Evaluatie van Planar-Cell-Polariteit Phenotypes in ciliopathie Mouse Mutant Cochlea

Samenvatting

Primaire cilia beïnvloeden verschillende signaalroutes. De cochlea van zoogdieren is ideaal voor het onderzoeken van planaire celpolariteit (PCP) signalering. Cilia-disfunctie beïnvloedt cochleaire uitgroei, cellulaire patterning en oriëntatie van haarcellen, uitlezingen van PCP. Ons doel is om PCP-signalering in muis cochlea te analyseren via fenotypische analyse, immunohistologie en rasterelektronenmicroscopie.

Samenvatting

In de afgelopen jaren zijn primaire cilia naar voren gekomen als belangrijke regulatoren bij ontwikkeling en ziekte door hun invloed op talrijke signaalroutes. Een van de vroegste signaalroutes waarvan is aangetoond dat ze geassocieerd zijn met ciliaire functie, was de niet-canonieke Wnt-signaalroute, ook wel aangeduid als planaire celpolariteits (PCP)-signalering. Een van de beste plaatsen om de effecten van planaire celpolariteits (PCP)-signalering tijdens de ontwikkeling van gewervelde dieren te bestuderen, is de cochlea van zoogdieren. Verstoring van PCP-signalering in de cochlea van muizen verstoort de uitgroei van de cochlea, cellulaire patroonvorming en oriëntatie van haarcellen, die allemaal worden beïnvloed door ciliaire disfunctie. Het doel van dit protocol is om de analyse van PCP-signalering in de zich ontwikkelende cochlea van zoogdieren te beschrijven via fenotypopsporing, immunohistochemie en rasterelektronenmicroscopie. Defecten in convergentie en extensie manifesteren zich als een verkorting van het cochleaire kanaal en/of veranderingen in cellulaire patroonvorming, die kunnen worden gekwantificeerd na dissectie van zich ontwikkelende muismutanten. Veranderingen in de oriëntatie van stereociliaire bundels en de lengte of positie van kinocilia kunnen worden waargenomen en gekwantificeerd met behulp van immunofluorescence of rasterelektronenmicroscopie (SEM). Een dieper inzicht in de rol van ciliaire eiwitten in cellulaire signaalroutes en andere biologische fenomenen is cruciaal voor ons begrip van cellulaire en ontwikkelingsbiologie, evenals voor de ontwikkeling van gerichte behandelingsstrategieën.

Inleiding

Primaire cilia lange microtubule-gebaseerde aanhangsels die zich uitstrekken vanaf het oppervlak van de meeste zoogdierlijke cellen. Primaire cilia worden vaak verward met beweeglijke cilia, waarvan er altijd meerdere per cel, en waarvan het doel is om de vloeistof over membraanoppervlakken bewegen. Primaire cilia daarentegen vast sensorische rollen en derhalve ook wel sensorische cilia. Eenmaal lang vergeten, dit organel is onlangs herontdekt als gevolg van de associatie met een veelheid van menselijke genetische ziekten ^1. Idealiter gepositioneerd als een signalerende organel, heeft de primaire cilium aangetoond talrijke signaalwegen, waarvan vele niet alleen belangrijk in weefsel homeostase en ziekte, maar ook tijdens de ontwikkeling ² reguleren.

Een van de eerste signaalwegen aangetoond geassocieerd te zijn met cilia disfunctie de Wnt signaling pathway, ook bekend als het vlakke celpolariteit (PCP) pathway > 3. Dit signaalcascade aanvankelijk geïdentificeerd in Drosophila, is van cruciaal belang voor embryogenese; met name convergentie en extensie processen en de juiste oriëntatie van cellen in het vlak van epitheel ^4. De sequentiële signalering van een kern set van regulerende eiwitten vertaalt directionele signalen die uiteindelijk leiden tot het cytoskelet herschikkingen en resulteren in de gecoördineerde polarisatie van epitheelcellen in een vlak ^5. Het proces van convergentie en uitbreiding is absoluut noodzakelijk voor het cochleair kanaal te verlengen en voor de juiste cellulaire patroonvorming ^6. Aangezien dit gereguleerd via activatie van de PCP route, een van de meest opvallende fenotypen van mutanten cochlea PCP is een verkorte cochleair kanaal met ongeorganiseerd sensorische epithelia ^7. Evenzo muismutanten die cilia missen, vertonen ook zo'n convergentie en extensie fenotype ^8,9, maar precies hoe dit gereguleerd moet nog worden opgehelderd.

