Au-Interactie van SLP1 Polymeren en monolaag van<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, ICP-MS en de AFM als gereedschap voor Biomolecuul-metal Studies

Samenvatting

Om basisinformatie te verkrijgen over de sorption en het recyclen van goud uit waterige systemen, werd de interactie van Au(III) en Au(0) nanodeeltjes op S-laag-eiwitten onderzocht. De sorption van eiwitpolymeren werd onderzocht door ICP-MS en die van eiwitmonolagen door QCM-D. Daaropvolgend AFM maakt de beeldvorming van de nanostructuren mogelijk.

Samenvatting

In deze publicatie wordt het gedrag van goud-adsorptie van oppervlaktelaag (S-laag) eiwitten (Slp1) van Lysinibacillus sphaericus JG-B53 beschreven. Deze biomoleculen schikken zich in parakristallijne tweedimensionale arrays op oppervlakken, binden metalen en zijn daarom interessant voor verschillende biotechnische toepassingen, zoals biosorptieve materialen voor het verwijderen of terugwinnen van verschillende elementen uit het milieu en industriële processen. De afzetting van Au(0) nanodeeltjes op S-lagen, hetzij door S-laag gerichte synthese ¹ of adsorptie van nanodeeltjes, opent nieuwe mogelijkheden voor diverse sensorische toepassingen. Hoewel talloze studies de biosorptieve eigenschappen van S-lagen hebben beschreven ^2-5, blijft een dieper begrip van eiwit-eiwit en eiwit-metaal interactie nog steeds een uitdaging. In het volgende onderzoek werd inductief gekoppelde massaspectrometrie (ICP-MS) gebruikt voor de detectie van metaal adsorptie door opgeschorte S-lagen. Dit werd gecorreleerd met metingen van quartzkristal microbalans met dissipatie monitoring (QCM-D), die de online detectie van eiwitmonolayer vorming en metaalafzetting mogelijk maakt, en dus een meer gedetailleerd begrip van metaalbinding.

De ICP-MS resultaten gaven aan dat de binding van Au(III) aan de opgeschorte S-laag polymeren pH afhankelijk is. De maximale binding van Au(III) werd verkregen bij een pH van 4,0. De QCM-D onderzoeken maakten de detectie van Au(III) adsorptie evenals de afzetting van Au(0)-NP's in real-time mogelijk tijdens de in situ experimenten. Verder maakte deze methode het mogelijk om de invloed van metaalbinding op de eiwit latwerk stabiliteit van Slp1 te bestuderen. Structurele eigenschappen en eiwitlaag stabiliteit konden direct na QCM-D experiment worden gevisualiseerd met behulp van atoomkrachtmicroscopie (AFM). Kortom, de combinatie van deze verschillende methoden biedt een dieper begrip van metaalbinding door bacteriële S-laag eiwitten in suspensie of als monolayers op bacteriële cellen of herkristalliseerde oppervlakken.

Inleiding

Als gevolg van het toenemende gebruik van goud voor verschillende toepassingen, zoals elektronica, katalysatoren, biosensoren, of medische instrumenten, de vraag van dit edelmetaal is gegroeid in de afgelopen paar jaar tijd ^6-9. Goud evenals vele andere edelstenen en zware metalen in het milieu via industrieel afvalwater in verdunde concentraties, door middel van mijnbouw, en afvalverwerking ^7,8,10, hoewel de meeste milieuvervuiling door zware of edele metalen is een continu proces vooral veroorzaakt door de technologische activiteiten. Dit leidt tot een aanzienlijke verstoring van de natuurlijke ecosystemen en zou kunnen bedreigen de volksgezondheid ^9. Weten deze negatieve uitkomsten bevordert het zoeken naar nieuwe technieken om metalen uit vervuilde ecosystemen en verbeteringen te verwijderen in de recycling van metalen uit industrieel afvalwater. Gevestigde fysisch-chemische methoden zoals neerslaan of ionenwisseling zijn niet zo effectief, vooral in de hogely verdunde oplossingen ^7,8,11. Biosorptie, hetzij met levende of dode biomassa, is een aantrekkelijk alternatief voor de behandeling van afvalwater ^10,12. Het gebruik van dergelijke biologische materialen kan het gebruik van giftige chemicaliën verminderen. Veel micro-organismen zijn beschreven ophopen of immobiliseren metalen. Bijvoorbeeld, cellen Lysinibacillus sphaericus (L. sphaericus) JG-A12 toonden hoge bindingscapaciteiten van edele metalen, bijvoorbeeld Pd (II), Pt (II), Au (III) en andere toxische metalen zoals Pb (II) of U (VI) ^4,13, cellen van Bacillus megaterium van Cr (VI) ^14, cellen van Saccharomyces cerevisiae van Pt (II) en Pd (II) ¹⁵ en Chlorella ordinaire voor Au (III) en U (VI) ^{16 , 17.} De binding van de voorgaande metalen zoals Au (III), Pd (II) en Pt (II) is eveneens gerapporteerd Desulfovibrio desulfuricans ¹⁸ en L. sphaericus JG-B53 ^19,20. Toch niet all microben binden grote hoeveelheden metalen en hun toepassing als sorptieve materiaal is beperkt ^12,21. Bovendien metaal bindingscapaciteit is afhankelijk van verschillende parameters, bijvoorbeeld celsamenstelling, de gebruikte bio-component, of milieu- en experimentele condities (pH, ionsterkte, temperatuur etc.). De studie van geïsoleerde celwandfragmenten ^22,23, zoals membraanlipiden, peptidoglycaan, eiwitten of andere bestanddelen, helpt metaalbindingseigenschappen processen complex geconstrueerde gehele cellen ^8,21 begrijpen.

