Imaging Membraan Potentiële twee soorten genetisch gecodeerde Fluorescent Voltage Sensors

Summary

Een methode voor het afbeelden van veranderingen in membraanpotentiaal met behulp van genetisch gecodeerde spanningsindicatoren wordt beschreven.

Abstract

Genetisch gecodeerde spanningsindicatoren (GEVI's) zijn verbeterd tot het punt dat ze beginnen te worden gebruikt voor in vivo opnames. Hoewel het uiteindelijke doel is om neuronale activiteit in vivo te beeldhouwen, moet men in staat zijn om de activiteit van een enkele cel te beeldhouwen om succesvolle in vivo voorbereidingen te garanderen. Deze procedure zal beschrijven hoe het membraanpotentieel in een enkele cel kan worden gevisualiseerd om een basis te bieden voor uiteindelijke in vivo visualisatie. Hier beschrijven we methoden voor het beeldhouwen van GEVI's bestaande uit een spanningsgevoelig domein gefuseerd met een enkel fluorescerend eiwit (FP) of twee fluorescerende eiwitten die in staat zijn tot Förster resonantie energieoverdracht (FRET) in vitro. Het gebruik van een beeldsplitser maakt het mogelijk om beelden gecreëerd door twee verschillende golflengten gelijktijdig op dezelfde beeldsensor (CCD) camera te projecteren. De beeldsplitser plaatst een tweede filterkubus in de lichtbaan. Deze tweede filterkubus bestaat uit een dichroïsche spiegel en twee emissiefilters om de donor en acceptor fluorescente golflengten te scheiden, afhankelijk van de FP's van de GEVI. Deze opstelling maakt het mogelijk om zowel de acceptor als de donor fluorescente partners gelijktijdig op te nemen terwijl het membraanpotentieel wordt gemanipuleerd via een whole-cell patch clamp configuratie. Bij gebruik van een GEVI bestaande uit een enkel FP, kan de tweede filterkubus worden verwijderd waardoor de spiegels in de beeldsplitser een enkel beeld op de CCD-camera kunnen projecteren.

Introduction

Het hoofddoel van dit artikel is het optische beeldvorming van veranderingen in membraanpotentialen in vitro gebruik van genetisch gecodeerde fluorescente proteïnen demonstreren. Imaging veranderingen in membraanpotentiaal biedt de spannende mogelijkheid bestuderen van de activiteit van neuronale circuits. Wanneer veranderingen in membraanpotentiaal resulteren in een verandering fluorescentie-intensiteit, elke pixel van de camera wordt een surrogaat elektrode waarmee nonintrusive metingen van neuronale activiteit. Al meer dan veertig jaar, hebben organische voltage-gevoelige kleurstoffen die bruikbaar zijn voor het observeren van de veranderingen in de membraanpotentiaal ^1-4 geweest. Echter, deze kleurstoffen gebrek cellulaire specificiteit. Bovendien zijn sommige celtypen moeilijk te bevlekken. Genetisch gecodeerde spanningsindicatoren (GEVIs) deze beperkingen te ondervangen doordat de cellen specifiek te bestuderen drukken de fluorescerende spanningsgevoelige probe.

Er zijn drie klassen van GEVIs. De eerste klasse van GEVI maakt gebruik van de voltage-sensing domein van de spanning sensing fosfatase met ofwel een enkel fluorescerend eiwit (FP) ^5-9 of een Förster resonance energy transfer (FRET) paar ^10-12. De tweede klasse van sensoren maakt gebruik van microbiële rhodopsine als een fluorescerende indicator rechtstreeks ^13-15 of via elektrochrome FRET ^16,17. De derde klasse gebruikt twee componenten, de genetische component een membraan verankerd FP en een tweede component een membraan gebonden kleurstof ^18-20 quenching. Terwijl de tweede en derde klassen zijn bruikbaar voor in vitro experimenten en slice ^19,20, alleen de eerste klasse van sensoren zijn bruikbaar voor in vivo analyses ^6.