ve_content "> Omdat convergentie en extensie processen zijn van cruciaal belang voor de uitgroei van het cochleair kanaal, en cellulaire patroonvorming van de sensorische epitheel binnen het cochleair kanaal, de ontwikkelingslanden cochlea is een ideaal orgaan waarin PCP signalering te onderzoeken tijdens de ontwikkeling van gewervelde dieren. Het orgel van corti, de term voor de gespecialiseerde sensorische epitheel dat lijnen de cochleaire kanaal, bestaat uit niet-sensorische steuncellen en mechanosensorische haarcellen die uniform moeten worden georiënteerd om de cochlea functioneren ^10. de mechanosensorische haarcellen worden zo genoemd omdat de stereociliary bundels die zich uitstrekken van de cuticulaire plaat (apicale oppervlak) van elk zintuighaarcellen cel ^11. Deze fungeren als primaire omzetters van mechanosensation en ondanks hun nomenclatuur stereocilia, zijn eigenlijk samengesteld uit gemodificeerde actine-filament op basis van microvilli. Binnen elke chevron-vormige hair bundel, drie rijen stereocilia georganiseerd in een sterk geordende en regelmatige pattern in een trap-achtige manier. Real-microtubule gebaseerde trilharen, kinocilia genoemd, zijn vereist voor de ontwikkeling en oriëntatie van de stereociliary bundels ^12. Bij elke haar cel, wordt één kinocilium fysiek verbonden aan de stereocilia bundel, centraal gelegen naast de langste rij stereocilia. De precieze functie van de kinocilium is onduidelijk, en een hypothese is dat de kinocilium 'trekt' de stereocilia in vorm als ze volwassen worden van microvilli ^12. In vertebraten, kinocilia in de cochlea alleen aanwezig tijdelijk en intrekken van de haarcellen in muizen voorafgaand aan het begin van het gehoor ^11,13,14.

Volledig verlies van trilharen in de ontwikkeling van cochlea resulteert in sterk verkorte cochleaire kanalen, verkeerd gevormde of scheef georiënteerde stereociliary bundels, evenals verkeerd gepositioneerd basaalkorrels ^8,9. Een functioneel cilium is niet alleen bestaat uit het ciliaire axoneme. Veel eiwitten geassocieerd met ciliafunctie komen in complexen gelokaliseerd op cilia-gerelateerde subdomeinen, zoals de basale lichaam, overgangszone, of ciliaire axoneme ^15. De basale instantie, gebaseerd op de moeder centriole van het centrosoom, is een microtubulus organiserende centrum voor microtubules weg van de cilium uitstrekt in het cellichaam en kan intracellulair transport en ciliaire handel reguleren. De ciliaire overgangszone is een ander gebied waar de ciliaire functie is geregeld op het gebied van het organiseren van import en export van trilharen verbindingen ^16.

Meerdere studies hebben een verband tussen cilia en niet-canonieke Wnt (PCP signalering) geïdentificeerd, hoewel het precieze mechanisme is onduidelijk ^17. Redundantie van ciliaire en PCP genen en de gevoeligheid van de cel polariteit van algemene cellulaire abnormaliteiten, maken het moeilijk om direct een mutatie koppelen aan PCP-specifieke tekorten. Een van de uitlezingen van PCP signalering is de positionering van de basale lichaamstemperatuur en primary cilium, dus scheiden de primaire uit de secundaire gebreken is uitdagend. Sommige studies in zebravis en muis mutanten hebben geen verband tussen de trilharen en Wnt signalering ^18-20 voorgesteld. Discrepanties in de gegevens kunnen species, weefsel of tijdelijke-afhankelijke verschillen in ciliaire bijdragen aan Wnt-signalering weerspiegelen. Bovendien zou normaal Wnt reactievermogen blijven, indien basale lichamen blijven functioneren. Een beter inzicht in de rol van ciliaire eiwitten in cellulaire signaalroutes en andere biologische verschijnselen is cruciaal voor ons begrip van cellulaire en ontwikkelingsbiologie en voor de ontwikkeling van gerichte behandelingsstrategieën.

Protocol

Gebruik en euthanaseren alle dieren in overeenstemming met de institutionele en bestuurlijke richtlijnen en voorschriften, meestal via CO ₂ inademing en cervicale dislocatie.

1. Bereiding van reagentia

NB: Voorafgaand aan het begin, voor te bereiden alle reagentia met behulp van analytische chemicaliën. Maak oplossingen met behulp van moleculair-biologische kwaliteit gedestilleerd en gedemineraliseerd water, tenzij anders aangegeven.

1. Fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x PBS): Voeg 1 L 1X PBS door het oplossen van 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na ₂ HPO ₄ en 0,24 g KH _{2PO 4} in 1 liter _H2O Breng de pH op 7,4 met HCl. PBS hoeft niet steriel te zijn en kan bij kamertemperatuur worden opgeslagen. Merk op dat deze buffer zonder _CaCl2 of _MgCl2.
2. Paraformaldehyde (4% PFA): Bereid een 4% oplossing van PFA in 1x PBS in een geventileerde zuurkast. 40 g paraformaldehyde poeder toe te voegen aan 1 liter 1x PBS. Op te lossen, roer en verhit tot ongeveer 60 ° C,en voeg langzaam NaOH druppelsgewijs aan de pH te verhogen. Zodra het poeder is opgelost, stel de pH op 7,4 met HCl. Filtreer door een 0,45 pm filter en vries porties. Ontdooi een verse portie voor elk experiment.
3. Triton buffer: Bereid een 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100 oplossing door het oplossen van 8,77 g NaCl in 1 liter 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5). Voeg 1 ml Triton X-100. Roer om op te lossen. WINKEL Triton buffer bij kamertemperatuur.
4. Triton blok: Bereid 10% geit serum in Triton-buffer door het toevoegen van 1 ml van de geit serum tot 9 ml van Triton buffer. Bewaren bij 4 ° C. Bij gebruik van primaire antilichamen opgewekt in muizen, voeg geit anti-muis IgG Fab fragmenten bij een verdunning van 1 in 200 tot de Triton blok voor de blokkeringsstap.
   OPMERKING: Indien plan om monsters voor scanning elektronenmicroscopie (SEM) gebruikt, aanvullende reagentia bereid zoals hieronder vermeld.
5. Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) met calcium en magnesium: Maak een 1x oplossing van HBSS door verdunning van een voorraad oplossingin steriel gedestilleerd _H2O Zoals HBSS buffer is ingewikkeld te maken en er zijn risico's, is het raadzaam om een ​​premade 10x voorraad-oplossing te bestellen. De eindconcentratie van HBBS buffer routinematig gebruikt is de volgende: 1,26 mM _CaCl2, 0,49 mM _MgCl2 -6H2O, 0,41 mM MgSO ₄ -7H2O, 5,33 mM KCI, 0,44 mM KH _{2PO 4,} 4,17 mM NaHCO _3, 137,93 mM NaCl , 0,34 mM Na ₂ HPO _4, 5,56 mM dextrose.
6. Hepes buffer: Bereid een 0,1 M Hepes oplossing in 1x HBSS, door het oplossen van 23,8 g HEPES in 1 L 1x HBSS buffer.
7. Scanning elektronenmicroscopie fixeermiddel (SEM Fix): Bereid fixatief SEM door verdunnen elektronenmicroscopie rang glutaaraldehyde (2,5%) en paraformaldehyde (4%) in Hepes buffer. Voeg _CaCl2 tot een eindconcentratie van 10 mM.
8. 1% osmiumtetroxide (OsO ₄₎ in Hepes buffer; 1% osmiumtetroxide in water: Verdun een voorraadoplossing van osmiumtetroxide in Hepes buffer, en separately in steriel gedestilleerd H ₂ O, tot een eindconcentratie van 1%. Osmiumtetroxide is zeer toxisch en wordt meestal verkocht als een 4% oplossing.
9. 1% (w / v) Looizuur: Los 0,5 g looizuur in 50 ml steriel gedistilleerd H ₂ O. Filter steriliseer filtreren door een 0,45 poriegrootte filter.
10. Graded ethanoloplossing serie: Verdun 200 proof ethanol met steriel gedestilleerd H ₂ O tot 30, 50, 70, 90 en 95% ethanoloplossingen maken. Voor het laatste ethanol spoelingen, wordt 100% ethanol 200 bewijsstukken. Gebruik een vers geopende fles van 200 proof ethanol voor de finale spoelingen.

2. Keuze van de Tissue

1. In het ideale geval te onderzoeken embryo's of jonge honden in de leeftijd tussen embryonale dag 16,5 (E16.5) en postnatale dag 3 (P3).
   LET OP: verbening van de benige labyrint en temporele botten maakt dissectie steeds meer uitdagend als muizen rijpen. Ook kinocilia, de enige echte microtubule-gebaseerde cilium vinden op cochleaire haarcellen,trekt tijdens de ontwikkeling en is niet meer in volwassen muizen.
2. Na fixatie, ontkalken volwassen cochleae. Place ontleed (zie paragraaf 3) benige labyrinten, in 2 ml EDTA (4,13% in PBS), pH 7,3, in een microcentrifugebuis voor 3-4 dagen met rotatie. Vul EDTA dagelijks. Nadat de weefsels zacht spoelen in 1,5 ml PBS of 3 keer gedurende 5 minuten op een nutator met verhoogde roeren.