De celcomponenten gericht in deze studie zijn S-layer eiwitten. S-layer eiwitten delen van de buitenste celwand van vele bacteriën en archaea, en zij vormen ongeveer 15 - 20% van de totale proteïnemassa van deze organismen. Als eerste interface naar de omgeving, deze mobiele verbindingen sterk beïnvloeden de bacteriële sorptie-eigenschappen ^3. S-layer eiwitten met molecuulgewichten variërend van veertigtot honderden kDa wordt geproduceerd in de cel, maar buiten gemonteerd waar ze kunnen lagen op lipidemembranen of polymere celwand componenten vormen. Eenmaal geïsoleerd, bijna alle S-laag eiwitten hebben de intrinsieke eigenschap om spontaan zichzelf assembleren in suspensie, aan interfaces, of op oppervlakken vormen vlakke of buis-achtige structuren ^3. De dikte van het eiwit monolaag afhankelijk van de bacteriën en ligt binnen een bereik van 5 - 25 nm ^24. In het algemeen kan de gevormde S-layer eiwitstructuren een schuine (p1 en p2), vierkant (p4) of zeshoekig (p3 of p6) symmetrie roosterconstanten 2,5 tot 35 nm ^3,24 hebben. Het rooster formatie lijkt in veel gevallen afhankelijk van tweewaardige kationen en voornamelijk Ca ^{2 + 25,26, Raff, J. et al. S-laag op basis van nanocomposieten voor industriële toepassingen op basis van eiwitten Engineered nanostructuren. (eds Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2}016 (ingediend)). Toch is de volledige reactie cascade monomeer vouwen, monomeer-monomeer interactie de vorming van een rooster, en de rol van verschillende metalen, vooral van divalente kationen zoals ^Ca2 + en ^Mg2 +, zijn nog niet volledig begrepen.

De gram-positieve stam L. sphaericus JG-B53 (hernoemd van Bacillus sphaericus na nieuwe fylogenetische ^{classificatie)} 27 werd geïsoleerd uit de uraniumwinning afval stapel "Haberland" (Johanngeorgenstadt, Saksen, Duitsland) ^4,28,29. De functionele S-layer-eiwit (SLP1) bezit een vierkant rooster, een molecuulgewicht van 116 kDa ³⁰ en een dikte van ≈ 10 nm op levende bacteriecellen ^31. In eerdere onderzoeken werd de in vitro vorming van een gesloten en stabiel eiwit met een dikte van ongeveer 10 nm in minder dan 10 min ¹⁹ bereikt. De gerelateerde stam L. sphaericus JG-A12, ook een isolaat uit de "Haberland" pile, bezit hoge metaal binding capaciteiten, geïsoleerde S-layer-eiwit blijkt een hoge chemische en mechanische stabiliteit en goede sorptie bekijken van edelmetalen zoals Au (III), Pt (II), en Pd (II) ^4,32,33. Deze binding van edelmetalen meer of minder specifiek voor bepaalde metalen en afhankelijk van de beschikbare functionele groepen op de buitenste en binnenste eiwit oppervlak van het polymeer en in zijn poriën, ionsterkte en pH. Relevante functionele groepen voor metalen interactie door de eiwitten COOH, NH ₂ -, OH, PO ₄ -, SO ₄ - en SO. In principe, metaal bindende capaciteiten opent een breed spectrum van toepassingen, ^{Raff, J. et al. S-laag op basis van nanocomposieten voor industriële toepassingen op basis van eiwitten Engineered nanostructuren. (eds Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (ingediend)).} bv als biosorptive componenten voor de verwijdering of het herstelopgeloste toxische of waardevolle metalen, sjablonen voor synthese of gedefinieerd afzetting van regelmatig gestructureerde metalen nanodeeltjes (NP) voor katalyse en andere bio-engineered materialen zoals bio-zintuiglijke lagen ^3,5,18,33. Regelmatig gerangschikte NP arrays zoals Au (0) -NPs zouden kunnen worden voor belangrijke toepassingen gaande van moleculaire elektronica en biosensoren, ultrahoge opslagdichtheid apparaten en katalysatoren voor CO-oxidatie ^34-37. De ontwikkeling van dergelijke toepassingen en slimme ontwerp van deze materialen vereist een dieper begrip van het onderliggende metaal bindende mechanismen.

Een voorwaarde voor de ontwikkeling van dergelijke materialen op biologische basis is de betrouwbare uitvoering van een tussenlaag tussen het biomolecuul en de technische oppervlak ^38,39. Bijvoorbeeld, polyelektrolyten samengevoegd met de laag-voor-laag (LbL) techniek ^40,41 zijn gebruikt als interface laag voor herkristallisatie van S-layer eiwitten ³⁹ . Dergelijke interface biedt een relatief eenvoudige manier de proteïne bekleding te voeren op een reproduceerbare en kwantitatieve wijze. Door uitvoeren van verschillende experimenten met en zonder modificatie met lijm promoters, is het mogelijk om uitspraken betreffende deklaag kinetiek, layer stabiliteit en interacties van metalen met biomoleculen ^{19,42, Raff, J. et al maken. S-laag op basis van nanocomposieten voor industriële toepassingen op basis van eiwitten Engineered nanostructuren. (eds Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (ingediend)).} Echter, het complex mechanisme van eiwitadsorptie en interactie eiwit-oppervlak niet volledig begrepen. Vooral informatie over de conformatie, patroon oriëntatie en coating dichtheden wordt nog steeds vermist.

