Methodenartikel
De mechanismen die de interstitiële beweeglijkheid van CD4-effector-T-cellen regelen op plaatsen van ontsteking zijn relatief onbekend. Wij presenteren een niet-invasieve benadering visualiseren en manipuleren in vitro geprimed CD4 T-cellen in het ontstoken oor dermis, waardoor studie van het dynamisch gedrag van deze cellen in situ.
Het vermogen van CD4 T-cellen om effectorfuncties uitvoeren is afhankelijk van de snelle en efficiënte migratie van deze cellen in ontstoken perifere weefsels door middel van een vooralsnog ongedefinieerde mechanisme. De toepassing van multifoton microscopie voor de studie van het immuunsysteem een werktuig om de dynamiek van immuunresponsen in intacte weefsels te meten. Hier presenteren we een protocol voor niet-invasieve beeldvorming van intravitale multifoton CD4 T-cellen in de ontstoken muisoor dermis. Gebruik van een aangepaste imaging platform en een veneuze katheter maakt de visualisatie van CD4 T-cel dynamica in de huid interstitium, met de mogelijkheid om deze cellen in real-time uitlezen via de toevoeging van blokkerende antilichamen tegen belangrijke moleculaire componenten betrokken bij motiliteit. Dit biedt voordelen ten opzichte van in vitro modellen en chirurgisch invasieve beeldvorming procedures. Het begrijpen van de paden die worden gebruikt door CD4 T-cellen voor de beweeglijkheid kan uiteindelijk geven inzicht in de basic functie van CD4 T-cellen en de pathogenese van zowel auto-immuunziekten en pathologie van chronische infecties.
De effectorfunctie van CD4 T-cellen is cruciaal afhankelijk van hun vermogen om snel een grote verscheidenheid aan perifere weefsels binnen te gaan en door te reizen om schade te detecteren, foci van infectie te lokaliseren of pathologie te veroorzaken door chronische infectie of auto-immuniteit. Hoewel de processen van homen naar ontstoken plekken1-4 en extravasatie5-7 vanuit het vaatstelsel naar weefsels goed gekarakteriseerd zijn, zijn de factoren die de interstitiële beweeglijkheid van T-cellen aansturen en reguleren nog niet gedefinieerd. De migratie van T-cellen in complexe 3D-omgevingen is in vitro bestudeerd door het gebruik van....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Alle procedures waarbij muizen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Rochester, en in strikte overeenstemming met de Animal Welfare Act en de Public Health Service Beleid inzake Humane zorg en het gebruik van proefdieren beheerd door de National Institutes uitgevoerd van Volksgezondheid, Office of Laboratory Animal Welfare.
1. Bereiding van effector CD4 T-cellen
LET OP: BALB / c TCR-transgene DO11.10 muizen die specifiek een peptide uit kippenei ovalbumine (POVA: ISQAVHAAHAEINEAGR) herkennen. Andere TCR-transgene systemen kunnen worden vervangen, met de ju....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Het vermogen om immuunreacties in situ te bestuderen zonder dat het immuunsysteem milieu essentieel bestuderen real-time interactie van T-effectorcellen met een ontstoken weefsel. Beeldvorming van het intacte oor dermis van dit protocol geschetst in figuur 1A en B, maakt de visualisatie overgedragen fluorescent gelabelde T effectorcellen in de huid interstitium. Dit maakt zowel hoge-resolutie (figuur 1C) en time-lapse (f.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Betekenis
Hier presenteren wij u een protocol voor 4D visualisatie overgedragen, antigeen-specifieke effector Th1 cellen in het intacte muizenoor dermis. Deze werkwijze biedt voordelen ten opzichte van sommige van de huidige beeldvormingsmodaliteiten om verschillende redenen. Door de beeldvorming van de ventrale oor dermis, zijn we in staat om ontharing die nodig is voor de beeldvorming protocollen waarbij andere huid websites af te zien. Hoewel ontharingsmiddelen algemeen mild, ble.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs hebben niets te onthullen.