3. Cochlea Dissection

1. Bericht euthanization via cervicale dislocatie of _CO 2 inhalatie (100% CO ₂₎ en verwijder de kop. Gebruik een scalpel of schaartje, afhankelijk van de grootte van het dier de kop ontleden langs de sagittale middellijn vanaf de neus en caudaal uitstrekken. Verwijder de hersenen uit elke helft van de schedel met een pincet. Identificeer de temporele botten, waardoor de ontwikkeling van benige labyrinten van het binnenoor bevatten (zie pijl in figuur 1A).
2. Gebruik een paar voorCEPS aan de benige labyrinten van de schedel (temporale botten) zorgvuldig te isoleren. Doe dit onder een dissectie microscoop. Prise weg het botweefsel van de schedel door het uitvoeren van de tang voorzichtig onder het benige labyrinten. In dieren tot P4 de benige labyrint nog kraakbeen en kan gemakkelijk worden verwijderd zonder te breken.
3. Na dissectie, met de punt van het ontleden tang om de ovaal en rond leeg te maken en een gaatje in de apex van de cochleaire spiraal. Bevestig de benige labyrint voordat verdere dissectie van het cochleair kanaal. Om te zorgen voor een gemakkelijke verwijdering van de tectorial membraan (zie 3.7), bevestig de benige labyrinten in 1,5 ml 4% PFA gedurende 5 minuten op ijs.
   LET OP: Als het verwijderen van de tectorial membraan niet nodig is, wordt langer fixatie geadviseerd (zie 4,1-4,3). Korte fixatie van de rotsbeenderen vóór dissectie van de cochleaire kanaal helpt het proces dissectie en verwijdering van de tectoriaal membraan. Bericht dissectie en blootstelling van het orgaan van Corti, furthaar bevestiging vereist.
4. Verdere ontleden de benige labyrint om naar het cochleair sensorische epitheel bloot als volgt. Plaats de benige labyrinten in een zwart siliconen-elastomeer gecoate ontleden schotel met PBS tot dissectie te vergemakkelijken. Gebruik minutien pinnen om het weefsel te immobiliseren indien nodig. Om minutien pinnen te gebruiken, plaatst u deze door middel van het evenwichtsorgaan deel van de benige labyrint met het ventrale aspect van de cochleaire spiraal naar boven.
   LET OP: Black silicone elastomeer gerecht: Meng siliconen elastomeer basiscomponent met poederkool tot een ondoorzichtige zwarte kleur te verkrijgen. Voeg het hardingsmiddel en giet het in een of meer petrischalen (glas of plastic). Droog onder vacuüm om ingesloten luchtbelletjes te verwijderen. Opgedroogde vaat volledig vóór gebruik.
5. Gebruik fijne pincet (# 5) aan de buitenste kraakbeen waardoor de cochleaire put genomen. Begin bij het ovale venster; Steek de onderste uiteinde van de tang in het ovale venster en voorzichtig wrikken openen het kraakbeen, langzaam omhoog naar detop.
6. Na blootstelling van het cochleair kanaal, verwijder het ventrale oppervlak van de Reissner membraan. Met een fijne tang de Reissner membraan knijpen aan de basis van de cochleaire kanaal en afschilferen boven te bewegen. Visualiseren het dorsale aspect van de cochleaire kanaal, inclusief de sensorische epitheel.
7. Verwijder de tectoriale membraan zoals hieronder beschreven (optioneel). Voor SEM of immunohistochemie van de kinocilium of stereociliary bundels verwijder de tectorial membraan.
8. Gebruik een zeer fijne pincet (# 55 of fijner) aan de tectoriaal membraan knijpen aan de basis van het slakkenhuis en schil omhoog naar de top.
   OPMERKING: Het tectoriaal membraan optisch helder is, waardoor het moeilijk te identificeren. Vaak is het membraan loskomt uit een stuk en hoewel het niet gemakkelijk gevisualiseerd, kan men de weerstand voelen als wordt afgetrokken van de blootgestelde orgaan van Corti.
9. Na blootstellen van het orgaan van Corti, het weefsel d verder oplossenHieronder escribed. Bewaar het vestibulaire regio verdere bereiding van het weefsel bevorderen.