Kwartskristalmicrobalans met dissipatie bewaking (QCM-D) techniek heeft de aandacht getrokken in de afgelopen jaren als een instrument voor het bestuderen eiwitadsorptie, coating kinetiek en interactie proprocessen op de nanometerschaal ^19,43-45. Deze techniek maakt het mogelijk om gedetailleerde detectie van massa adsorptie in real-time, en kan worden gebruikt als indicator voor het eiwit zelfassemblerende proces op proteïne roosters ^{19,20,42,46-48} koppeling van functionele moleculen. Daarnaast QCM-D metingen opent de mogelijkheid om metalen interactie processen te bestuderen met de proteïneachtige laag onder natuurlijke biologische omstandigheden. In een recente studie, de interactie van de S-layer-eiwit met bepaalde metalen zoals Eu (III), Au (III), Pd (II) en Pt (II) is onderzocht met QCM-D ^19,20. Het geadsorbeerde eiwit laag kan dienen als een vereenvoudigd model van een celwand van Gram-positieve bacteriën. Het onderzoek van deze ene component kan bijdragen tot een beter begrip van metaal interactie. Echter, alleen QCM-D experimenten geen uitspraken over oppervlaktestructuren en invloeden van metalen eiwit mogelijk te maken. Andere technieken zijn nodig om dergelijke informatie te verkrijgen. Een poswoordelijkheid voor bio-imaging nanostructuren en verkrijgen van informatie over structurele eigenschappen is de atomaire kracht microscopie (AFM).

De doelstelling van dit onderzoek was om de sorptie van goud (Au (III) en Au (0) -NPs) S-layer eiwitten te onderzoeken, met name SLP1 van L. sphaericus JG-B53. Experimenten werden uitgevoerd met charge gesuspendeerd eiwitten op schaal in een pH traject van 2,0 - 5,0 behulp van ICP-MS en geïmmobiliseerd S-lagen gebruikt QCM-D. Bovendien is de invloed van metaalzoutoplossing aan het rooster stabiliteit onderzocht latere AFM studies. De combinatie van deze technieken draagt ​​bij aan een beter begrip van de in vitro metaal interactie processen als een instrument voor het leren meer over bindende gebeurtenissen op de hele bacteriecellen over specifieke metalen affiniteiten. Deze kennis is niet alleen cruciaal voor de ontwikkeling van de toepasselijke filter materialen voor de recycling van metalen voor de bescherming van het milieu en het behoud van de rebronnen ^49, maar ook voor de ontwikkeling van arrays van sterk geordende metalen NP voor diverse technische toepassingen.

Protocol

1. micro-organismen en teeltomstandigheden

Opmerking:. Alle experimenten werden uitgevoerd onder steriele omstandigheden L. sphaericus JG-B53 werd verkregen uit een cryo-bewaard cultuur ^29,30.

1. Transfer cryo-bewaarde cultuur (1,5 ml) onder de schone bank tot 300 ml steriele voedingsoplossing bouillon (NB) media (3 g / l vleesextract, 5 g / l pepton, 10 g / l NaCl). De oplossing gedurende ten minste 6 uur bij 30 ° C daarna roeren om de voorkweek te verkrijgen voor de teelt.
2. Cultiveren van de bacteriën onder aerobe omstandigheden in NB medium met pH = 7,0, 30 ° C in een 70 L geschaald steam-in-place bioreactor. Daarom vult de reactor met ≈ 57 L gedemineraliseerd water. Toe te voegen en te ontbinden solide NB media rechtstreeks in bioreactor (concentraties zie hierboven).
   1. Daarnaast voegen antischuimmiddel (30 pl / l NB-media) aan de media om schuimvorming tijdens de teelt te onderdrukken, dan autoclaaf (122 ° C, de temperatuur met 30 min), de mediain de reactor faciliteit.
3. Afkoelen van de media en het uitvoeren van volledige zuurstofverzadiging. Stel de pH op 7,0 (met 1 MH ₂ SO ₄ en 2 M NaOH) en start de automatische inoculatie van 300 ml voorkweek. Start de gegevensregistratie van de teelt parameters bij de inenting punt. Log online parameters bv opgeloste zuurstof (DO _2), zuur en base Bovendien, en pH-waarden binnen de teelt.
   1. Controleer de bacteriegroei online door de niet-invasieve troebelheidsmetingen.
4. Voeren extra bemonstering na elk uur van de teelt en het bepalen van verdere parameters zoals bio droog gewicht (BDW) en offline optische dichtheid (OD). Daarom verzamelen 20 ml kweek bouillon bij elk bemonsteringspunt onder steriele omstandigheden.
   1. Bepaal offline OD door fotometrische metingen van de adsorptie bij 600 nm. Gebruik steriel gefiltreerd NB-medium als een lege waarde. AftER bereiken adsorptie> 0,4 ​​verdunde celsuspensie na de lineariteit van Lambert-Beer wet.
   2. Voor bepaling van BDW centrifuge 1-5 ml bacteriesuspensie (afhankelijk van de celdichtheid) bij 5000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Droog de verkregen celpellet bij 105 ° C in een verwarmingsoven tot massaproductie stabiliteit en meet de pellet massa.
5. Neem microscopische beelden met optische fase contrast onderzoek microscoop in 400 en 1000-voudige vergroting (respectievelijk fase contrast condensor 2 en 3) voor het controleren van de groei van bacteriën en als kruisbesmetting controle.
6. Na het bereiken van de exponentiële groeifase gedetecteerd door online dO ₂ en online troebelheid, oogsten de biomassa doorstroom centrifugatie bij 15.000 xg, 4 ° C en was de biomassa tweemaal met standaard buffer (50 mM TRIS, 10 mM _MgCl2, 3 mM _NaN3, pH = 7,5).
   NB: De verkregen biomassa pellet kan bij -18 & # worden opgeslagen176; C tot verder gebruik voor isolatie.

