivesicular body. Curr. Biol. 12 (11), 885-893 (2002).
  28. Bonangelino, C. J., et al. Osmotic stress-induced increase of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate requires Vac14p, an activator of the lipid kinase Fab1p. J. Cell. Biol. 156 (6), 1015-1028 (2002).
  29. Dove, S. K., et al. Svp1p defines a family of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate effectors. EMBO J. 23 (9), 1922-1933 (2004).
  30. Efe, J. A., Botelho, R. J., Emr, S. D. Atg18 regulates organelle morphology and Fab1 kinase activity independent of its membrane recruitment by phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate. Mol. Biol. Cell. 18 (1), 4232-4244 (2007).
  31. Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p Ptdlns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (6), 847-858 (1998).
  32. Duex, J. E., Nau, J. J., Kauffman, E. J., Weisman, L. S. Phosphoinositide 5-phosphatase Fig4p is required for both acute rise and subsequent fall in stress-induced phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate levels. Eukaryotic Cell. 5 (4), 723-731 (2006).
  33. Whiteford, C. C., Best, C., Kazlauskas, A., Ulug, E. T. D-3 phosphoinositide metabolism in cells treated with platelet-derived growth factor. Biochem J. 319 (3), 851-860 (1996).
  34. Murthy, P. P., et al. Evidence of two isomers of phosphatidylinositol in plant tissue. Plant physiology. 98 (4), 1498-1501 (1992).
  35. Zolov, S. N., et al. In vivo, Pikfyve generates PI(3,5)P2, which serves as both a signaling lipid and the major precursor for PI5P. Proc. 109 (43), 17472-17477 (2012).
  36. McEwen, R. K., et al. Complementation analysis in PtdInsP kinase-deficient yeast mutants demonstrates that Schizosaccharomyces pombe and murine Fab1p homologues are phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinases. J. Biol. Chem. 274 (48), 33905-33912 (1999).
  37. Tolias, K. F., et al. Type I phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinases synthesize the novel lipids phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate and phosphatidylinositol 5- phosphate. J. Biol. Chem. 273 (29), 18040-18046 (1998).
  38. Ikonomov, O. C., et al. The phosphoinositide kinase PIKfyve is vital in early embryonic development: preimplantation lethality of PIKfyve-/- embryos but normality of PIKfyve+/- mice. J. Biol. Chem. 286 (15), 13404-13413 (2011).
  39. Sarkes, D., Rameh, L. E. A Novel HPLC-Based Approach Makes Possible the Spatial Characterization of Cellular PtdIns5P and Other Phosphoinositides. Biochem J. 428 (3), 375-384 (2011).
  40. Sbrissa, D., Ikonomov, O. C., Filios, C., Delvecchio, K., Shisheva, A. Functional dissociation between PIKfyve-synthesized PtdIns5P and PtdIns(3,5)P2 by means of the PIKfyve inhibitor YM201636. Am. J. Physiol. Cel. Physiol. 303 (4), 436-446 (2012).
  41. D'Souza, K., Epand, R. M. Enrichment of phosphatidylinositols with specific acyl chains. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1838 (6), 1501-1508 (2014).
  42. Shulga, Y. V., Anderson, R. A., Topham, M. K., Epand, R. M. Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase isoforms exhibit acyl chain selectivity for both substrate and lipid activator. J. Biol. Chem. 287 (43), 35953-35963 (2012).
  43. Pettitt, T. R., Dove, S. K., Lubben, A., Calaminus, S. D. J., Wakelam, M. J. O. Analysis of intact phosphoinositides in biological samples. J. Lipid. Res. 47 (7), 1588-1596 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Phosphoinositide QuantificationHPLC Flow ScintillationTritium LabelingYeast Cell AnalysisPhospholipid ExtractionDeacylation ProcedureRadioactive DetectionGradient ElutionPeak IntegrationData Normalization

Gerelateerde artikelen