4. fixatie

1. Regelmatige immunohistochemie bevestig de benige ontleed labyrinten in 1,5 ml 4% PFA bij 4 ° C op een nutator voor 2 uur.
   Opmerking: Door de gevoeligheid van verschillende antilichamen en antigenen, variaties in de lengte en samenstelling van fixatie gewenst zijn en moeten worden geoptimaliseerd voor elk antilichaam.
2. Na fixatie was de monsters door spoelen in 1,5 ml PBS of 3 keer gedurende 5 minuten op een nutator met verhoogde roeren. De monsters kunnen worden opgeslagen in PBS bij 4 ° C gedurende enkele weken vóór de verwerking.
3. Als voorbereiding monsters voor SEM, fix ontleed rotsbeenderen in SEM fix (zie 1.7) gedurende 2 uur bij KT. Wassen spoelen in 1,5 ml of meer Hepes buffer 3 maal gedurende 5 minuten op een nutator met verhoogde roeren. Bewaren in Hepes-buffer bij 4 ° C tot verdere verwerking. Opslag langer dan een paar van de weeks wordt niet aanbevolen.

5. Immunohistochemie

1. Voer immunohistochemie op ontleed monsters in een putje van een vlakke bodem 96 wells plaat. U kunt ook gebruik maken van een PCR of microcentrifugebuis. Het is raadzaam om het vestibulaire deel van de benige labyrint behouden om verwerking te vergemakkelijken.
2. Permeabilize het weefsel door te incuberen in 1,5 ml Triton-buffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een nutator onder zacht schudden.
3. Blokkeer de weefsel door te incuberen in 0,5 ml Triton blok gedurende ten minste 1 uur bij KT. Bij gebruik van primaire antilichamen opgewekt in muizen, voeg anti-muis IgG Fab-fragmenten aan het blok bij een verdunning van 1 op 200 (zie paragraaf 1.4). Dit vermindert sterk niet-specifieke binding van anti-muis IgG aan muis weefsel.
4. Incubeer het weefsel met primaire antilichamen verdund in Triton blok O / N bij 4 ° C onder zacht schudden. Antilichaam verdunning is afhankelijk van antilichamen worden gebruikt (zie paragraaf 6.1). Als alternatief broeden primaire antibodies gedurende 2 uur bij KT. Gebruik bij voorkeur een minimaal volume van 0,5 ml primaire antilichaam verdunning. Als antilichaam is beperkt, de kleinst volume antilichaam verdunning waarin het weefsel volledig omhult.
5. Was het weefsel door spoelen in 1,5 ml Triton-buffer of meer, minstens 3 maal gedurende 15 minuten op een nutator met verhoogde roeren.
6. Incubeer het weefsel met fluorescerende kleurstof-geconjugeerde secundaire antilichamen verdund tot de fabrikant aanbevolen concentratie (gewoonlijk 1: 200-1: 1000) in blok Triton gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een nutator. Gebruik een minimaal volume van 0,5 ml secundair antilichaam verdunning.
   1. Centrifugeer de verdunde secundaire antilichaam bij 13.000 xg gedurende 3 min vóór gebruik van niet-specifieke binding van secundair antilichaam aggregaten minimaliseren. Scherm de weefsel van licht van deze stap verder om te voorkomen dat fotobleken van de fluorescerende kleurstoffen.
7. Zoals in stap 5,5, was het weefsel door spoelen in 1,5 ml Triton-buffer of meer, minstens 3 maal gedurende 15 min, op eennutator met verhoogde roeren. WINKEL monsters in PBS bij 4 ° C tot klaar voor montage.

6. Antibody Selection

LET OP: De bron van de aanbevolen antilichamen en hun verdunningen worden vermeld in de tabel van specifieke materialen en apparatuur. Voer antilichaam incubaties zoals beschreven in hoofdstuk 5.

1. Het microtubule-gebaseerde kinocilium visualiseren, gebruikt een ciliaire axoneme merker zoals anti-Arl13b (1: 1000) of anti-geacetyleerd-α-tubuline (1: 800). Visualiseren basislichaamstemperatuur gebruikmaking van een antilichaam tegen γ-tubuline (1: 200) of andere centrosomal marker.
2. De actine filament-rijke stereociliary bundels visualiseren, voeg phalloidin (1: 300 - 1000) geconjugeerd aan een van de verschillende fluoroforen aan het secundaire antilichaam incubatie. Phalloidin etiketten ook andere filamenteus actine structuren zoals de corticale actine filamenten rond de omtrek van elke epitheliale haarcellen. Dit is handig bij het bepalende omtrek van elke haar cel. Gebruik een ander membraan merker zoals anti-Zo-1 (1: 500) indien nodig.
3. Label cochleaire haarcellen met behulp van antilichamen tegen myosine VI (1: 1000) of myosine VIIa (1: 1000). Deze kunnen worden gebruikt als de beoordeling cochlea lengte.