In dit verslag wij de beeldvorming van membraanpotentiaal tonen met de eerste klasse van GEVIs (figuur 1) in vitro. Dit eersteklas spanningssensoren is het makkelijkst om de overgang in vivo beeldvorming. Sinds GEVIs utilizing een spanningsgestuurde sensing domein gefuseerd aan een FP zijn ongeveer 50 maal helderder dan de rhodopsine klasse van sensoren, kunnen worden afgebeeld met behulp booglamp verlichting plaats van dat een zeer krachtige laser. Een ander gevolg van het verschil in helderheid dat de eerste klasse van GEVIs gemakkelijk de auto-fluorescentie van de hersenen kan overschrijden. De rhodopsine gebaseerde probes kan niet. De derde klasse van sensor even helder als de eerste klasse, maar vereist de toevoeging van een chemisch quencher die moeilijk toe te dienen in vivo.

Wij demonstreren daarom het verkrijgen van een probe met één FP (Bongwoori) ⁸ en een probe bestaande uit een FRET paar (Nabi 2) ^12. De FRET construeert in dit rapport zijn vlinder versies van VSFP-CR (voltage-gevoelige fluorescerende eiwitten - Clover-mRuby2) ^11, bestaande uit een groen fluorescerend donor, Clover, en een rode fluorescerende acceptor, mRuby2, genaamd Nabi 2,242 en 2,244 Nabi ^{12. In de inleiding van dit soort opnamen moeten onderzoekers een beter begrip van het type informatie GEVIs kan verschaffen.}

Figuur 1. Twee soorten genetisch gecodeerde Voltage Indicators (GEVIs) Bedrukte in dit rapport (A) Een mono FP gebaseerd GEVI met een trans-membraan-voltage sensing domein en een fluorescerend eiwit. (B) A FRET gebaseerd GEVI bestaat uit een trans-membraan-voltage sensing domein, een FRET donor en acceptor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

Ethiek statement: Het experiment dier protocol werd bij KIST dier protocol 2014-001 goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite.

1. apparatuur Setup

1. Imaging setup
   1. Plaats een omgekeerde fluorescentie microscoop op een trillingsisolatie tafel. Gebruik een hoge vergrotingsfactor (60X olie-immersie objectief met 1,35 numerieke lensopening) objectief en een filter kubus uitgerust met een dichroïsche spiegel en filters die geschikt zijn voor de fluorescente eiwitten die gebruikt worden voor de spanning beeldvorming.
      Opmerking: Deze opstelling maakt gebruik van een omgekeerde microscoop om doelstellingen dienst met hogere NA, maar rechtop microscopen kunnen ook worden gebruikt. Inderdaad, de geïnverteerde microscoop is voor ontwikkeling probe daar een grotere numerieke apertuur (NA) objectieflens verzamelt meer licht dan die met een lage NA waardoor de signaal-ruisverhouding (SNR te verbeteren, kan worden omschreven als de piek optische signaal gedeeld door de standaardafwijking van de basislijnfluorescentie) van de opname. Voor niet-ontwikkelaars, zouden we een rechtopstaande microscoop voor toepassingen zoals stuk of in vivo opname aanbevolen.
   2. Bereid een lichtbron, bijv., Xenon booglamp, uitgerust met een mechanische sluiter voor efficiënte epifluorescentie wide-field imaging. Richt het licht aan de microscoop via een lichtgeleider te monteren. Het licht zal door de excitatie- filter en wordt gereflecteerd door de eerste dichroïsche spiegel in het filter kubus. Lijn het licht om het monster gelijkmatig verlichten met maximale lichtintensiteit boven het gezichtsveld ^21.
      Let op: Traditioneel werd een 75 watt booglamp gebruikt sinds hoger wattage gloeilampen te maken groter, maar niet helderder verlichting velden. Lasers kunnen worden gebruikt, maar zijn beperkt tot een enkele golflengte. LED's worden steeds helderder en kan inderdaad de lichtbron van de keuze aanbieden van meerdere golflengtes en niet verplichten tot een mechanische sluiter zijn.
   3. Monteer de twee CCD-camera's om de tllingen microscoop zoals in Figuur 2D.
      Opmerking: De eerste CCD camera heeft een hoge ruimtelijke resolutie en wordt gebruikt voor de identificatie van een cel die de GEVI in het plasmamembraan te testen. Voor grafische veranderingen in de membraanpotentiaal, ervoor te zorgen dat de tweede CCD camera heeft een hoge framerate, zoals 1000 frames per seconde (fps). Gebruik een dual port camera adapter (figuur 2D (3)) naar de beeldvorming pad schakelen tussen de twee CCD-camera's. In deze opstelling wordt een demagnifier gebruikt om het beeld van het objectief past op de CCD chip in de tweede CCD camera.
   4. Installeer een beeld splitser tussen de eerste (traag) en tweede (snel) CCD camera's voor beeldvorming van FRET gebaseerde GEVI. Plaats een filter kubus met een dichroïsche spiegel (560 nm) en twee emissie-filters (520 nm / 40 en 645 nm / 75) in de afbeelding splitter. Dit zal resulteren in twee velden gezien, één voor de donor fluorescentie en de andere die de acceptor fluorescentie. Verwijder deze second filter kubus wanneer het afbeelden van een GEVI met een enkele FP.
      Opmerking: De single FP gebaseerd GEVI getest in deze methode is Bongwoori waarop de FP, super ecliptica pHluorin A227D (SE A227D) gebruikt. De excitatie filter (472 nm / 30), emissiefilter (497 nm / lange pass) en de dichroïsche spiegel (495 nm) werden geselecteerd op basis van de excitatie- en emissiespectra ^5. In het algemeen moet de excitatie en emissie filters de grootste overlap bij elk spectrum van de fluorofoor om een ​​helder beeld te verkrijgen terwijl de dichroïsche spiegel blokkeert excitatielicht via uitstralingsfilter verstrekte. De selectie van filters en dichroïsche spiegels voor het FRET paar ¹¹ gebaseerd GEVI opname volgt hetzelfde principe, behalve dat het noodzakelijk een tweede filter kubus in het beeld splitter voor gelijktijdige waarneming van donor en acceptor fluorescentie. Het eerste filter kubus geplaatst in het vak microscoop filter aan een excitatie filter (475 nm / 23) voor klaver hebben. Dan is de uitgezonden fluorescence Beide KP wordt door de eerste dichroïsche spiegel (495 nm) naar de tweede filter kubus toegezonden. De tweede filter kubus heeft een dichroïsche spiegel (560 nm) en twee emissie-filters (520 nm / 40 voor Clover en 645 nm / 75 voor mRuby2) voor elk FP waardoor de fluorescentie van twee verschillende KP's scheiden.

