Om nieuwe mutaties die de mechanosensatie beïnvloeden te identificeren, ontwierpen we een test die de gedragsreactie op tactiele stimulatie van vliegborsten meet in mutante klonen die gegenereerd zijn door de MARCM-methode. De combinatie van technieken maakt het mogelijk om mechanogevoelige mutaties te identificeren die anders dodelijk zouden zijn.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een Behavioral Assay voor Mechanosensation van MARCM-gebaseerde klonen in
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Vanwege de structurele en functionele homologie met de haarcellen van het binnenoor zoogdier, de neuronen die het Drosophila uitwendige zintuigen innerveren verschaffen een uitstekend model voor de studie van mechanosensation. Dit protocol beschrijft een eenvoudige aanrakingsgedrag fruitvliegen die kunnen worden gebruikt om mutaties die interfereren met mechanosensation identificeren. De tactiele stimulatie van een macrochaete borstelharen op de thorax vliegen wekt een verzorging reflex van de eerste of derde been. Mutaties die interfereren met mechanotransduction (zoals NOMPC), of andere aspecten van de reflexboog kan de verzorging te remmen. Een traditioneel scherm van volwassen gedrag zou mutanten die een essentiële rol hebben bij de ontwikkeling gemist hebben. In plaats daarvan, dit protocol combineert de touch screen met mozaïek analyse met een onderdrukbaar celmarker (MARCM) mogelijk te maken voor slechts een beperkte regio van homozygote mutante cellen worden gegenereerd en wordt gekenmerkt door de exprsessieschijven van groen fluorescerend eiwit (GFP). Door het testen MARCM klonen abnormale gedragsreacties, is het mogelijk een verzameling van dodelijke p-element mutaties te screenen op zoek naar nieuwe genen betrokken bij mechanosensation die zou zijn gemist meer traditionele methoden.
Inleiding
Mensen vertrouwen op het vermogen om mechanische stimuli uit hun omgeving, zoals aanraking, druk, trillingen of geluidsgolven, om te zetten in sensorische informatie die door het zenuwstelsel kan worden verwerkt, in een proces dat mechanotransductie wordt genoemd. Veel van de algemene mechanistische kenmerken van mechanotransductie tussen mensen en ongewervelde dieren zijn hetzelfde1, waardoor Drosophila een nuttig model is om de moleculaire mechanismen van mechanotransductie te bestuderen. Drosophila melanogaster bevat twee sets gespecialiseerde sensorische organen (Type I en II) die in staat zijn om mechanische stimuli om te zetten in actiepotentialen. Type I mechanoreceptoren hebben een neuron met een enkele dendriet of sensorisch proces, omgeven door drie ondersteunende cellen2. De Type I mechanoreceptoren omvatten borstelmechanoreceptoren, gehoorgevoelige chordotonale organen (het Johnston-orgaan) en campaniforme sensilla die informatie over vleugelslagen overbrengen3. De borstels die de rugzijde van de vlieg bedekken, zijn de meest voorkomende en gemakkelijk toegankelijke van de Type I-organen. Net als de extracellulaire omgeving van haarcellen die geassocieerd zijn met gehoor en evenwicht bij gewervelde dieren, scheiden de ondersteunende cellen rond de mechanogevoelige neuronen van de vlieg een hoog kaliumgehalte endolymf af dat een ongebruikelijke concentratiegradiënt voor kalium creëert1. Mechanogevoelige neuronen, zowel van de zoogdier- als vliegsystemen, gebruiken dit hoge extracellulaire kalium om de cel te depolariseren. Als reactie op mechanische stimulatie van de macrochaete-borstels richting de lichaamswand, reageren de sensorische neuronen met een uitbarsting van actiepotentialen die worden aangedreven door deze kaliumdepolarisatie van het celmembraan4. De Drosophila sensorische neuronen die borstels innerveren, lijken qua structuur en functie op de mechanogevoelige cellen van andere organismen, inclusief haarcellen van gewervelde dieren1,5. De toegankelijkheid van Drosophila externe zintuigorganen voor experimentele manipulatie en de overvloed aan genetische technieken die beschikbaar zijn voor onderzoekers maken Drosophila een uitstekend modelsysteem om de moleculaire grondslagen van mechanosensatie te onderzoeken.
