Genererende Primaire fibroblastculturen van Mouse Oor en de Staart Tissues

Samenvatting

We beschrijven een eenvoudige en snelle experimentele procedure voor het genereren van primaire fibroblasten uit de oren en staarten van muizen. De werkwijze vereist geen speciale dierendressuur en kan worden gebruikt voor het genereren van fibroblast cultures van oren opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende maximaal 10 dagen.

Samenvatting

Primaire cellen zijn direct afgeleid uit weefsel en men denkt dat meer representatief voor de fysiologische toestand van cellen in vivo dan gevestigde cellijnen. Echter, primaire celculturen hebben meestal een beperkte levensduur en moeten worden vaak hersteld. Fibroblasten zijn een gemakkelijk toegankelijke bron van primaire cellen. Hier bespreken we een eenvoudige en snelle testprocedure primaire fibroblast kweken van oren en staarten van muizen vastgesteld. Het protocol kan worden gebruikt om primaire fibroblast kweken vaststellen van oren opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende maximaal 10 dagen. Wanneer het protocol nauwkeurig gevolgd, verontreinigingen waarschijnlijk optreden, ondanks het gebruik van niet-steriele opgeslagen voor langere tijd in sommige gevallen. Fibroblasten vermenigvuldigen zich snel in de cultuur en kan worden uitgebreid tot aanzienlijke aantallen voor het ondergaan van replicatieve veroudering.

Inleiding

Primaire cellen zijn afkomstig van levende weefsels en gekweekt onder in vitro omstandigheden. Algemeen wordt aangenomen dat primaire cellen meer lijken op de fysiologische toestand en de genetische achtergrond van het weefsel waaruit ze afkomstig zijn dan geïmmortaliseerde of tumorcellijnen ^1. Om die reden, primaire cellen vormen een bruikbaar model voor het bestuderen van biologische vraagstukken ^2,3. Anders dan gevestigde cellijnen die oneindig groeien primaire cellen uiteindelijk ondergaan senescentie in kweek en moeten vaak hersteld.

Algemeen gebruikte primaire cellen omvatten fibroblasten, epitheelcellen, endotheelcellen, T-cellen, B-cellen, beenmerg afgeleide macrofagen (BMDM) en beenmerg afgeleide dendritische cellen (BMDC). Fibroblasten worden vaak gebruikt als primaire celcultuur model. Ze bieden belangrijke voordelen ten opzichte van andere primaire cellen. Celculturen worden gemakkelijk vastgesteld, gemakkelijk onderhouden en vereisen geen Purificatie van de cellen voorafgaand aan de cultuur. Ze hebben een snelle initiële proliferatie en geen vereiste voor specialistische middelgrote of activering protocollen. Fibroblasten kunnen efficiënt worden getransfecteerd met behulp van biologische, chemische en fysische protocollen ^4,5. Er is een mogelijkheid om de oren slaan voor maximaal 10 dagen bij kamertemperatuur voorafgaand aan vaststelling van celculturen. Fibroblastculturen bevorderlijk zijn voor visualisatie van cytoplasmatische processen en geschikt voor het herprogrammeren in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen ^6.

Fibroblasten zijn belangrijke cellen van het bindweefsel dat collageen eiwitten en extracellulaire matrix ⁷ uitscheiden. Zij bieden de structureel kader in vele weefsels ^{8 en} spelen een essentiële rol in de wondgenezing en weefselherstel ^9,10.

Hier beschrijven we een eenvoudige en snelle (<4 uur) protocol om fibroblast culturen uit oren en staarten van muizen ¹¹ vast te stellen. Het protocol vereist minimale muiservaring om de weefsels te oogsten (in tegenstelling tot andere protocols ^12,13) ​​en kan worden gebruikt om kweken van oren opgeslagen in medium bij kamertemperatuur gedurende maximaal 10 dagen vast.

Protocol

Muizen werden gehuisvest in pathogeenvrije omstandigheden in overeenstemming met de institutionele richtlijnen tot euthanization (De Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) richtlijnen aan de Nationale Universiteit van Singapore en de Nationale Adviescommissie voor Laboratory Animal Research (NACLAR) richtlijnen).

1. Muizen

1. Bestel een muis van de juiste genetische achtergrond. Dit protocol is gebaseerd op weefsels afkomstig van een C57BL / 6 muis.