		Single FP gebaseerde GEVI (Bongwoori)	FRET paar gebaseerd GEVI (Nabi 2,42 & Nabi 2,44)
Eerste filter kubus geplaatst in de microscoop	excitatie filter	472 nm / 30	475 nm / 23
	dichroïsche spiegel	495 nm	495 nm
	emissie-filter	497 nm / lange pass	-
Tweede filter kubus geplaatst in de bundelsplitser	dichroïsche spiegel	-	560 nm
	emissie-filter 1	-	520 nm / 40
	emissie-filter 2	-	645 nm / 75

Tabel 1. Twee Verschillende Filter Sets gebruikt voor een enkele FP Gebaseerd GEVI en een FRET Based GEVI Recordings

2. trillingsisolatie
   1. Niet bevestigen alle apparatuur met bewegende onderdelen op het trillingsisolatie tafel. Zorgen dat de kabels die zijn aangesloten op niet-geïsoleerde apparatuur los trillingen van het monster te voorkomen.
3. Patch clamp kamer
   1. Dicht de bodem van de patch clamp kamer met een dunne # 0 dekglas omdat de werkafstand van het objektief relatief klein. Dit is een nadeel van de omgekeerde microscoop setup.
      Opmerking: Als een afweging van de hoge NA objectieflens, de werkafstand afneemt. Om de specimens te plaatsenen binnen zeer korte werkafstand, het dekglaasje en het dekglaasje (stap 2) dient zo dun mogelijk te zijn.
4. Temperatuurregeling
   1. Zorg ervoor dat het bad oplossing stroomt door een temperatuurregelaar aan de patched-cellen rond te behouden 33 ^o C gedurende het experiment.
5. apparatuuraansluitingen
   1. Sluit de patch clamp versterker en de mechanische sluiter van de lichtbron om de Bayonet Neill-Concelman (BNC) commando doos van de high speed CCD-camera. Dit zal de beeldvormende software in staat stellen de versterker camera en de lichtbron tegelijk bedienen.
      Opmerking: De elektrische en imaging componenten moeten worden gesynchroniseerd om te zorgen voor gelijktijdige elektrische en optische opnames van elektrische activiteit.