Bij de vlieg leidt stimulatie van een enkele sensorische neuron die een borstel innerveert tot een waarneembaar gedragsreactie. Stimulatie van verschillende borstels roept specifieke, reproduceerbare gedragsreacties op, afhankelijk van de gestimuleerde borstel. Bij tastbare stimulatie vertonen onthoofde wild-type vliegen een complexe verzorgingsreflex waarbij ze het gebied nabij de gestimuleerde borstel schoonmaken met een gepatternd set van beenbewegingen5-7. Wanneer ze homozygoot zijn voor bekende enkele-gen mutaties die interfereren met leren7 of coördinatie en locomotorische activiteit5, reageren vliegen abnormaal op mechanische stimulatie. Deze verzorgingsreflex is daarom een nuttig hulpmiddel om de effecten van enkele-gen mutaties op een specifiek, reproduceerbaar gedrag te bestuderen.
De robuuste gedragsreactie op stimulatie van een enkele macrochaete-borstel heeft het potentieel om te helpen bij het identificeren van nieuwe genen die betrokken zijn bij mechanotransductie. Dit protocol wordt gebruikt om een collectie mutante vliegen te testen op de afwezigheid van een gedragsreactie om aan te geven dat de mutatie interfereert met mechanosensatie. In de mutantencollectie die is geselecteerd voor screening, veroorzaken de mutaties dodelijkheid vóór volwassenheid, en het zou daarom onmogelijk zijn om ze te testen met behulp van traditionele volwassen gedragsscreens. Oorspronkelijk werd deze collectie van dodelijke p-elementen gecombineerd met FRT-recombinatiesites om celgroeftekorten in clones te testen. De clones werden specifiek in het oog gemaakt omdat volwassen vliegen in een laboratoriumomgeving kunnen overleven zonder functioneel zicht8. Echter, het verwijderen van alle mechanosensatie kan ervoor zorgen dat volwassenen ernstig ongecoördineerd zijn of sterven voordat ze uitkomen5. Dit protocol gebruikt een mozaïekbenadering om de dodelijkheid van de mutaties te omzeilen en het testen in volwassen stadium mogelijk te maken. Een genetische techniek genaamd Mozaïekanalyse met een Repressible Cell Marker (MARCM)9 wordt gebruikt om homozygote mutante cellen te genereren in een beperkt aantal sensorische organen van volwassen vliegen, terwijl de rest van het organisme heterozygoot blijft. Deze MARCM-vliegen overleven gemakkelijk tot volwassenheid, maar de borstels zijn homozygoot voor de dodelijke genen van belang.
MARCM maakt het mogelijk om gebieden van homozygote mutante cellen te genereren en te markeren door de expressie van groen fluorescerend proteïne (GFP), terwijl de rest van het organisme heterozygoot blijft op die specifieke locus en ongemarkeerd9. MARCM combineert individuele p-element mutaties met vijf veel voorkomende genetische elementen: GFP onder controle van een upstream-activerende sequentie (UAS-GFP), Gal80-repressor-eiwit onder controle van een algemene promotor (tub-Gal80), Gal4-transcriptiefactor onder controle van een algemene promotor (tub-Gal4), het FRT-recombinase-enzym dat tot expressie wordt gebracht door een hitte-shock-gecontroleerde promotor, en een FRT-recombinatieplaats10. Door mitotische recombinatie te drijven via een hitte-shock-geactiveerde recombinase, wordt een beperkt aantal cellen homozygoot voor de mutatie en gemarkeerd met GFP. GFP-expressie wordt geremd in heterozygote cellen door de aanwezigheid van Gal80 op het wildtype-kopie van het chromosoom.
Een hitte-shockprotocol voor MARCM werd geoptimaliseerd om recombinatie in de externe zintuigorganen van de vliegborstel te induceren, terwijl een groot deel van het organisme heterozygoot blijft, en dus ongemarkeerd met GFP. Mozaïek-vliegen die met dit protocol werden gegenereerd, bevatten het vaakst homozygote mutaties in de post alar of dorsale centrale borstels op het oppervlak van het notum.
We hebben de bru
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Kruisen om MARCM Flies genereren
- Handhaaf vliegen op maïsmeel melasse medium (6,5 g / l agar, 23,5 g / l gist, 60 g / l maïsmeel; 60 ml / L melasse, 4 ml / l acid mix, 0,13% Tegosept) of standaard Drosophila media bij 22 graden Celsius in een 12-uur licht / donker-cyclus.