2. S-layer Protein Isolatie en zuivering

Opmerking: Zuiver SLP1 polymeren volgens een aangepaste werkwijze zoals hiervoor beschreven ^{2,19,30,32,50,51.}

1. Homogeniseer de gewassen en ontdooide ruwe biomassa verkregen uit kweek in standaard buffer (1: 1 (w / v)) naar flagella verwijderen met behulp van een verspreider (niveau 3, 10 min) onder ijsbadkoeling bij 4 ° C.
2. Centrifugeer de suspensie (8000 xg, 4 ° C gedurende 20 min) en was de verkregen pellet tweemaal met standaard buffer (1: 1 (w / v)). Na wassen en centrifugeren (8000 x g, 4 ° C gedurende 20 min), resuspendeer de pellet in standaard buffer (1: 1 (w / v)), voeg DNase II en RNase (0,4 eenheden / g biomassa) aan de suspensie en desintegreren de cellen bij 1000 bar met een hogedruk-homogenisator. Daarna Centrifugeer de suspensie bij 27.500 xg, 4 ° C gedurende 1 uur.
   Opmerking: Controle celsuspensie met het onderzoek microscope. Breuk wordt voltooid wanneer minder dan 2 - 3 intacte cellen zijn zichtbaar in het gebied van de microscoop in 400-voudige vergroting weergeven.
3. Was de pellet twee keer met standaard buffer (1: 1 (w / v)) en opnieuw uit het centrifugeren. Daarna resuspendeer de pellet in standaardbuffer (2: 1 (w / v)) gemengd met 1% Triton X-100 en incubeer gedurende 20 minuten onder achtereenvolgende schudden (100 rpm) tot lipideafzettingen oplosbaar.
4. Centrifugeer de oplossing (27500 xg, 4 ° C gedurende 1 uur) en was de verkregen pellet driemaal met standaard buffer (1: 1 (w / v)).
5. Incubeer de pellet verkregen na additionele centrifugatie (27.500 x g, 4 ° C gedurende 1 uur) voor 6 uur in standaard buffer (1: 1 (w / v)) gemengd met 0,2 g / L lysozyme, om bindingen in peptidoglycaan ⁵⁰ hydrolyseren. Bovendien voeg DNase II en RNase (elk 0,4 eenheden / g biomassa) aan de suspensie.
6. Na centrifugatie (45.500 x g, 4 ° C, 1 uur), resuspendeer de bovenste eiwitproteïne fase met een geringe hoeveelheid tHij centrifugeren supernatant (<30 ml) dat eiwitsubeenheden.
7. Oplosbaar witte suspensie door het mengen van 1: 1 met 6 M guanidine hydrochloride (6 M GuHCl, 50 mM TRIS, pH = 7,2). De oplossing wordt helder.
8. Voer steriele filtratie (0,2 urn) van de GuHCI behandelde oplossing gevolgd door een extra snelle centrifugatie (45.500 x g, 4 ° C gedurende 1 uur).
9. Breng de supernatant dialysemembraan buizen (MWCO 50.000 Dalton) en gedialyseerd tegen herkristalliseren buffer (1,5 mM TRIS, 10 mM _CaCl2, pH = 8,0) gedurende 48 uur.
10. Breng de witte gerekristalliseerde eiwit polymeeroplossing in buizen en centrifugeer bij 45.500 xg, 4 ° C gedurende 1 uur. Resuspendeer de pellet in een lage hoeveelheid ultrazuiver water (<30 ml).
11. Daarna breng de suspensie in dialysemembraan buizen en uitvoeren van een dialyse tegen ultrapuur water gedurende 24 uur tot buffer inhoud te verwijderen.
    Opmerking: Een aantal wijzigingen van buffer of ultrapuur water dijdens dialyse zijn onmisbaar.
12. Lyofiliseren de gezuiverde SLP1 in een vriesdroger.

3. Karakterisering en kwantificering van SLP1 Experimenten

Opmerking: SLP1 concentratie voor sorptie en coating experimenten werden gekwantificeerd door UV-VIS spectrofotometrie.