Figuur 2. Equipment Setup voor Voltage Imaging met GEVIs De workflow volgt het lichtpad, (A) 75W Xenon booglamp, (B) de excitatie licht van de booglamp wordt gefilterd door de excitatie filter en vervolgens gereflecteerd door de eerste dichroïsche spiegel voordat het tot aan het monster podium, een inzet op de rechterbovenhoek toont de gehele cel configuratie (C) de lage snelheid CCD-camera wordt gebruikt om zowel de keuze van een cel en patch clamp hulp, (D) het beeld overname deel; (1) de hoge snelheid CCD camera, (2) het beeld splitter voor zowel FRET koppelen en mono FP GEVIs, (3) de demagnifier om het beeld te passen op de CCD chip in de high speed CCD-camera, (4) de dubbele poort camera-adapter aan de beeldvorming route en (5) de lage snelheid CCD camera met een hoge ruimtelijke resolutie te schakelen voor de identificatie van de cel patch, (E & F) het beeld acquisitie met een single-FP gebaseerde GEVI (E) en een op FRET gebaseerde GEVI(F). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Expressie van GEVIs

1. In menselijke embryonale nier 293-cellen
   1. Cultuur humane embryonale nier 293 (HEK 293) cellen met Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum ^bij 37 ° C in _een CO2-incubator _(5% CO2). Gebruik een weefselkweekplaat van 100 mm diameter en 20 mm hoogte. Start de kweek met 2 x ^3-6 oktober x 10 ³ cellen / ^cm2 en geïncubeerd totdat zij 80-90% confluentie voor daaropvolgende transfectie bereikt.
   2. Op de dag van transfectie zuig het celmedium en voorzichtig was eenmaal met Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing. Verspreiden de HEK 293-cellen met 0,25% trypsine-EDTA gedurende 1-2 minuten, zuigen de oplossing en tik zachtjes tegen de schotel naar de c losells. Voeg verse DMEM (10% FBS) en distantiëren van de samengeklonterd cellen door pipetteren. Bepaal de celconcentratie met behulp van een hemocytometer.
   3. Place 0,08-0,13 mm dik, 10 mm dekglaasjes vooraf bekleed met poly-L-lysine in een 24-well weefselkweekplaat. Zaad de HEK 293 cellen op dekglaasjes in 1 x 10 ⁵ cellen / cm ² celdichtheid.
      Opmerking: Aangezien HEK 293-cellen kan vormen gap junctions met elkaar zijn, het aantal zaden moet geïsoleerde cellen werd verkregen.
   4. Tijdelijk transfecteren van de cellen met een geschikt genconstruct dat codeert voor een GEVI door een lipofectie reagens volgende instructies van de fabrikant.
      Opmerking: De genconstructen gebruikt voor deze stap gebruikt pcDNA3.1 (Bongwoori) en pUB2.1 (Nabi 2,242) als backbone vectoren. De hoeveelheid gebruikte DNA was 100 ng per dekglaasje; moeten echter transfectie omstandigheden empirisch bepaald worden voor elke GEVI te testen.
2. In gedissocieerde muis hippocampal primaire neuronen
   1. Ontleden hippocampus uit embryonale dag 17 C57BL6 / N muizen en vervolgens het dissociëren hippocampale neuronen zoals eerder beschreven ^22,23.
   2. De plaat gedissocieerd neuronen op met poly-D-lysine beklede 0,08-0,13 mm dik, 10 mm dekglaasjes in 1 x 10 ⁵ cellen / ml celdichtheid. Incubeer de cellen bij 37 ^o C CO ₂ incubator _(5% CO2).
   3. Het transfecteren gedissocieerd neuronen tijdelijk op 6-7 dagen in vitro (DIV) met een genconstruct dat codeert voor een GEVI door calciumfosfaat transfectie reagens zoals eerder beschreven ^24.
      Opmerking: De genconstructen voor deze stap gebruikt pcDNA3.1 (Bongwoori) en pUB2.1 (Nabi 2,244) als backbone vectoren. De hoeveelheid gebruikte DNA was 1 ug per dekglaasje. Ook hier moet transfectie omstandigheden empirisch bepaald voor elke geteste GEVI zijn.
3. Controleer de expressie niveau van voor spanning imaGing
   1. Neem de weefselkweek plaat uit de CO ₂ incubator en let op de fluorescentie van de getransfecteerde cellen onder een epifluorescentiemicroscoop.
   2. Na bevestiging van de fluorescentie van het membraan, de overdracht van de dekglaasje aan de patchen kamer voor de spanning beeldvorming in hoofdstuk 3.
      Opmerking: De spanning beeldvorming wordt uitgevoerd 16-24 uur na transfectie. Echter, zoals verschillende fluorescerende eiwitten hebben verschillende rijpen tijden, wat GEVIs hebben meer tijd nodig in post transfectie. Zo kan de FRET paren die mRuby2 in dit protocol langer uit te drukken, omdat de rijping van mRuby2 significant langer duurt dan ¹¹ klaver. De fluorescentie van donor en acceptor worden gecontroleerd.