Opmerking: een lager dan standaard temperatuur wordt gebruikt om MARCM-voorraden gezond te houden. Dit verlengt de ontwikkelingstijd tussen ei en volwassenheid 14 dagen. - Gebruik maagdelijke vrouwtjes (ongeveer 1 - 8 dagen oud) vanaf een MARCM-klaar voorraad bevattende de noodzakelijke genetische elementen (GFP onder de controle van een upstream-activerende sequentie (UAS-GFP), de GAL80 repressor eiwit, het Gal4 transcriptiefactor, een heat-shock gedreven recombinase en een FRT recombinatie site).
Let op: Onze MARCM ready-aandelen bevat de volgende genotypes: elavGal4, UAS-CD8-GFP, hs-flipase; FRT40A, tubGal80 / CYO; tubGal4 / TM3Sb.
Opmerking: De specifieke FRT site zal afhangen van de locatie van de mutatiein het genoom. Zo wordt FRT40A gebruikt om mutaties te testen op de linker arm van chromosoom 2, zoals NOMPC (zie 10 voor meer informatie over MARCM protocollen). - Cross MARCM ready maagdelijke vrouwtjes mannetjes dat een mutatie van interesse en de bijbehorende FRT-plaats bevatten (bijvoorbeeld w-, NOMPC3, FRT40A / Cyo; + / +). Om te bepalen effectieve MARCM inductie, stel een tweede kruis behulp mannelijke vliegen die dezelfde FRT-plaats, maar zonder mutatie. Gebruik een verhouding van 5 vrouwtjes benadering: 1 man in kruisen.
2. Timed eierleggende
- Nadat men vliegt te paren minstens één nacht, bewegen volwassenen naar nieuwe buisjes door vers medium. Laat vliegen om eieren te leggen in een donkere omgeving gedurende ongeveer 4 uur voor gegevensoverdracht opnieuw kruisen in nieuwe buisjes. Let op de begin- en eindtijden van de eileg periode.
Opmerking: Kortere aanvaardbaar wanneer er lijkt een groot aantal eieren op het medium voor het einde van de 4-hr interval.- Houd flesjes met een voldoende aantal eieren (ongeveer groter dan 20) en op een 12-uur licht / donker-cyclus bij 22 graden Celsius te zijn warmte later geschokt.
Opmerking: Flesjes met lage aantal eieren op de media (minder dan ongeveer 20) waarschijnlijk niet voldoende opbrengst van volwassen vliegen voor gedragstesten en omwille van efficiëntie is het raadzaam ze niet worden bewaard voor verdere tests.
Let op: Onze vliegen worden verhoogd met de lichten op 08:00-08:00. 08:00 en 08:00-middernacht - we hebben de avond tijdstippen leiden tot hogere dichtheden ei, dus meestal uitvoeren getimede kruisingen tussen 4 gevonden. De vliegen leggen hun eieren bij kamertemperatuur in een donker en keert terug naar de incubator de volgende dag om niet het normale licht-donker cyclus in de incubator verstoren.
- Houd flesjes met een voldoende aantal eieren (ongeveer groter dan 20) en op een 12-uur licht / donker-cyclus bij 22 graden Celsius te zijn warmte later geschokt.
3. Voer heat shock te induceren Mitotische recombinatie
- Ongeveer 85-100 uur na het leggen van eieren, plaats vials in een waterbad bij 37 ° C gedurende 1 uur. Zorg ervoor dat het water niveau bereikt boven de hoogte van de media in de flesjes, maar de flesjes niet volledig onderdompelen om te voorkomen dat de larven van de verdrinkingsdood.
- Verwijder flacons uit waterbad en laat een 1 uur herstelperiode bij RT.
- Plaats flesjes terug naar 37 graden Celsius waterbad gedurende 1 uur.
- Verwijder flacons uit waterbad en winkel in incubator op 12-uur licht / donker-cyclus bij 22 graden Celsius tot eclosion.
4. Voorbereiding voor Behavioral Testen
- Volgende eclosion, verdoven vliegen op ijs. Selecteer vliegt met genotypen die alle genetische elementen voor MARCM en een opgave GFP-expressie gemarkeerde klonen zal waarschijnlijk worden waargenomen op basis van het fenotype waarneembare markers gebruikt in de bovenliggende voorraden. Onthoofden vliegen met iridectomie schaar.