De auteurs danken de Universiteit van Rochester Multiphoton Microscope Core faciliteit voor hulp bij het live-imaging. Ondersteund door NIH AI072690 en AI02851 naar DJF; AI114036 naar AG en AI089079 te MGO.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| BALB/c muizen | Jackson Laboratories | 000651 | Gebruikte muizen werden in eigen huis gefokt |
| DO11.10 muizen | Jackson Laboratories | 003303 | Gebruikte muizen werden in eigen huis gefokt |
| HBSS | Fisher | 10-013-CV | Meerdere equivalenten |
| Newborn Calf Serum (NCS) | Thermo/HyClone | SH30118.03 | Bij 56 °C gedurende 30 minuten gedurende verwarmd |
| Guinea Pig Complement | Cedarlane | CL-5000 | |
| anti-CD8 antilichaam | ATCC | 3.155 (ATCC TIB-211) | Antilichamen afgeleid van deze hybridoma |
| anti-MHC Klasse II antilichaam | ATCC | M5/114.15.2 (ATCC TIB-120) | Antilichamen afgeleid van deze hybridoma |
| anti-CD24 antilichaam | ATCC | J11d.2 (ATCC TIB-183) | Antilichamen afgeleid van deze hybridoma |
| anti-Thy1.2 antilichaam | ATCC | J1j.10 (ATCC TIB-184) | Antilichamen afgeleid van deze hybridoma |
| Ficoll (Fico/Lite-LM) | Atlanta Biologicals | I40650 | |
| PBS | Fisher | 21-040-CV | Meerdere equivalenten |
| EDTA | Fisher | 15323591 | |
| biotinyleerd anti-CD62L antilichaam (clone MEL-14) | BD | 553149 | |
| streptavidine magnetische scheidingskralen | Miltenyi | 130-048-101 | |
| MACS LS scheidingskolom | Miltenyi | 130-042-401 | |
| recombinant humaan IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| recombinant muis IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| recombinant muis IL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| anti-IFNg antilichaam (clone XMG 1.2) | eBioscience | 16-7311-85 | |
| anti-IL-4 antilichaam (clone 11b11) | eBioscience | 16-7041-85 | |
| RPMI | VWR | 45000-412 | |
| Penicilline/Streptomycine | Fisher | 15303641 | |
| L-glutamine | Fisher | 15323671 | |
| 2-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| ovalbumine peptide | Biopeptide | ISQAVHAAHAEINEAGR-OH peptide | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo/HyClone | SV30014.03 | Bij 56 °C gedurende 30 minuten gedurende verwarmd |
| 24-well kweekplaat | LPS | 3526 | Meerdere equivalenten |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | |
| CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| 28 G1/2 insuline spuiten, 1ml | BD | 329420 | |
| 28 G1/2 insuline spuiten, 300μl | BD | 309301 | |
| 27 G1/2 TB spuiten, 1ml | BD | 309623 | |
| 30 G1/2 naalden | BD | 305106 | |
| PE-10 medische buis | BD | 427400 | |
| cyanoacrylaat veterinair hechtmiddel (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| verwarmingsplaat | WPI | 61830 | |
| Verwarmingsplaatregelaar | WPI | ATC-2000 | |
| Waterdekenregelaar | Gaymar | TP500 | Niet langer in productie, nieuwere equivalent beschikbaar |
| waterdeken | Kent Scientific | TP3E | |
| Isofluraanelverdamper | LEI Medical | Isotec 4 | Niet langer in productie, nieuwere equivalent beschikbaar |
| isofluraan | Henry Schein | Besteld via veterinaire staf | |
| microcentrifugebuisjes | VWR | 20170-038 | Meerdere equivalenten |
| medisch plakband | 3M | 1538-0 | |
| isofluraan neusmasker | Gebouwd in eigen huis, zie Fig 2 | ||
| beeldvormingsplatform | Gebouwd in eigen huis, zie Fig 2 | ||
| gebogen pincetten | WPI | 15915-G | Meerdere equivalenten |
| schaar | Roboz | RS-6802 | Meerdere equivalenten |
| glazen dekglasjes | VWR | Meerdere equivalenten | |
| hoge vacuümvet | Fisher | 146355D | |
| wattenstaafjes | Meerdere equivalenten | ||
| delicate task doekjes | Fisher | 34155 | Meerdere equivalenten |
| Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM rechtopstaande microscoop met Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser | Olympus | bel voor offerte | |
| optische tafel met trillingscontrole | Newport | bel voor offerte | |
| 25x NA 1.05 waterimmersie objectief voor multifoton beeldvorming | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| objectiefverwarmer | Bioptechs | PN 150815 | |
| Detectiefilter kubus | Olympus | FV10-MRVGR/XR | Propriëtaire kubus, kan worden benaderd van individuele filters/dichroics |
| anti-integrine β1 antilichaam (clone hMb1-1) | eBioscience | 16-0291-85 | Azidvrij, laag endotoxine |
| anti-integrine β3 antilichaam (clone 2C9.G3) | eBioscience | 16-0611-82 | Azidvrij, laag endotoxine |
| Texas Red Dextran (70.000 MW) | Life Technologies | D-1830 |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen