Imaging Membraan Potentiële twee soorten genetisch gecodeerde Fluorescent Voltage Sensors

Sungmoo Lee; Hong Hua Piao; Masoud Sepheri-Rad; Arong Jung; Uhna Sung; Yoon-Kyu Song; Bradley J. Baker

doi:10.3791/53566

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Imaging Membraan Potentiële twee soorten genetisch gecodeerde Fluorescent Voltage Sensors

10.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53566

⸱

4 februari 2016

Sungmoo Lee¹^,² , Hong Hua Piao² , Masoud Sepheri-Rad² , Arong Jung²^,³ , Uhna Sung² , Yoon-Kyu Song¹^,⁴ , Bradley J. Baker²

¹Department of Transdisciplinary Studies, Graduate School of Convergence Science and Technology, Seoul National University, ²Center for Functional Connectomics, Korea Institute of Science and Technology, ³College of Life Sciences and Biotechnology, Korea University, ⁴Advanced Institutes of Convergence Technology

In dit artikel

Samenvatting

Een methode voor het afbeelden van veranderingen in membraanpotentiaal met behulp van genetisch gecodeerde spanningsindicatoren wordt beschreven.

Samenvatting

Genetisch gecodeerde spanningsindicatoren (GEVI's) zijn verbeterd tot het punt dat ze beginnen te worden gebruikt voor in vivo opnames. Hoewel het uiteindelijke doel is om neuronale activiteit in vivo te beeldhouwen, moet men in staat zijn om de activiteit van een enkele cel te beeldhouwen om succesvolle in vivo voorbereidingen te garanderen. Deze procedure zal beschrijven hoe het membraanpotentieel in een enkele cel kan worden gevisualiseerd om een basis te bieden voor uiteindelijke in vivo visualisatie. Hier beschrijven we methoden voor het beeldhouwen van GEVI's bestaande uit een spanningsgevoelig domein gefuseerd met een enkel fluorescerend eiwit (FP) of twee fluorescerende eiwitten die in staat zijn tot Förster resonantie energieoverdracht (FRET) in vitro. Het gebruik van een beeldsplitser maakt het mogelijk om beelden gecreëerd door twee verschillende golflengten gelijktijdig op dezelfde beeldsensor (CCD) camera te projecteren. De beeldsplitser plaatst een tweede filterkubus in de lichtbaan. Deze tweede filterkubus bestaat uit een dichroïsche spiegel en twee emissiefilters om de donor en acceptor fluorescente golflengten te scheiden, afhankelijk van de FP's van de GEVI. Deze opstelling maakt het mogelijk om zowel de acceptor als de donor fluorescente partners gelijktijdig op te nemen terwijl het membraanpotentieel wordt gemanipuleerd via een whole-cell patch clamp configuratie. Bij gebruik van een GEVI bestaande uit een enkel FP, kan de tweede filterkubus worden verwijderd waardoor de spiegels in de beeldsplitser een enkel beeld op de CCD-camera kunnen projecteren.

Inleiding

Het hoofddoel van dit artikel is het optische beeldvorming van veranderingen in membraanpotentialen in vitro gebruik van genetisch gecodeerde fluorescente proteïnen demonstreren. Imaging veranderingen in membraanpotentiaal biedt de spannende mogelijkheid bestuderen van de activiteit van neuronale circuits. Wanneer veranderingen in membraanpotentiaal resulteren in een verandering fluorescentie-intensiteit, elke pixel van de camera wordt een surrogaat elektrode waarmee nonintrusive metingen van neuronale activiteit. Al meer dan veertig jaar, hebben organische voltage-gevoelige kleurstoffen die bruikbaar zijn voor het observeren van de veranderingen in de membr....