Opmerking: Zo hebben we voor vliegen gekozen zonder dat de genetische merkers Cyo (gekrulde vleugels) en Sb (stoppel borstel) naar identify vliegen die alle genetische elementen die nodig zijn om mozaïek regio te creëren zou bevatten gemarkeerd met GFP.
Opmerking: Onthoofding is nodig om te voorkomen dat de volwassenen uit wegvliegen wanneer gestimuleerd. - Plaats headless vliegen in een gesloten vochtige omgeving en laat ongeveer 10 - 20 uur herstel. Alleen gebruik vliegt dat recht zelf wanneer verstoord voor verdere testen. Test vliegt binnen de 30 uur van onthoofding.
5. Behavioral Testen
- Door het observeren onthoofde vliegen onder een fluorescentie microscoop ontleden, te identificeren homozygote klonen gemerkt met GFP in de borstelhaar uitwendige zintuigen. Noteer de naam van haren en links of rechts. Om mogelijke vertekening te elimineren, zou de lab lid uitvoeren van de borstelharen stimulatie blind voor het genotype van de borstelharen, wild-type of mutant zijn.
- Ontlokken een verzorgen reflex door het afbuigen van het GFP-gemarkeerd haren in de richting van de vlieg lichaam met een stijve haren of fijne tang en let op de been rerespons. Geef een score van één tot vliegen die hun been op te heffen in reactie op stimulatie en een score van nul tot vliegen die hun benen niet bewegen haren.
Opmerking: Eerdere studies 6,7 hebben het been respons die wordt opgewekt door het stimuleren van een bepaalde haren gekenmerkt. Dit omvat het been dat reageert op elke borstelhaar en het aandeel van vliegen die reageren op stimulatie van dat borstelhaar. We scoorden alleen voor bewegingen van het been, dat we verwacht hadden om te reageren op basis van Vandervorst's classificatie 6. - Voer vijf proeven afstand 2 min elkaar.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het succes van dit protocol grotendeels afhankelijk van de totale opbrengst van testbaar vliegen, de doeltreffendheid van de hitteschok mitotische recombinatie en het vermogen om een robuuste gedragsreactie in vliegen gestimuleerd op 2 minuten tussenpozen verkregen induceren. Aangezien schatting 12,5% van embryo's bevatten de noodzakelijke MARCM elementen en naar schatting 16,67% van de volwassenen die ESluit het potentieel voor GFP expressie, is het essentieel om een groot aanta...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol maakt gebruik van een volwassen gedrags assay voor het screenen op mutaties die mechanosensation in Drosophila beïnvloeden. Door de verzameling van mutanten bevat dodelijke p-element mutaties die uitsluit screening volwassenen Dit protocol maakt gebruik van complexe genetische techniek eerst beschreven door Lee en Luo , (1999) en gedetailleerd als een protocol door Wu en Luo, (2006) tot volwassen dodelijkheid omzeilen. MARCM induceert mitotische recombinatie tussen homologe chromosomen klonale gebi...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag bedanken de Bloomington voorraad centrum, Liqun Luo, Charles Zuker en Lily en Yuh Nung Jan voor de royale verdeling van de vlieg voorraden en de volgende voor financiering: Somas-URM (JD en SW), Bachelor Ford faculteit Summer Fellowship (SW), BD Corporation Summer Research Fellowship (aan CL en DL), The Renee en Anthony M. Marlon, MD '63 Summer Research Fellowship (DL) James C. '75 en Jane Colihan Summer Research Fellowship (TO) door middel van de Alumni / Parent Zomer Fund Research van de Universiteit van het Heilig Kruis en de Stransky Stichting Summer Research Fellowship (tot TO). Speciale dank aan het Departement Biologie en de Dean's Office van de Universiteit van het Heilig Kruis voor de ondersteuning van al het werk in het lab.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Brewers Yeast (25 lb) | MP Biomedicals | ICN90331225 | Fly Food |
| Corn (25 lb) | MP Biomedicals | ICN90141125 | Fly Food |
| Agar (1 lb) | MoorAgar Inc. | 41004 | Fly Food |