3. Voltage Imaging Protocol

1. Kies een gezonde cel met goede membraan expressie
   1. Microscopische, vindt een gezonde cel (figuur 4B) die sterk toontgelokaliseerde fluorescentie in vergelijking met interne fluorescentie. Probeer afgeronde cellen niet te patchen. Cirkelvormige cellen worden ofwel verdelen of stervende en zijn moeilijk te patchen. Breng een testpuls van 5,0 mV in amplitude en 5,0 msec in duur tot de volgende patch clamp experimenten te helpen.
2. Bereid de cel spanning imaging
   1. Na het kiezen van een cel patch, plaatst u de patch clamp pipet boven de cel. Breng de pipet naar beneden totdat deze net tegen de celmembraan. Bij deze stap acht 1 MQ - 2 MQ toename membraanweerstand de patch clamp ²⁵ software.
      LET OP: soms kan een goede giga-ohm afdichting simpelweg gebeuren door het aanraken van het celmembraan. Zolang het giga-ohm afdichting stabiel is, moet het OK.
   2. Opzetten van een giga-ohm afdichting door voorzichtig het toepassen van negatieve druk door de pipet. Stel de pipet potentiaal op een gewenste potentiaal te houden.
   3. Met behoud van de giga-ohm afdichting, afbeelding the cel met de high speed CCD-camera en de focus aan het membraanoppervlak.
   4. Scheuren het celmembraan door het toepassen van pulsen van zuiging via de mond of de spuit voorzichtig om een hele cel configuratie ²⁶ te maken.
   5. Het imago van de patch geklemd cel onder een gehele cel clamp-configuratie op basis van de experimenteel ontwerp met behulp van een imaging software
      1. Start de imaging software. Klik [ACQUIRE] - menu [SciMeasure Camera] om het openstellen van de 'CCD ACQUIRE' pagina.
      2. Maak een nieuw gegevensbestand om de beelden op te slaan.
      3. Klik [analoge uitgang] en vervolgens [Lees een ASCII] het openen van een puls protocol bestand naar de beeldvorming te voeren. Klik op 'het gemiddelde van de interne herhalingen' als de gegevens moeten worden gemiddeld. Sluit vervolgens de 'Analoge uitgang' pagina.
         Opmerking: Deze puls protocol moet worden ontworpen en opgeslagen als een ".txt" map volgens het doel van elke proef voorafgaand aan deze stap.
      4. Stel specifieke acquisvulle parameters uit de 'CCD ACQUIRE' pagina. Voer de specifieke waarden voor 'Aantal frames voor overname' en 'Aantal trials'.
         Opmerking: Het aantal frames wordt bepaald door de snelheid van de verwerving en de timing van de puls protocol. Als bijvoorbeeld beeldvorming bij 1 kHz, 1000 frames gelijk aan 1 seconde opnametijd.
      5. Klik [NEMEN GEGEVENS (Optics + BNC)] knop om de opname te starten. Terwijl de spanning beeldvorming plaatsvindt, kijken naar de oscilloscoop venster van de patch clamp software om stabiele whole cell configuratie in de gehele opname.
         Opmerking: Om de GEVI's responsieve spanningsbereik testen, signaal grootte in AF / F-waarde of temporele resolutie in de hele fysiologische spanningsbereik, voeren een volledige cel voltage clamp experiment met een puls protocol te hebben stapte spanningspulsen variërend van -170 mV tot 130 mV. Om de prestaties van de GEVI te bepalen bij het oplossen van actiepotentialen opgewekt uit gekweekte primary neuronen, imago van de cel onder een whole cell stroomtang configuratie.