2. Bereiding van compleet medium

1. Bereid compleet medium door toevoeging van de volgende componenten aan Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium: 10% foetaal kalfsserum (FCS), 50 uM 2-mercaptoethanol, 100 uM asparagine, 2 mM glutamine, 1% penicilline-streptomycine oplossing.

3. Bereiding van enzymoplossingen

1. Bereid collagenase D oplossing in een 15 ml conische bodem buis.
   1. Weeg 10 mg collagenase D. Dissolve collagenase D in 4 ml compleet medium.
2. Bereid pronase oplossing in een 1,7 ml microcentrifugebuis.
   1. Weeg 10 mg pronase.
   2. Voeg 5 ul van 1 M Tris-buffer (pH 8,0). Voeg 1 pl 0,5 M EDTA (pH 8,0).
   3. Bijvullen met 494 ul steriel water.
   4. Incubeer de pronase oplossing bij 37 ° C in een waterbad gedurende 30 min.

4. Voorbereiding van de Collagenase D-pronase Mix (≤2 Tails)

Opmerking: Voer de volgende stappen in een steriele celkweek kap.

1. Voeg 250 ul van pronase oplossing van 4 ml collagenase D oplossing.
2. Passeer de collagenase D-pronase mengsel door een 0,2 um spuit filter in een steriele 15 ml conische bodem buis.

5. Winning van fibroblasten van oor en Tail Tissues

1. Euthanaseren muizen volgens de passende institutionele richtlijnen.
2. Plaats geautoclaveerd chirurgische instrumenten (schaar en pincet) in de celkweek kap.
3. Voeg 10 ml compleet medium in twee 10 cm celcultuurschalen elk.
4. Knip oren (~ 1 cm straal) en 5 cm van de staart (vanaf de punt van de staart) van een muis met een schaar en incubeer gedurende 5 min in 40 ml 70% ethanol in een steriele 50 ml conische bodem buis.
5. De lucht drogen oren en staart door ze in een open 10 cm celkweek schotel in de kap 5 min. Eenmaal gedroogd, overdracht oor en staartstukken twee kweekschalen label "oren" en "staart" met 10 ml compleet medium zoals beschreven in stap 5.3.
6. Haal haar uit de oren en staart met een schaar.
7. Snijd oren en staart in stukken kleiner dan 3 mm groot met een schaar.
8. Breng de snede weefsels in 1,8 ml cryotube flesjes label "oren" en "staart" en voeg voldoende collagenase D-pronase oplossing voor het volume van de 1,8 ml markering op de flacon te bereiken.
9. Pkant de cryotube flesjes horizontaal op een shaker en schud de monsters bij 200 rpm gedurende 90 min bij 37 ° C.
10. Na 90 min incubatie, verwijder de cryotube flacons uit de shaker en plaats de flacons in de kap.
11. Voeg 10 ml compleet medium in twee 10 cm celkweek gerechten, het label "oren" en "staart" elk, en zet een 70 um cel zeef in elk gerecht.
12. Plaats de verteerde oor en staart weefsels in de 70 micrometer cel zeef in de dienovereenkomstig geëtiketteerd gerechten bereid in stap 5.11 en krachtig maal de weefsels met behulp van een 10 ml spuit zuiger> 5 min. Schud de cel zeef af en toe op de middellange tot de cellen te wassen uit de cel zeef.
13. Pipet de celsuspensie uit elk gerecht in twee 15 ml conische bodem buizen label "oren" en "staart". Was de schaal en zeef met extra 10 ml compleet medium en voeg het medium om de juiste 15 ml konische buisjes.
14. Spin down de celsuspensie gedurende 7 min bij ~ 580 xg en 4 ° C met een koelcel centrifuge.
15. Verwijder supernatant, voeg 10 ml compleet medium aan de celpellet in 15 ml conische bodem buis en resuspendeer de cellen.
16. Herhaal stap 5.14 en 5.15.

6. Opkweek celmengsel

1. Verwijder supernatant. Zorg ervoor dat de cel pellet blijft ongestoord.
2. Resuspendeer cellen in 10 ml compleet medium en voeg het mengsel respectievelijke twee 10 cm celcultuurschalen label "oren" en "staart".
3. Voeg 10 ul amfotericine B oplossing (voorraadoplossing: 250 ug / ml) aan de kweek.
4. Incubeer cellen bij 37 ° C in een bevochtigde 5% _CO2 incubator.
5. Op de derde dag vervangen door het medium 10 ml vers compleet medium bevattende 10 ui van amfotericine B om vuil te verwijderen (Figuren 1 en 2).

