Imaging Membraan Potentiële twee soorten genetisch gecodeerde Fluorescent Voltage Sensors

Summary

A method for imaging changes in membrane potential using genetically encoded voltage indicators is described.

Abstract

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate goal is to image neuronal activity in vivo, one must be able to image activity of a single cell to ensure successful in vivo preparations. This procedure will describe how to image membrane potential in a single cell to provide a foundation to eventually image in vivo. Here we describe methods for imaging GEVIs consisting of a voltage-sensing domain fused to either a single fluorescent protein (FP) or two fluorescent proteins capable of Förster resonance energy transfer (FRET) in vitro. Using an image splitter enables the projection of images created by two different wavelengths onto the same charge-coupled device (CCD) camera simultaneously. The image splitter positions a second filter cube in the light path. This second filter cube consists of a dichroic and two emission filters to separate the donor and acceptor fluorescent wavelengths depending on the FPs of the GEVI. This setup enables the simultaneous recording of both the acceptor and donor fluorescent partners while the membrane potential is manipulated via whole cell patch clamp configuration. When using a GEVI consisting of a single FP, the second filter cube can be removed allowing the mirrors in the image splitter to project a single image onto the CCD camera.

Introduction

Het hoofddoel van dit artikel is het optische beeldvorming van veranderingen in membraanpotentialen in vitro gebruik van genetisch gecodeerde fluorescente proteïnen demonstreren. Imaging veranderingen in membraanpotentiaal biedt de spannende mogelijkheid bestuderen van de activiteit van neuronale circuits. Wanneer veranderingen in membraanpotentiaal resulteren in een verandering fluorescentie-intensiteit, elke pixel van de camera wordt een surrogaat elektrode waarmee nonintrusive metingen van neuronale activiteit. Al meer dan veertig jaar, hebben organische voltage-gevoelige kleurstoffen die bruikbaar zijn voor het observeren van de veranderingen in de membr....

Protocol

Ethiek statement: Het experiment dier protocol werd bij KIST dier protocol 2014-001 goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite.

1. apparatuur Setup

1. Imaging setup
   1. Plaats een omgekeerde fluorescentie microscoop op een trillingsisolatie tafel. Gebruik een hoge vergrotingsfactor (60X olie-immersie objectief met 1,35 numerieke lensopening) objectief en een filter kubus uitgerust met een dichroïsche spiegel en filters die geschikt zijn voor de fluorescente eiwitten die gebruikt worden voor de spanning beeldvorming.
      Opmerking: Deze opstelling maakt gebruik van een omgekeerde microscoop om doelstell....

Results

Transient getransfecteerde cellen kunnen aanzienlijke verschillen in fluorescentie-intensiteit en de mate van plasmamembraan expressie vertonen. Zelfs op dezelfde dekglaasje sommige cellen variërende niveaus van interne fluorescentie hebben. Dit komt waarschijnlijk door de hoeveelheid transfectie agens opgenomen door de cel. Af te veel expressie veroorzaakt de cel ongevouwen eiwit die resulteert in apoptose ²⁷ ervaren (helder, ronde cellen met hoge inwendige fluorescentie). De.......

Discussion

Het zenuwstelsel gebruikt spanning op verschillende manieren remming veroorzaakt een lichte hyperpolarisatie, synaptische ingang veroorzaakt een lichte depolarisatie en een actiepotentiaal leidt tot een relatief grote spanningsverandering. Het vermogen om veranderingen in membraanpotentiaal meten door GEVIs biedt het veelbelovend potentieel gelijktijdig analyseren van verschillende componenten van neuronale circuits. In dit rapport tonen we een fundamentele methode voor het afbeelden veranderingen in de membraanpotentia.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted Microscope	Olympus	IX71
60X objective lens (numerical aperture = 1.35)	Olympus	UPLSAPO 60XO
Excitation filter	Semrock	FF02-472/30	For voltage imaging of super ecliptic pHluorin in Bongwoori
Dichroic mirror	Semrock	FF495-Di03-25x36
Emission filter	Semrock	FF01-497/LP
75W Xenon arc lamp	CAIRN	OptoSource Illuminator	LEDs and lasers are also effective light sources
Slow speed CCD camera	Hitachi	KP-D20BU
Dual port camera adaptor	Olympus	U-DPCAD
High speed CCD camera	RedShirtImaging, LLC	NeuroCCD-SM
Image splitter	CAIRN	Optosplit 2
Excitation filter	Semrock	FF01-475/23-25	For voltage imaging of FRET pair based GEVI consisting of Clover and mRuby2)
Dichroic mirror	Semrock	FF495-Di03-25x36
Emission filter	Chroma	ET520/40
Dichroic mirror	Semrock	FF560-FDi01-25X36
Emission filter	Chroma	ET645/75
Vibration isolation system	Kinetic systems	250BM-IC, 5702E-3036-31
Patching chamber	Warner instruments	RC-26G, 64-0235
#0 Micro Coverglass (22 x 40 mm)	Electron Microscopy Sciences	72198-20
Temperature controller	Warner instruments	TC-344B
#0 (0.08 ~ 0.13 mm) - 10 mm diameter glass coverslip	Ted Pella	260366
Lipofection agent	Life Technologies	11668-027
Calcium phosphate reagent	Clontech - Takara	631312
Patch clamp amplifier	HEKA	EPC 10 USB amplifier
Multi-channel data acquisition software	HEKA	Patchmaster
Image acquisition and analysis software	RedShirtImaging	Neuroplex
Spreadsheet application software	Microsoft	Microsoft Excel 2010
Data analysis software	OriginLab	OriginPro 8.6.0
Demagnifier	Qioptiq LINOS	Optem standard camera coupler 0.38x SC38 J clamp
Confocal microscope	Nikon	Nikon A1R confocal microscope
Anti-fade reagent	Life Technologies	P36930