4. Data Acquisition

1. Berekening van de AF / F
   1. Start de imaging software. Klik op [FILE] - [Read Data File] om het openen van een bestand te analyseren. Let op de afbeelding cel in haar Resting Light Intensity (RLI) aan de rechterzijde
      Opmerking: De software gemiddelde eerste 5 frames RLI bepalen van de opname.
   2. Klik op 'Toon BNCs' om de stroom en spanning gemeten waarden naar het scherm te brengen.
   3. Wijzig de pagina-modus van 'RLI kader' naar 'Frame aftrekken' aan het frame aftrekken functie gebruiken om pixels met responsieve optische signalen te identificeren. Dit is de ware kracht van beeldvorming omdat elke pixel mogelijke veranderingen in fluorescentie kan worden onderzocht.
   4. Selecteer twee keer punten _(F 0 en F _{1) voor het} aftrekken. Tot welk gebied van de celgeeft signalen reagerend op potentiaalverandering membraan.
      Opmerking: De SNR voor het frame subtractiebeelden kan worden verbeterd door meerdere frames voor elk tijdstip temporeel gemiddelde van het signaal. De software trekt de gemiddelde lichtsterkte genomen van geselecteerde frames en berekent de _{F-1-F 0-waarden} (AF). Meestal kiest men een tijdstip verworven bij de holding potentieel en een ander tijdstip genomen tijdens de stimulatie periode.
   5. Duiden de pixels die moeten worden geanalyseerd door slepen of klikken elke pixel met de computermuis. Neem de grafische weergave van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de geselecteerde pixels aan de linkerzijde van het softwarevenster. Figuren 4B en 5B tonen representatieve beelden van het frame aftrekken analyse.
   6. Verdeel de afgetrokken pixels door de RLI (F _0). Klik [Divide door RLIs] om AF / F-waarden te verwerven
2. export data
   1. Bereken AF / F-waarden voor elke spanning stap om verder te analyseren de GEVI de spanning sensing eigenschappen. Gebruik deze waarden om grafieken zoals AF / F trekken versus spanning voor de volgende data-analyses.
   2. Verwijder stroom en spanning grafieken door los te klikken menu 'Toon BNCs'. Ga naar [OUTPUT] - [Save Traces Zoals getoond (ASCII)] om de fluorescentie spoor te exporteren in een ASCII-bestandsformaat voor curve fitting analyse door middel van standaard grafische software.

5. Data Analysis

1. Spanning sensing eigendom van de GEVI
   1. Teken de fluorescentie verandering versus spanning grafiek (FV) door het uitzetten van de AF / F-waarden ten opzichte van de spanning in een data-analyse programma. Breng de curve naar een Boltzmann functie (tabel 2) aan het spanningsbereik van het optische signaal te bepalen door te klikken op [Analyse] - [Fitting] - [sigmoïdale fit] - [Open dialoogvenster] en kies vervolgens Boltzmann functie.
      Opmerking: Montage om een ​​functie maakt het mogelijk te bedienene de spanningsdetectie eigenschappen van verschillende spanning probes te karakteriseren of om hun prestaties te vergelijken in verschillende cellen. De functie Boltzmann kan worden gebruikt voor de testen in dit document sondes omdat de FV krommen van deze probes vertonen sigmoïdale patroon.
   2. Normaliseren elk AF / F-waarde met behulp van de eerste en laatste waarden (A ₁ en A _2), berekend door de functie.
      Opmerking: In de Boltzmann vergelijking, het minimum is A ₁ en het maximum is A _2. Voor normalisatie, gebruik maken van een spreadsheet-applicatie software om de AF / F waarden aan te passen door het definiëren van _A 1 als nul en A ₂ als één. Het gemiddelde van de genormaliseerde AF / F-waarden en bereken standaardafwijking voor statistische analyse.
   3. Replot de genormaliseerde AF / F-waarden versus spanning zoals eerder beschreven in paragraaf 5.1.1).
2. De snelheid van de optische respons
   1. Open het ASCII-bestand overgenomen van stap 4.2.2) met een data-analyseprogramma en plot van de AF / F spoor tegen de tijd.
   2. Op 'Data selector in de data-analyse software en selecteer een tijdstip corresponderend met het begin van een getrapte spanningspuls en een tweede tijdstip waarop het lichtsignaal de stationaire toestand bereikt. Breng dit bereik om zowel een enkele en dubbele exponentieel verval functie door te klikken op [Analyse] - [Fitting] - [exponentiële fit] - [Open dialoogvenster], en kies een exponentiële verval functie. Rapporteer de betere pasvorm.
      Opmerking: Door het aanbrengen van de enkele of dubbele exponentieel verval functies, kan de gekwantificeerde tijdconstanten vertegenwoordigd door τ worden verworven. Dit zal helpen onderzoekers vergelijken de kinetiek van hun metingen gedaan met verschillende voltage indicatoren. De fluorescentie trace kan snelle en langzame componenten die kunnen worden beschreven met een dubbele exponentiële vervalfunctie tonen. In dit geval zal de berekening resulteren in twee tijdconstanten met verschillende amplitudes.
   3. Bereken the gewogen τ constanten om de kinetiek van probes vertonen twee tijdelijke componenten om probes met een enkele component te vergelijken.
      Opmerking: Een gewogen tau wordt berekend als de som van τ ₁ vermenigvuldigd met de relatieve amplitude A _1, plus τ ₂ vermenigvuldigd met de relatieve amplitude, A _2, zoals gedefinieerd door de volgende formule;