7. Sub-cultuur van fibroblasten

1. When cultuur bereikt ongeveer 70% confluentie (dag 3-4 van de cultuur), verwijder het medium en was de cellen met 5 ml steriel 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
2. Verwijder PBS en voeg 2 ml steriel 1x trypsine-EDTA-oplossing aan de cellen.
3. Incubeer de cellen gedurende 5 min bij 37 ° C in een bevochtigde 5% _CO2 incubator.
4. Na 5 minuten, tik de cultuur schotel en voeg 6 ml compleet medium aan de cellen.
5. Breng de celsuspensie om een ​​15 ml conische bodem buis en spin de buis gedurende 5 minuten bij ~ 450 xg en 4 ° C met een koelcel centrifuge.
6. Verwijder supernatant en voorzichtig resuspendeer de celpellet in 5 ml compleet medium.
7. Seed 2 x 10 ⁵ cellen in een 10 cm celkweekschaal en incubeer de cellen bij 37 ° C in een bevochtigde 5% _CO2 incubator gedurende 3-4 dagen voor het herhalen van stappen 7,1-7,6.

8. Voorbereiding van de Oren voor verzending

Opmerking: Voer thij volgende stappen in een steriele celkweek kap.

1. Euthanaseren muizen volgens de passende institutionele richtlijnen.
2. Plaats geautoclaveerd schaar en pincet in de celkweek kap.
3. Voeg 50 ml compleet medium in een 50 ml conische bodem buis.
4. Knip oren (~ 1 cm straal) van een muis met een schaar.
5. Breng de oren in de 50 ml conische bodem buis (zoals bereid in stap 3) onder gebruikmaking van een tang.
6. Verzegeling van de 50 ml conische bodem buis met parafilm voor de scheepvaart bij RT in een geschikte doos.

Resultaten

Extractie van fibroblasten uit weefsel resulteert in een significante hoeveelheid weefsel resten (figuur 1). In tegenstelling tot weefselafval, fibroblasten zich aan weefselkweek kunststof oppervlakken tussen dag 1 en 3 van de cultuur. Het medium fibroblast cultures kunnen veilig worden veranderd op dag 3 van de cultuur, die aanzienlijk de niveaus van vuil in de kweek (figuur 2) moet verminderen. Fibroblasten tonen een langwerpige morfologie en een duidelijk zichtbare cytoplasma

Discussie

Hier geven we een eenvoudige, goedkope en snelle testprocedure primaire fibroblast kweken van oren en staarten van muizen vastgesteld. De extractie moet resulteren in hechtende en snel delende fibroblasten binnen 3 dagen na isolatie van het weefsel. Een belangrijke beperking van primaire cellen veroudering, een permanente groeistop ^15. Met behulp van het protocol kan fibroblast kweken worden doorgekweekt gedurende 5 tot 6 keer vóór fibroblasten worden senescente, aangegeven door de afvlakking van de cellen in...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
RPMI-1640	HyClone	SH30027.01
Fetal Calf Serum	HyClone	SV30160.03
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Asparagine	Sigma-Aldrich	A4159
Glutamine	Sigma-Aldrich	G8540
Penicillin/Streptomycin	HyClone	SV30010
Ethanol	Merck Millipore	107017	Absolute for analysis
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088866001	From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile
Pronase protease	Merck Millipore	53702	From Streptomyces griseus
Tris buffer (pH 8)	1st BASE	1415	Ultra pure grade
0.5M EDTA (pH 8)	1st BASE	BUF-1053	Biotechnology grade
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	1st BASE	BUF-2040-10X4L	Ultra pure grade
Trypsin-EDTA solution 10X	Sigma-Aldrich	59418C-100ML	0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2492-20ml	250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered
Scissors	Aesculap
Forcep	Aesculap	AE-BD312R
0.2 μM syringe filter	Sartorius Stedim	16534
70 μM cell strainer	SPL	93070
Syringe plunger	Terumo	SS+10L
Cryovial tube	NUNC	368362
1.7 ml microcentrifuge tube	Axygen	MCT-175-C
10 cm cell culture dish	Greiner	664160	Cell culture treated dish
15 ml conical bottom tube	Greiner	188271
50 ml conical bottom tube	Greiner	227261
Water bath	GFL	1002
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Incubation shaker	Sartorius Stedim		Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 light microscope	Carl Zeiss AG