1. Pipet 2 pl opgelost SLP1 monster direct op de onderste meting voetstuk van de fotometer. Bepaal eiwit concentratie adsorptie maximum bij een golflengte van 280 nm, karakteristiek voor eiwitten. Gebruik de extinctiecoëfficiënt van 0,61 tot SLP1 concentratie te bepalen. Gebruik SLP1 vrije oplossing voor referentie metingen.
2. Verdun het eiwit met de buffer (voor sorptie experimenten in batch modus 0,9% NaCl, pH = 6,0 en voor QCM-D experimenten gebruikt herkristallisatie buffer, pH = 8,0) om de gewenste concentratie experimenten (1 g / l en 0,2 g / l respectievelijk).
3. Analyseer SLP1 kwaliteit en het molecuulgewicht van de standaard bioanalytical werkwijze natriumdodecylsulfaat polyacrylamide elektroforese (SDS-PAGE) beschreven door Laemmli, UK ^52.
   1. Het uitvoeren van SDS-PAGE voor het gebruik SLP1 binnen experimenten en bijvoorbeeld na Au (0) -NP incubatie met 10% polyacrylamide scheiding gels.
   2. Voor SDS-monsters mix ≈10 ul van de teelt of eiwit monster met monsterbuffer (1,97 g TRIS, 5 mg broomfenolblauw, 5,8 ml glycerine, 1 g SDS, 2,5 ml β-mercaptoethanol, vullen met ultrapuur water tot 50 ml) in een verhouding van 1: 1 (v / v) en pipet het mengsel na 4 min incubatie bij 95 ° C in de gel zakken.
   3. Run SDS-PAGE 30 min bij een spanning van 60 V tot de monsters voorbij het verzamelen gel en verandering voltage 120 V bij het passeren van de scheiding gel.
   4. Verwijder de gels uit het gelsysteem, spoelen met ultrapuur water en voor 1 uur in fixatie-oplossing (10% zuur acid, 50% absolute ethanol). Daarna, spoel de gels met ultrapuur water.
   5. Vlek gelsmet behulp van een aangepaste niet-specifieke colloïdale Coomassie brilliant blue methode ^53,54. Na ontkleuren ^72,73, neem SDS-PAGE beelden door de gel documentatiesysteem volgens het protocol van de fabrikant.

4. Sorptie experimenten in batch-modus en Metal kwantificering

1. Voor batch sorptie experimenten bereiden Au (III) voorraadoplossing van HAuCl ₄ ∙ 3 H ₂ O verdunnen metaalzout en meng deze met de SLP1 / NaCl-oplossing een eerste metalen concentratie van 1 mM en uiteindelijke SLP1 concentratie van 1 g / l . Voeren experimenten in drieling met een extra negatieve controle zonder SLP1. Gebruik een totaal volume van 5 ml voor sorptie experimenten.
2. Schud de suspensie continu bij RT op verschillende vooraf ingestelde pH-waarden tussen 2,0-5,0 voor 24 uur (pas pH met een laag geconcentreerd HCl en NaOH-oplossing).
3. Na sorptie Centrifugeer de monsters bij 15.000 xg, 4 ° C gedurende 20 min) om SEPARat SLP1 van supernatant.
4. Breng de bovenstaande in ultrafiltratie buizen (MWCO 50.000 Da) en gecentrifugeerd bij 15.000 xg dit, 4 ° C gedurende 20 min opgeloste eiwit monomeren te verwijderen.
5. Bepaal de concentratie van metalen in de resulterende filtraat door ICP-MS ^19,20 en de resultaten gebruiken voor back-berekening van gesorbeerde metalen door de SLP1 droge massa. Meten principes, werden de mogelijkheden van de methode en de onderdelen van de gebruikte ICP-MS beschreven in de literatuur ^55.
   1. Bereid monsters en referenties voor ICP-MS metingen met 1% HNO ₃ als matrix en rhodium als een interne standaard (1 mg / ml).

5. Synthese van Au-NP en Bepaling van de deeltjesgrootte

Opmerking: Citraat gestabiliseerde Au (0) -NP werden gesynthetiseerd volgens een aangepaste werkwijze eerder beschreven door Mühlpfordt, H. et al. (1982) om bolvormige deeltjes te verkrijgen met een diameter van 10 - 15 nm ^56,57 .

1. Bereid een gestabiliseerde 25 mM HAuCl ₄ ∙ 3 H _{2 O} voorraad voor de NP formatie.
2. Verdunnen 250 ul van deze voorraad oplossing in 19,75 ml ultrapuur water en incubeer deze gedurende 15 min onder opeenvolgende schudden bij 61 ° C.
3. Bereid 5 ml van een tweede voorraadoplossing (12 mM looizuur, 7 mM natriumcitraat di-hydraat, 0,05 mM K ₂ CO ₃₎ en incubeer de ^2e oplossing afzonderlijk bij 61 ° C gedurende 15 min.
4. Voeg onder voortdurend roeren ^de 2 de voorraad oplossing voor een oplossing. Roer het reactiemengsel gedurende ten minste 10 minuten bij 61 ° C. Daarna afkoelen van de oplossing en het gebruiken voor NP coating op SLP1 rooster binnen QCM-D experimenten.
   Opmerking: De verkregen Au (0) -NP werden gekarakteriseerd met UV-VIS spectroscopie van het absorptiemaximum van 520 nm, gewoonlijk gebruikt voor de detectie van gevormde Au (0) -NPs ^58. De oplossing kan worden bewaard bij 4 ° C.
5. Analyseer de grootte van de gevormdeAu (0) -NP door fotoncorrelatiespectroscopie (PCS), dat ook bekend staat als dynamische lichtverstrooiing.
   1. Voor de bepaling van NP grootte, overdracht 1,5 ml gesynthetiseerde Au (0) -NP oplossing in cuvettes onder stofvrije omstandigheden in een laminaire stroming doos en analyseren met een grootte en zetapotentiaal particle sizer. Een gedetailleerde beschrijving van PCS en monstervoorbereiding gegeven in Schurtenberger, P. et al. (1993) ⁵⁹ en Jain, R. et al. (2015) ^60.