Results

Transient getransfecteerde cellen kunnen aanzienlijke verschillen in fluorescentie-intensiteit en de mate van plasmamembraan expressie vertonen. Zelfs op dezelfde dekglaasje sommige cellen variërende niveaus van interne fluorescentie hebben. Dit komt waarschijnlijk door de hoeveelheid transfectie agens opgenomen door de cel. Af te veel expressie veroorzaakt de cel ongevouwen eiwit die resulteert in apoptose ²⁷ ervaren (helder, ronde cellen met hoge inwendige fluorescentie). De...

Discussion

Het zenuwstelsel gebruikt spanning op verschillende manieren remming veroorzaakt een lichte hyperpolarisatie, synaptische ingang veroorzaakt een lichte depolarisatie en een actiepotentiaal leidt tot een relatief grote spanningsverandering. Het vermogen om veranderingen in membraanpotentiaal meten door GEVIs biedt het veelbelovend potentieel gelijktijdig analyseren van verschillende componenten van neuronale circuits. In dit rapport tonen we een fundamentele methode voor het afbeelden veranderingen in de membraanpotentia...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted Microscope	Olympus	IX71
60X objective lens (numerical aperture = 1.35)	Olympus	UPLSAPO 60XO
Excitation filter	Semrock	FF02-472/30	Voor spanningsbeeldvorming van super ecliptic pHluorin in Bongwoori
Dichroic mirror	Semrock	FF495-Di03-25x36
Emission filter	Semrock	FF01-497/LP
75W Xenon arc lamp	CAIRN	OptoSource Illuminator	LED's en lasers zijn ook effectieve lichtbronnen
Slow speed CCD camera	Hitachi	KP-D20BU
Dual port camera adaptor	Olympus	U-DPCAD
High speed CCD camera	RedShirtImaging, LLC	NeuroCCD-SM
Image splitter	CAIRN	Optosplit 2
Excitation filter	Semrock	FF01-475/23-25	Voor spanningsbeeldvorming van FRET paar gebaseerde GEVI bestaande uit Clover en mRuby2)
Dichroic mirror	Semrock	FF495-Di03-25x36
Emission filter	Chroma	ET520/40
Dichroic mirror	Semrock	FF560-FDi01-25X36
Emission filter	Chroma	ET645/75
Vibration isolation system	Kinetic systems	250BM-IC, 5702E-3036-31
Patching chamber	Warner instruments	RC-26G, 64-0235
#0 Micro Coverglass (22 x 40 mm)	Electron Microscopy Sciences	72198-20
Temperature controller	Warner instruments	TC-344B
#0 (0.08 ~ 0.13 mm) - 10 mm diameter glass coverslip	Ted Pella	260366
Lipofection agent	Life Technologies	11668-027
Calcium phosphate reagent	Clontech - Takara	631312
Patch clamp amplifier	HEKA	EPC 10 USB amplifier
Multi-channel data acquisition software	HEKA	Patchmaster
Image acquisition and analysis software	RedShirtImaging	Neuroplex
Spreadsheet application software	Microsoft	Microsoft Excel 2010
Data analysis software	OriginLab	OriginPro 8.6.0
Demagnifier	Qioptiq LINOS	Optem standaard camera koppeling 0.38x SC38 J-klem
Confocal microscope	Nikon	Nikon A1R confocal microscope
Anti-fade reagent	Life Technologies	P36930