We beschrijven een eenvoudige en snelle experimentele procedure voor het genereren van primaire fibroblasten uit de oren en staarten van muizen. De werkwijze vereist geen speciale dierendressuur en kan worden gebruikt voor het genereren van fibroblast cultures van oren opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende maximaal 10 dagen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Genererende Primaire fibroblastculturen van Mouse Oor en de Staart Tissues
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Primaire cellen zijn direct afgeleid uit weefsel en men denkt dat meer representatief voor de fysiologische toestand van cellen in vivo dan gevestigde cellijnen. Echter, primaire celculturen hebben meestal een beperkte levensduur en moeten worden vaak hersteld. Fibroblasten zijn een gemakkelijk toegankelijke bron van primaire cellen. Hier bespreken we een eenvoudige en snelle testprocedure primaire fibroblast kweken van oren en staarten van muizen vastgesteld. Het protocol kan worden gebruikt om primaire fibroblast kweken vaststellen van oren opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende maximaal 10 dagen. Wanneer het protocol nauwkeurig gevolgd, verontreinigingen waarschijnlijk optreden, ondanks het gebruik van niet-steriele opgeslagen voor langere tijd in sommige gevallen. Fibroblasten vermenigvuldigen zich snel in de cultuur en kan worden uitgebreid tot aanzienlijke aantallen voor het ondergaan van replicatieve veroudering.
Inleiding
Primaire cellen zijn afkomstig van levende weefsels en gekweekt onder in vitro omstandigheden. Algemeen wordt aangenomen dat primaire cellen meer lijken op de fysiologische toestand en de genetische achtergrond van het weefsel waaruit ze afkomstig zijn dan geïmmortaliseerde of tumorcellijnen 1. Om die reden, primaire cellen vormen een bruikbaar model voor het bestuderen van biologische vraagstukken 2,3. Anders dan gevestigde cellijnen die oneindig groeien primaire cellen uiteindelijk ondergaan senescentie in kweek en moeten vaak hersteld.
Algemeen gebruikte primaire cellen omvatten fibroblasten, epitheelcell....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Muizen werden gehuisvest in pathogeenvrije omstandigheden in overeenstemming met de institutionele richtlijnen tot euthanization (De Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) richtlijnen aan de Nationale Universiteit van Singapore en de Nationale Adviescommissie voor Laboratory Animal Research (NACLAR) richtlijnen).
1. Muizen
- Bestel een muis van de juiste genetische achtergrond. Dit protocol is gebaseerd op weefsels afkomstig van een C57BL / 6 muis.
2. Bereiding van compleet medium
- Bereid compleet medium door toevoeging van de volgende componenten aan Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 164....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Extractie van fibroblasten uit weefsel resulteert in een significante hoeveelheid weefsel resten (figuur 1). In tegenstelling tot weefselafval, fibroblasten zich aan weefselkweek kunststof oppervlakken tussen dag 1 en 3 van de cultuur. Het medium fibroblast cultures kunnen veilig worden veranderd op dag 3 van de cultuur, die aanzienlijk de niveaus van vuil in de kweek (figuur 2) moet verminderen. Fibroblasten tonen een langwerpige morfologie en een duidelijk zichtbare cytoplasma
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier geven we een eenvoudige, goedkope en snelle testprocedure primaire fibroblast kweken van oren en staarten van muizen vastgesteld. De extractie moet resulteren in hechtende en snel delende fibroblasten binnen 3 dagen na isolatie van het weefsel. Een belangrijke beperking van primaire cellen veroudering, een permanente groeistop 15. Met behulp van het protocol kan fibroblast kweken worden doorgekweekt gedurende 5 tot 6 keer vóór fibroblasten worden senescente, aangegeven door de afvlakking van de cellen in.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflict van financiële aard.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de NRF-subsidie HUJ-CREATE - Cellulaire en Moleculaire Mechanismen van Ontsteking.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| RPMI-1640 | HyClone | SH30027.01 | |
| Fetal Calf Serum | HyClone | SV30160.03 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159 | |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 107017 | Absolute for analysis |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088866001 | From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile |
| Pronase protease | Merck Millipore | 53702 | From Streptomyces griseus |
| Tris buffer (pH 8) | 1st BASE | 1415 | Ultra pure grade |
| 0.5M EDTA (pH 8) | 1st BASE | BUF-1053 | Biotechnology grade |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | 1st BASE | BUF-2040-10X4L | Ultra pure grade |
| Trypsin-EDTA solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | 0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2492-20ml | 250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered |
| Scissors | Aesculap | ||
| Forcep | Aesculap | AE-BD312R | |
| 0.2 μM syringe filter | Sartorius Stedim | 16534 | |
| 70 μM cell strainer | SPL | 93070 | |
| Syringe plunger | Terumo | SS+10L | |
| Cryovial tube | NUNC | 368362 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 cm cell culture dish | Greiner | 664160 | Cell culture treated dish |
| 15 ml conical bottom tube | Greiner | 188271 | |
| 50 ml conical bottom tube | Greiner | 227261 | |
| Water bath | GFL | 1002 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Incubation shaker | Sartorius Stedim | Certomat-BS1 | |
| Zeiss Axiovert 25 light microscope | Carl Zeiss AG |
Referenties
- Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications. Biomater Sci. 3 (1), 12-24 (2015).
- Elenbaas, B., et al. Human breast cancer cells generated by oncogenic transformat....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
