Primaire cilia beïnvloeden verschillende signaalroutes. De cochlea van zoogdieren is ideaal voor het onderzoeken van planaire celpolariteit (PCP) signalering. Cilia-disfunctie beïnvloedt cochleaire uitgroei, cellulaire patterning en oriëntatie van haarcellen, uitlezingen van PCP. Ons doel is om PCP-signalering in muis cochlea te analyseren via fenotypische analyse, immunohistologie en rasterelektronenmicroscopie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Evaluatie van Planar-Cell-Polariteit Phenotypes in ciliopathie Mouse Mutant Cochlea
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In de afgelopen jaren zijn primaire cilia naar voren gekomen als belangrijke regulatoren bij ontwikkeling en ziekte door hun invloed op talrijke signaalroutes. Een van de vroegste signaalroutes waarvan is aangetoond dat ze geassocieerd zijn met ciliaire functie, was de niet-canonieke Wnt-signaalroute, ook wel aangeduid als planaire celpolariteits (PCP)-signalering. Een van de beste plaatsen om de effecten van planaire celpolariteits (PCP)-signalering tijdens de ontwikkeling van gewervelde dieren te bestuderen, is de cochlea van zoogdieren. Verstoring van PCP-signalering in de cochlea van muizen verstoort de uitgroei van de cochlea, cellulaire patroonvorming en oriëntatie van haarcellen, die allemaal worden beïnvloed door ciliaire disfunctie. Het doel van dit protocol is om de analyse van PCP-signalering in de zich ontwikkelende cochlea van zoogdieren te beschrijven via fenotypopsporing, immunohistochemie en rasterelektronenmicroscopie. Defecten in convergentie en extensie manifesteren zich als een verkorting van het cochleaire kanaal en/of veranderingen in cellulaire patroonvorming, die kunnen worden gekwantificeerd na dissectie van zich ontwikkelende muismutanten. Veranderingen in de oriëntatie van stereociliaire bundels en de lengte of positie van kinocilia kunnen worden waargenomen en gekwantificeerd met behulp van immunofluorescence of rasterelektronenmicroscopie (SEM). Een dieper inzicht in de rol van ciliaire eiwitten in cellulaire signaalroutes en andere biologische fenomenen is cruciaal voor ons begrip van cellulaire en ontwikkelingsbiologie, evenals voor de ontwikkeling van gerichte behandelingsstrategieën.
Inleiding
Primaire cilia lange microtubule-gebaseerde aanhangsels die zich uitstrekken vanaf het oppervlak van de meeste zoogdierlijke cellen. Primaire cilia worden vaak verward met beweeglijke cilia, waarvan er altijd meerdere per cel, en waarvan het doel is om de vloeistof over membraanoppervlakken bewegen. Primaire cilia daarentegen vast sensorische rollen en derhalve ook wel sensorische cilia. Eenmaal lang vergeten, dit organel is onlangs herontdekt als gevolg van de associatie met een veelheid van menselijke genetische ziekten 1. Idealiter gepositioneerd als een signalerende organel, heeft de primaire cilium aangetoond talrijke signaalwegen, waarvan vele niet a....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Gebruik en euthanaseren alle dieren in overeenstemming met de institutionele en bestuurlijke richtlijnen en voorschriften, meestal via CO 2 inademing en cervicale dislocatie.
1. Bereiding van reagentia
NB: Voorafgaand aan het begin, voor te bereiden alle reagentia met behulp van analytische chemicaliën. Maak oplossingen met behulp van moleculair-biologische kwaliteit gedestilleerd en gedemineraliseerd water, tenzij anders aangegeven.
- Fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x PBS): Voeg 1 L 1X PBS door het oplossen van 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4 en 0,24 g KH 2PO 4 in 1 liter ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Slakkenhuis Dissection en Tissue Voorbereiding
Na verwijdering van de hersenen, post middellijn sagittale dissectie van een P0 muis hoofd, de benige labyrint, van achteren gezien, kunnen worden gevisualiseerd (Figuur 1A, witte pijl) en verwijderd. Figuur 1B toont de geïsoleerde benige labyrint met cochleair haren naar boven, ventrale, (links) en van achteren, dorsale (rechts)........
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Bij de voorbereiding van cochleaire weefsel voor analyse, er zijn een paar belangrijke punten in gedachten te houden. Ten eerste, de verschillen in genetische achtergrond kan het cochleair fenotype aan te passen, waardoor het noodzakelijk is om te analyseren en te vergelijken alleen nestgenoot controles. Ten tweede is volledige verwijdering van de tectoriaal membraan vereist om de beste beelden met immunohistochemie verkrijgen en is essentieel voor SEM. Het tectoriaal membraan een ondoorzichtige structuur en kunnen de c.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteur verklaart geen concurrerende financiële belangen te hebben.
Dankbetuigingen
De auteur wil graag bedanken Matthew Kelley, Tiziana Cogliati, Jessica Gumerson, Uwe Wolfrum, Rivka Levron, Viola Kretschmer en Zoe Mann en hun kritische evaluatie van het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door de Sofja Kovalevskaya Award (Humbodlt Foundation) en de Johannes-Gutenberg Universiteit, Mainz, Duitsland.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Tools/Equipment | |||
| Silicone elastomere - Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | Zie opmerking 2 |
| Micro dissecting scissors-straight blade | Various | ||
| Fine forceps (no. 5 and 55) and blunt forceps | Various | ||
| Dissecting microscope. | Various | ||
| Uncoated glass microscope slides | Various | ||
| Microscope cover slips (22 mm × 40 mm × 0.15 mm) | Various | ||
| Transfer pipettes | Various | ||
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SEM sample holder | tousimis | 8762 | |
| Scanning electron microscopy studs | TED PELLA | 16111 | |
| PELCO Tabs: Carbon adhesive | TED PELLA | 16084-3 | |
| Fluorescent Microscope | Various | ||
| Critical Point Dryer | Various | ||
| Scanning Electron Microscope | Various | ||
| Glass microscope slides | Various | ||
| Glass coverslips | Various | ||
| Kimwipe Tissue | Various | ||
| Fine Paint Brush | |||
| Reagents | |||
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco/Life Technologies | 10010023 | |
| Paraformaldehyde (PFA) (EM Grade Required for EM) | Various | Bereid een 4% oplossing in 1× PBS die elke keer vers gemaakt wordt. EM Grade Required for EM. | |
| 2.5% Glutaraldehyde Grade1 | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Tris-HCl (pH 7.5) | Various | ||
| NaCl | Various | ||
| CaCl 2 | Various | ||
| Triton X-100 | Various | ||
| Normal Goat Serum | Various | ||
| AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| 10× Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life Technologies | 14065 | |
| Hepes | Gibco/Life Technologies | 15630-080 | |
| Osmium tetroxide (OsO4 ) | Sigma-Aldrich/Fluka Analytical | 75632 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| Ethanol 200 proof | Various | ||
| Antibodies | |||
| anti Arl13b | Protein Tech | 17711-1-AP | Voorgestelde concentratie 1:1.000 |
| anti acetylated tubulin (611-B1) | Sigma-Aldrich | T6793 | Voorgestelde concentratie 1:800 |
| anti gamma tubulin (GTU-88) | Sigma-Aldrich | T6557 | Voorgestelde concentratie 1:200 |
| anti Zo_1 | Invitrogen | 40-2300 | Voorgestelde concentratie 1:500 |
| Myosin VI | Proteus Biosciences | 25-6791 | Voorgestelde concentratie 1:1000 |
| Myosin VIIa | Proteus Biosciences | 25-6790 | Voorgestelde concentratie 1:1.000 |
| anti Vangl2 | Merk Millipore | ABN373 | Voorgestelde concentratie 1:250 |
| anti Gαi3 | Sigma-Aldrich | G4040 | Voorgestelde concentratie 1:250 |
| Alexa Fluor® 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Voorgestelde concentratie 1:300 - 1.000 |
| Alexa Fluor® 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Voorgestelde concentratie 1:300 - 1.000 |
Referenties
- Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).
- May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1, 7(2012).
- Ross, A. J., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