LET OP: Gebruik de juiste fluorescerende kleurstof-geconjugeerde secundaire antilichamen geoptimaliseerd om de microscoop eisen.

7. Montage en Imaging

1. Plaats het monster in een zwarte siliconen elastomeer schotel met PBS. Met behulp van fijne tang, verwijder het vestibulair regio uit de cochleaire spiraal.
2. Heel voorzichtig verwijderen van de onderliggende kraakbeen en mesenchym uit het cochleaire spiraal. De resterende cochleaire spiraal bevat de binnenste sulcus, orgaan van Corti en buitenste sulcus.
3. Breng de cochleaire spiraal in een druppel PBS geplaatst op een microscoopglaasje. Desgewenst scheiden de cochleaire spiraal in stukken gelijk aan een slag. Deze stap is evenwel niet nodig en kunnen leiden tot loss van het weefsel. De apicale oppervlak (stereocilia zijde) van de cochleaire haarcellen moet naar omhoog naar het dekglaasje.
4. Wick weg de PBS met een adsorbens weefsel of een stuk filtreerpapier en voorzichtig de positie van de cochleaire spiraal als de epitheel is verschoven en overlappingen op zichzelf.
5. Voeg een druppel van de montage media direct op de cochlea monster en voorzichtig plaats een dekglaasje op de top, de zorg om luchtbellen te voorkomen. Geen afstandhouders vereist; Plaats het dekglaasje direct op het monster. Een in water oplosbare, niet-fluorescerende, semi-permanente bevestiging medium dat extra stappen niet vereist dat het dekglaasje op hun plaats te houden wordt aanbevolen. Montage media en dekglaasje dikte moet worden afgestemd op de specificaties microscoop.
6. Gebruik een epifluorescerende of laser-scanning confocale microscoop met hoge vergroting (63 - 100x), hoge numerieke apertuur (1,2-1,4) doelstellingen beelden van het apicale oppervlak van de cochleaire haarcellen vangen. gebruik lower doelstellingen (5 - 20X) overlappende beelden van de cochleaire spiraal om de lengte van het cochleair kanaal kwantificering. Match excitatie lasers en emissie filters om fluoroforen gebruikt voor secundaire antilichamen.

8. Scanning Electron Microscopy

1. Ga verder met paragraaf 4.3. Na het wassen van SEM gefixeerde monsters in Hepes buffer, voert u de volgende stappen onder ventilatie. Het volgende protocol werkt goed voor cochlea weefsel en vermijdt het gebruik van sputter coating met een geleidend metaal.
2. Post-fix in 1% OsO ₄ in Hepes buffer gedurende 1 uur, gevolgd door 3 wassingen met 1 ml gedestilleerd water gedurende 5 minuten elk. De kleinste hoeveelheid OsO ₄ dat het weefsel volledig omhult worden gebruikt voor giftig afval te minimaliseren. Nr roeren vereist.
3. Incubeer monsters bij kamertemperatuur in elk van de volgende oplossingen 1 uur met 3 wassingen met 1 ml gedestilleerd water gedurende 5 minuten elk in tussen stappen: 1% tannine vers in water en filtreerd vóór gebruik; 1% OsO ₄ in water, 1% tannine in water, 1% OsO ₄ in water.
4. Uitdrogen monsters door een ethanolreeks door incubatie gedurende 10 min in elk van de volgende verdunningen: 30, 50, 70, 90 en 95%. Nr roeren vereist.
5. Doorvoermonsters via drie wijzigingen, 5 minuten elk, van 100% ethanol (uit een nieuw geopende fles 200 proof ethanol).
6. Run de monsters hoewel een kritisch punt droger volgens de instructies van de fabrikant.
7. Monteer de monsters met behulp van geleidende koolstofkleefband bovenop een SEM stub voorafgaand aan beeldvorming op een elektronenmicroscoop. Onder een stereomicroscoop, gebruik maken van een paar fijne pincet en een penseel om voorzichtig te positioneren van het monster met het cochleair epitheel naar boven. Gebruik het vestibulaire deel van het monster "anker het weefsel aan de stub. WINKEL monsters in een exsiccator tot beeldvorming. Voeren SEM beeldvorming zoals beschreven in Jones (2012) ^21.