| Tegosept (5 kg) | Genesee | 20-259 | Fly Food |
| Molasses (1 Gallon) | Sugarmill Brand - Thomsen Food Service | 0 2625 | Fly Food |
| Propionic Acid | Fisher | A258-500 | Fly Food |
| Phosphoric acid | Fisher | A260-500 | Fly Food |
| Drosophila Vials, Narrow (PS) | Genesee | 32-109 | Fly Cultures |
| 6oz Square Bottom Bottle (PP) | Genesee | 32-130 | Fly Cultures |
| Flugs - Plastic Fly Bottles | Genesee | 49-100 | Fly Cultures |
| Rayon Balls, Large | Genesee | 51-100 | Fly Cultures |
| Droso-Filler, Narrow | Genesee | 59-168 | Fly Food Preparation |
| Droso-Filler, Bottles | Genesee | 59-170 | Fly Food Preparation |
| 8A-C / gear driven lab stirrer with c-clamp mount 1/15 HP, 700 rpm variable speed, 115 V, 50/60 Hz | Cleveland Mixer | 8A-C | Fly Food Preparation |
| Water jacketed Kettle | Fly Food Preparation | ||
| Diurnal Growth Chamber | Forma Scientific | Temperature and light/dark cycle controlled | |
| Water bath | VWR | For heat shock | |
| MicroScissors | Fine Science Tools | 15000-08 | For removing heads |
| Fluroscence Dissecting Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | With GFP cube (KSC295-814D) band pass filter |
| Fluroscence Light Source | Zeiss | X-Cite 120 | Fiber optic light pipe makes this easy to configure |
| Camera for Scope | Zeiss | AxioCam ICc1 | |
| Image acquistion software | Zeiss | ||
| Ice bucket | for cold anthesia | ||
| Homemade cold anthesia tray | for cold anthesia decapitation | ||
| Plastic boxes | for recovery of decaptitated flies in humid environment |
Referenties
- Grünert, U., Gnatzy, W. K+ and Ca++ in the receptor lymph of arthropod cuticular mechanoreceptors. J Comp Physiol A. 161, 329-333 (1987).
- Kernan, M. J. Mechanotransduction and auditory transduction in Drosophila. Pflugers Arch. 454, 703-720 (2007).
- Gillespie, P. G., Walker, R. G. Molecular basis of mechanosensory transduction. Nature. 413, 194-202 (2001).
- Corfas, G., Dudai, Y. Adaptation and fatigue of a mechanosensory neuron in wild-type Drosophila and in memory mutants. J Neurosci. 10, 491-499 (1990).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12, 1195-1206 (1994).
- Vandervorst, P., Ghysen, A. Genetic control of sensory connections in Drosophila. Nature. 286, 65-67 (1980).
- Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9, 56-62 (1989).
- Chen, J., et al. Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers. PLoS Biol. 3, e59(2005).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nature Protocols. 1, 2583-2589 (2006).
- Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila. J Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).
- Walker, R. G., Willingham, A. T., Zuker, C. S. A Drosophila mechanosensory transduction channel. Science. 287, 2229-2234 (2000).
- Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493, 221-225 (2013).
- Arnadottir, J., Chalfie, M. Eukaryotic Mechanosensitive Channels. Annual Review of Biophysics. 39, 111-137 (2010).
- Christensen, A. P., Corey, D. P. TRP channels in mechanosensation: direct or indirect activation? Nature Reviews Neuroscience. 8, 510-521 (2007).
- Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The Role of the TRP Channel NompC in Drosophila Larval and Adult Locomotion. Neuron. 67, 373-380 (2010).
- Lee, J., Moon, S., Cha, Y., Chung, Y. D. Drosophila TRPN(=NOMPC) channel localizes to the distal end of mechanosensory cilia. PLoS One. 5, e11012(2010).
- Liang, X., Madrid, J., Saleh, H. S., Howard, J. NOMPC, a Member of the TRP Channel Family, Localizes to the Tubular Body and Distal Cilium of Drosophila Campaniform and Chordotonal Receptor Cells. Cytoskeleton. 68, 1-7 (2011).
- de Vries, S. E., Clandinin, T. R. Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system. Curr Biol. 22, 353-362 (2012).
- Jarman, A. P. Studies of mechanosensation using the fly. Hum Mol Genet. 11, 1215-1218 (2002).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