6. QCM-D Experimenten - SLP1 Coating op oppervlakken en Au-NP Adsorptie op SLP1 Lattice

Opmerking: De metingen werden uitgevoerd met een QCM-D uitgerust met maximaal vier modules stroom. All QCM-D-experimenten werden uitgevoerd met een constante stroomsnelheid van 125 pl / min bij 25 ° C. SLP1 coating en metalen / NP incubatie werden uitgevoerd op SiO ₂ piëzo-elektrische AT-cut kwarts sensoren (Ø 14 mm) met een fundamentele frequentie van ≈ 5 MHz. Spoelstappen en voegvulle oplossing zijn gemarkeerd in de cijfers van de resultaten representatief deel. De QCM-D experimenten kan worden omschreven als een stapsgewijze wijze beginnend met het schoonmaken en oppervlaktemodificatie van de gebruikte sensors gevolgd door herkristallisatie SLP1 en daarna het metaal en metaal NP interactie.

1. Reinigen Procedure:
   1. Voorzie de vloeistof cellen met sensor dummies. Pomp minstens 20 ml (elk per module) van alkalisch reinigingsmiddel (2% reinigingsmiddel in ultrazuiver water (v / v)) door de QCM-D en buissysteem. Daarna pomp de vijfvoudig volume (elk per module) ultrazuiver water door het systeem (debiet tot 300 ul / min). Voer de reiniging volgens het protocol van de fabrikant.
   2. Reinig de SiO ₂ sensoren buiten de stroom modules door incubatie (minstens 20 min) in 2% SDS-oplossing en spoel de sensoren daarna meerdere malen met ultrapuur water ^61,62.
   3. Droog de kristallen met gefilterd compingressed lucht en plaats ze in een ozon reinigingskamer 20 min ^63,64.
   4. Herhaal de reinigingsprocedure tweemaal om alle organische inhoud te verwijderen.
   5. Om gebonden metalen uit het sensor oppervlak te verwijderen spoel de sensoren met 1 M HNO _3. Daarna voer alle spoelstappen met ultrapuur water.
2. Sensor Surface Wijziging door Polyelektrolyten:
   Opmerking: Oppervlakte modificatie kan worden gedaan binnen (doorstromen procedure) of buiten de stroom module (LbL techniek). Binnen deze experimenten als volgt aan de oppervlakken te wijzigen gebruikt.
   1. Wijzig de sensoren met 3 g / l PE afwisselende lagen van polyethyleenimine (PEI, MW 25.000) en polystyreensulfonaat (PSS, MG 70.000) via dip coating Lbl techniek ^40,41 eerder beschreven voor het speciale gebruikte systeem in het artikel van Suhr, M. et al. (2014) ^19.
   2. Plaats de sensoren in de juiste PE-oplossing in diepe well platen en incubeer deze gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
   3. Neem de sensoren van PE-oplossing en spoel de sensoren tussen elke dip coating stap intensief met ultrapuur water.
      Opmerking: De nieuwe oppervlaktemodificatie uit ten minste drie lagen PE eindigend met positief geladen PEI.
   4. Na deze externe wijziging plaats van de sensoren in de stroom module en evenwicht de sensoren door spoelen met ultrapuur water voor aanvang van de experimenten.
3. SLP1 Monolayer Herkristallisatie:
   1. Los SLP1 in 4 M ureum voor het omzetten van polymeren in monomeren.
   2. Centrifugeer de monomerized eiwitten bij 15.000 xg, 4 ° C gedurende 1 uur tot grotere agglomeraten eiwit te verwijderen.
   3. Meng het oplosbaar en gecentrifugeerd SLP1 supernatant met herkristallisatie buffer tot een uiteindelijke eiwitconcentratie van 0,2 g / l.
      Opmerking: De calcium afhankelijk herkristallisatie van SLP1 (zelf-assemblage) begint door de toevoeging van de recrystallization buffer. Derhalve pomp de gemengde oplossing met een debiet van 125 ul / min naar de sensors (geplaatst in de stroom modules) onmiddellijk. De herkristallisatie wordt uitgevoerd na stabiele waarden van frequentie en dissipatie verschuivingen binnen QCM-D experimenten werden gedetecteerd.
   4. Na succesvolle eiwit herkristallisatie bovenop de PE-gemodificeerde sensors in de stroom modules spoel de beklede sensoren met herkristallisatie buffer of ultrazuiver waterintensively met een debiet van 125 ul / min tot stabiele waarden van frequentie en afbraak verschuivingen werden gedetecteerd.
      Opmerking: De SiO ₂ oppervlaktemodificatie met PE later sorptie experimenten op SLP1 monolaag en AFM studies wordt gevisualiseerd in figuur 1.