9.kwantificatie

1. Na immunohistochemie voorbereiding, het verwerven van beelden met behulp van een epifluorescerende of laser-scanning confocale microscoop. Na voorbereiding van SEM, gebruikt een scanning elektronenmicroscoop beeld specimens. Afbeelding het apicale oppervlak van het orgaan van Corti met de blootgestelde cochleaire haarcellen en steuncellen geïntercaleerd.
2. specifieke posities definieert langs het cochleair kanaal, zoals 25, 50 en 75% van de basis en deze gebruiken om cochlea gebieden te vergelijken tussen mutant en controlemonsters. Analyseren en vergelijken cilia mutanten met hun nestgenoot controles, zoals verschillen in genetische achtergrond de cochleaire fenotype kunnen wijzigen.
   Opmerking: Het orgaan van Corti ontwikkelt in een gradiënt die zich uitstrekt vanaf het midden van basis naar zowel de top en de basis. In de muis ontwikkeling is pas voltooid P14, dus is het belangrijk om gebieden te vergelijken met vergelijkbare ontwikkelingsstadia en posities.
3. Maak foto's met behulp van software die bij de microscoop dat allow kwantificering van de specifieke fenotype vereist (zie hieronder). Met beeldanalyse software zoals Image J of software die bij de microscoop om lengten te meten, tellen cellen en eiwit lokalisatie bepalen zoals hieronder beschreven. Grafiek deze gegevens als een staafdiagram, scatterplot, doos vlek of histogram, het vergelijken van mutant versus controle.
4. Totale lengte van het cochleair kanaal (figuur 3A):
   1. Behulp van een haar cel merker of phalloidin (die de stereociliary bundels markeert) bepalen en te meten waar het sensorische epitheel begint en eindigt. De lengte van het cochleair kanaal wordt vaak afgekort in trilharen mutanten.
5. Stereociliary bundel afwijkingen (figuur 3B, D, E, G):
   1. Meet bundel convexiteit (hoogte) als de kortste afstand tussen de top van de bundel en de lijn die zich uitstrekt door beide uiteinden van de bundel "armen", zoals getoond in figuur 3G, links. Als alternatief kwantificeren het gebiedomvat door de armen van de buitenste haarcellen stereociliary bundel zoals getoond in figuur 3G, rechts. Als haarcellen cirkelvormige stereociliary bundels kunnen worden geïdentificeerd tellen deze als een percentage van de totale haarcellen.
      LET OP: In veel trilharen mutanten kunnen bundel abnormaliteiten worden vastgesteld, ongeacht bundel oriëntatie. Het is moeilijk om nauwkeurig te kwantificeren stereociliary bundel afwijkingen.
6. Oriëntatie van de stereociliary bundels (Figuur 3B, C, G):
   1. Beoordeel de oriëntatie van elke afzonderlijke bundel ten opzichte van een lijn loodrecht uitstrekt op de rij pilaar cellen die de binnenste en buitenste haarcellen scheidt. Cellen met een normale richting worden uitgelijnd langs deze loodlijn as en dus een rotatie van 0 °. Bepaal rotatiehoeken behulp van een 360 ° notatie of absolute afwijking van 0 °.
7. Kinocilia positioneren of stereociliary bundel positionering (figuur3B, F, H):
   1. Tel het percentage cellen waarin kinocilia ontbreken. Meet de afstand tussen de kinocilium naar de "top" of het midden van de bundel. De 'top' van de bundel kan niet gemakkelijk te bepalen of bundels abnormaal, en dus het midden van de bundel kan worden aangehouden worden.
8. Kwantificeren van de positie van kinocilia en stereociliary bundels op de apicale haar celoppervlak door overlappen een positionele raster op elke haarcellen en markeren van de plaats van ofwel de basis van de kinocilium of de top / centrum van de stereociliary bundel. Tonen de gegevens als een percentage van elke categorie die in een specifiek gebied van het raster ligt, en bedekken de locaties van elke streep op een positionele raster.
   Opmerking: In controle weefsels kinocilia altijd aan de top van de stereociliary bundel. In cilia mutanten, worden kinocilia vaak ontbreekt, maar mislocalized nog steeds verbonden, of zelfs volledig los van de stereociliary bundel.
9. Kinocilia lengte (Figuur 3I):
   1. Meet de lengte van de kinocilium door het merken met een ciliaire axoneme marker. Alleen meten kinocilia die plat liggen binnen een 1,5 urn confocale vlak. Controleer of cilia plat liggen door het observeren van een dwarsdoorsnede van het gescande weefsel. Vergelijk leeftijd paste monsters van hetzelfde gebied van de cochlea aangezien de kinocilium terugtrekt tijdens de ontwikkeling.
10. Mislocalisatie van polariteit eiwitten:
    1. Na immunohistochemie met behulp van antilichamen tegen polariteit eiwitten zoals Vangl2 en Gai3, bepalen de lokalisering via beeldvorming.