Figuur 1. Schematische Ontwerp van PE Surface Wijziging en SLP1 MonolayerCoating; Dit cijfer is aangepast van Suhr, M. et al. (2015) ¹⁹ met toestemming van Springer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Metaal en metaal NP Interactie:
   Opmerking: De sorptie met Au metaalzoutoplossing (HAuCl ₄ ∙ 3 H ₂ O) werd in een concentratie van 1 mM of 5 mM bij pH = 6,0 in 0,9% NaCl oplossingen uitgevoerd. Au-NP adsorptie werd met onverdund au-NPs in 1,6 mM tri-natrium-citraatbuffer bij pH ≈ 5,0.
   1. Na succesvolle SLP1 coating in de stroom modules, spoel de verkregen SLP1 lagen intensief met 0,9% NaCl-oplossing totdat stabiele waarden van frequentie en afbraak verschuivingen werden gedetecteerd.
   2. Pomp de bereide metaaloplossing (1 mM) en NP oplossing om de stroom modules met een stroomsnelheid van 125 pl / min en volgen de massa adsorptie aan het Slp1 laag. Mass adsorptie kan direct worden gedetecteerd door het volgen van de frequentieverschuivingen verwijzing naar de Sauerbrey vergelijking (Vergelijking 1).
   3. Na het voltooien van de interactie metalen en NP, spoel de laag met metaal / NP vrije buffer zwak gebonden of zwak verbonden metalen of nanodeeltjes te verwijderen.
      Opmerking: Een weergave van de experimentele opstelling wordt getoond in figuur 2.

Figuur 2. Schematische Ontwerp van QCM-D Setup met behulp van Flow Module QFM 401 * ^66. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Gegevensregistratie en Evaluatie:
   1. Noteer de verschuivingen in de frequentie in Hz (Af _n) en dissipatie (AD _n) Binnen de QCM-D experimenten met QCM-D specifieke software.
   2. Gebruik voor de evaluatie van de geadsorbeerde massagevoeligheid (Δm) de Sauerbrey vergelijking / model (Vergelijking 1) ^{65 66} die geldig is voor dunne en harde films gekoppeld wrijvingsloos op het sensoroppervlak aangebracht op ^de n boventoon. De term C (Sauerbrey constant) voor het gebruik van 5 MHz AT cut kwarts sensor is 17,7 ng ∙ Hz ^-1 ∙ cm ^{-2 68.} Voor stijve, gelijkmatig verdeeld en voldoende dun geadsorbeerd lagen gebruiken vergelijking 1 als een goede benadering.
      
   3. Voer aanvullende modellering volgens de Kelvin-Voigt model geldig viscoelastische molecules ^68-71 met fabrikantspecifieke software en de resultaten te vergelijken met die van de Sauerbrey model.
   4. Voor de berekening van de laagdikte en het massale gebruik adsorptiebelangrijk modeling parameter een laag dichtheid van de geadsorbeerde laag van 1,35 g ∙ cm ^-3 corresponderen met waarden eerder beschreven voor S-layer eiwitten ^72-75. Gebruik hetzelfde geldt voor de berekening van metaal interactie met de proteïneachtige laag.

7. AFM Metingen

1. Voeren studies met volledig in staat AFM op een omgekeerde optische microscoop.
   1. Record AFM beelden in vloeistof met behulp van de herkristallisatie buffer of ultrapuur water direct op de gecoate QCM-D-sensoren.
   2. Spoel de sensoren met ultrapuur water na QCM-D experimenten en plaats ze in de AFM vloeistof cel. Daarom is een gesloten fluïdumcel met een totaal volume van ongeveer 1,5 ml. Houd de temperatuur van het fluïdum celconstante bij 30 ° C.
   3. Gebruik een cantilever met een resonantiefrequentie van 25 kHz ≈ in water en een stijfheid van <0,1 N / m. Pas de scansnelheid tussen 2,5 en 10 um / sec.
   4. Neem beelden in dynamische contact modus terwijl de cantilever wordt opgewekt door een piëzo bij zijn resonantiefrequentie. Bepaal de afstand van de cantilever naar het oppervlak van het oscillatie dempende ^76.
      Opmerking: Hoogte afbeeldingen worden weergegeven met z-schaal terwijl z-waarden de exacte topografie van het oppervlak. Amplitude (Pseudo 3D) beelden worden getoond zonder z-schaal omdat amplitude z-waarden zijn afhankelijk van het scannen van de parameters en dragen beperkte informatie. Analyse van de beelden werd gedaan met behulp van drie verschillende evaluatie software ^77.

Resultaten

Teelt van micro-organismen en SLP1 karakterisering

De opgenomen gegevens van bacteriegroei geeft het einde van de exponentiële groeifase bij ongeveer 5 uur. Eerdere onderzoeken hebben aangetoond dat SLP1 kunnen worden geïsoleerd uit het ogenblik van de oogst (4,36 g / L natte biomassa (≈ 1,45 g / L (BDW)) met een maximale opbrengst ^19. Niettemin optimalisatie van de teelt met gedefinieerde media com...