LET OP: In sommige cilia mutanten, is lokalisatie van de polariteit eiwitten verstoord. Deze omvatten Vangl2 en Gai3, waarvan is aangetoond dat om te worden verstoord in Ift20, Bbs8 en Bbs6 mutant slakkenhuis.

LET OP: Verdere voorbeelden voor hoe te kwantificeren en weer haar cel Polarity kan worden gevonden in de volgende papiersoorten. Curtin et al. (2003) Current Biology ^22, Montcouquiol, et al. (2003) Nature ^7, Wang, et al (2006) The Journal of Neuroscience ^23, Montcouquiol, et al. (2008) Methods in Molecular Biology ^24, mei-Simera, et al. (2012) Methods in Molecular Biology ^25, Yin et al (2012) PLoS One ^26.

Resultaten

Slakkenhuis Dissection en Tissue Voorbereiding

Na verwijdering van de hersenen, post middellijn sagittale dissectie van een P0 muis hoofd, de benige labyrint, van achteren gezien, kunnen worden gevisualiseerd (Figuur 1A, witte pijl) en verwijderd. Figuur 1B toont de geïsoleerde benige labyrint met cochleair haren naar boven, ventrale, (links) en van achteren, dorsale (rechts)....

Discussie

Bij de voorbereiding van cochleaire weefsel voor analyse, er zijn een paar belangrijke punten in gedachten te houden. Ten eerste, de verschillen in genetische achtergrond kan het cochleair fenotype aan te passen, waardoor het noodzakelijk is om te analyseren en te vergelijken alleen nestgenoot controles. Ten tweede is volledige verwijdering van de tectoriaal membraan vereist om de beste beelden met immunohistochemie verkrijgen en is essentieel voor SEM. Het tectoriaal membraan een ondoorzichtige structuur en kunnen de c...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Tools/Equipment
Silicone elastomere - Sylgard 184	Sigma-Aldrich	761028-5EA	Zie opmerking 2
Micro dissecting scissors-straight blade	Various
Fine forceps (no. 5 and 55) and blunt forceps	Various
Dissecting microscope.	Various
Uncoated glass microscope slides	Various
Microscope cover slips (22 mm × 40 mm × 0.15 mm)	Various
Transfer pipettes	Various
Minutien pins	Fine Science Tools	26002-10
SEM sample holder	tousimis	8762
Scanning electron microscopy studs	TED PELLA	16111
PELCO Tabs: Carbon adhesive	TED PELLA	16084-3
Fluorescent Microscope	Various
Critical Point Dryer	Various
Scanning Electron Microscope	Various
Glass microscope slides	Various
Glass coverslips	Various
Kimwipe Tissue	Various
Fine Paint Brush
Reagents
1× Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco/Life Technologies	10010023
Paraformaldehyde  (PFA) (EM Grade Required for EM)	Various		Bereid een 4% oplossing in 1× PBS die elke keer vers gemaakt wordt. EM Grade Required for EM.
2.5% Glutaraldehyde Grade1	Sigma-Aldrich	G5882
Tris-HCl (pH 7.5)	Various
NaCl	Various
CaCl 2	Various
Triton X-100	Various
Normal Goat Serum	Various
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-007-003
Fluoromount-G Mounting media	SouthernBiotech	0100-01
10× Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco/Life Technologies	14065
Hepes	Gibco/Life Technologies	15630-080
Osmium tetroxide (OsO4 )	Sigma-Aldrich/Fluka Analytical	75632
Tannic acid	Sigma-Aldrich	403040
Ethanol 200 proof	Various
Antibodies
anti Arl13b	Protein Tech	17711-1-AP	Voorgestelde concentratie 1:1.000
anti acetylated tubulin (611-B1)	Sigma-Aldrich	T6793	Voorgestelde concentratie 1:800
anti gamma tubulin (GTU-88)	Sigma-Aldrich	T6557	Voorgestelde concentratie 1:200
anti Zo_1	Invitrogen	40-2300	Voorgestelde concentratie 1:500
Myosin VI	Proteus Biosciences	25-6791	Voorgestelde concentratie 1:1000
Myosin VIIa	Proteus Biosciences	25-6790	Voorgestelde concentratie 1:1.000
anti Vangl2	Merk Millipore	ABN373	Voorgestelde concentratie 1:250
anti Gαi3	Sigma-Aldrich	G4040	Voorgestelde concentratie 1:250
Alexa Fluor® 488 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12379	Voorgestelde concentratie 1:300 - 1.000
Alexa Fluor® 568 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12380	Voorgestelde concentratie 1:300 - 1.000