Discussie

In dit werk onderzochte de binding van Au S-laag-eiwitten werd onderzocht met behulp van een combinatie van verschillende analysemethoden. Vooral de binding van Au is zeer aantrekkelijk, niet alleen voor de terugwinning van Au uit de mijnbouw water of procesoplossingen, maar ook voor de constructie van materialen, bijvoorbeeld sensorische oppervlakken. Voor studies van de interactie Au (Au (III) en Au (0) -NPs) met onderbroken en herkristalliseerd monolaag van SLP1 het eiwit moesten worden geïsoleerd. Daarom he...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Equipement en software
Bioreactor, Steam In Place 70L Pilot System	Applikon Biotechnology, Netherlands	Z6X	Inclusief dO2, pH sensoren van Applikon Biotechnology en BioXpert software V2
Noninvasief biomassa monitor BugEye 2100	BugLab, Concord (CA), USA	Z9X	---
Spectrometer Ultrospec 1000	Amersham Pharmacia Biotech, Groot-Brittannië	80-2109-10	Bedrijf nu GE Healthcare Life Sciences
MiniStar microcentrifuge	VWR, Duitsland	521-2844	Voor centrifugatie van kweekmonsters
Onderzoekssysteem microscoop BX-61	Olympus Germany LLC, Duitsland	037006	Microscoop in combinatie met beeldvormingssoftware
Cell^P (versie 3.1)	Olympus Soft Imaging Solutions LLC, Münster, Duitsland	---	samen met microscoop
Powerfuge Pilot Separatie System Serie 9010-S	Carr Centritech, Florida, USA	9010PLT	Voor biomassaoogst
T18 basic Ultra Turrax	IKA Labortechnik, Duitsland	431-2601	Voor flagella verwijdering en monsterhomogenisatie
Sorvall Evolution RC Superspeed Centrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA	728411	Gebruikt binnen eiwitisolatie
Mobiele hoge scheur vloeistofprocessor, M-110EH-30 Pilot	Microfluidics, Massachusetts, USA	M110EH30K	Gebruikt voor celruptuur
Alpha 1-4 LSC Freeze dryer	Martin Christ Freeze dryers LLC, Osterode, Duitsland	102041	---
UV-VIS spectrofotometrie (NanoDrop 2000c)	Thermo Fisher Scientific, USA	91-ND-2000C-L	Voor bepaling van eiwitconcentratie
Mini-PROTEAN verticale elektroforese kamer	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Duitsland	165-3322	Voor SDS-PAGE
VersaDoc Beeldvormingssysteem 3000	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Duitsland	1708030	Gebruikt voor beeldvorming van SDS-PAGE gels
ICP-MS Elan 9000	PerkinElmer, Waltham (MA), USA	N8120536	Voor bepaling van metaalconcentratie
Zetasizer Nano ZS	Malvern Instruments, Worcestershire Verenigd Koninkrijk	ZEN3600	Voor bepaling van nanodeeltje grootte
Q-Sense E4 apparaat	Q-Sense AB, Göteborg, Zweden	QS-E4	besteld via LOT quantum design (software inbegrepen bij E4 platform)
Q-Soft 401 (data opname)	Q-Sense AB, Göteborg, Zweden
Q-Tools 3 (data evaluatie en modellering)	Q-Sense AB, Göteborg, Zweden
QCM-D flow modules QFM 401	Q-Sense AB, Göteborg, Zweden	QS-QFM401	besteld via LOT quantum design
QSX  303 SiO2 piëzo-elektrische AT-cut kwarts sensoren	Q-Sense AB, Göteborg, Zweden	QS-QSX303	besteld via LOT quantum design
Ozon reinigingskamer	Bioforce Nanoscience, Ames (IA), USA	QS-ESA006	besteld via LOT quantum design
Atomische kracht microscoop MFP-3D Bio AFM	Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA	MFP-3DBio	AFM metingen en beeldvormingssoftware
Asylum Research AFM Software AR Versie 120804+1223	Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA	---	beeldvormingssoftware inbegrepen in Cat. Nr. MFP-3DBio
Igor Version Pro 6.3.2.3 Software	WaveMetrics, Inc., USA	---	beeldvormingssoftware inbegrepen in Cat. Nr. MFP-3DBio
BioHeater	Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA	Bioheater	Sample heater voor AFM metingen
Biolever mini cantilever,  BL-AC40TS-C2	Olympus Germany LLC, Duitsland	BL-AC40TS-C2	Voorkeurs cantilever voor AFM metingen
WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013)	Nanotec Electronica S.L., Spanje	freeware	Software voor AFM analyse
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Detergenten en overige apparatuur
azijnzuur, 100 %, p.A.	CARL ROTH GmbH+CO.KG	3738.5	Gevaar, ontvlambare en corrosief vloeibaar en damp. Veroorzaakt ernstige huidverbrandingen en oogbeschadiging.
Antifoam 204	Sigma-Aldrich Co. LLC.	A6426	Voor schuimonderdrukking
bromofenolblauw, natriumzout	Sigma-Aldrich Co. LLC.	B5525	---
Coomassie Brillant Blauw R (C45H44N3NaO7S2)	CARL ROTH GmbH+CO.KG	3862.1	---
Deoxyribonuclease II uit varkensmilt	Sigma-Aldrich Co. LLC.	D4138	Typ IV, 2.000 - 6.000 Kunitz eenheden/mg proteïne
Ethanol, 95%	VWR, Duitsland	20827.467	Gevaar, ontvlambaar
glycerine, p.A.	CARL ROTH GmbH+CO.KG	3783.1	---
Guanidine hydrochloride (GuHCl)	CARL ROTH GmbH+CO.KG	0037.1	---
Hellmanex III	Hellma GmbH & Co. KG	9-307-011-4-507	---
Zoutzuur (HCl) (37%)	CARL ROTH GmbH+CO.KG	4625.2	Gevaar; Corrosief, gebruikt voor pH aanpassing
Lysozyme uit kippeneiwitje	Sigma-Aldrich Co. LLC.	L6876	Gelyofiliseerd poeder, proteïne = 90 %, = 40.000 eenheden/mg proteïne (Sigma)