Dit protocol beschrijft hoe je clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE) kunt voorbereiden en uitvoeren, een native scheidingstechniek voor niet-covalente biomoleculaire assemblages en eiwitten uit heterogene monsters die compatibel is met verschillende downstream-eiwitanalysetechnieken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
CN-GELFrEE - Clear Inheems Gel-uitgewassen vloeibare fractie Entrapment elektroforese
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Eiwitcomplexen voeren een reeks belangrijke cellulaire functies. Ophelderen van hun niet-covalente interacties en dynamiek van het grootste belang voor het begrijpen van de rol van de complexen in biologische systemen. Terwijl de directe karakterisering van biomoleculaire assemblees in de afgelopen jaren steeds belangrijker is geworden, inheemse fractionering technieken die compatibel zijn met downstream analysetechnieken, met inbegrip van massaspectrometrie zijn, zijn nodig om deze studies verder uit te breiden. Niettemin, het veld mist een high-throughput, wide-range, high-recovery scheiding methode voor het natieve eiwit assemblages. Hier presenteren we duidelijke natieve geëlueerd vloeibare fractie insluiten elektroforese (CN-GELFrEE), wat een nieuw scheiding modaliteit voor niet-covalente eiwit samenstellen. CN-GELFrEE scheiding prestatie werd aangetoond door fractioneren complexen geëxtraheerd uit muis hart. Fracties werden verzameld gedurende 2 uur en weergegeven discrete banden variërend van ~ 30-500 kDa. Een conconsistente patroon van toenemend molecuulgewicht bandbreedte werd geobserveerd, elke variërend ~ 100 kDa. Verder latere heranalyse van natieve fracties via SDS-PAGE toonde molecuulgewicht verschuift in overeenstemming met de denaturatie van eiwitcomplexen. Daarom CN-GELFrEE werd bleek het vermogen om hoge resolutie en hoge recovery natieve scheidingen op eiwitcomplexen uit een groot molecuulgewichttraject bieden, die fracties die geschikt downstream eiwitanalyses zijn.
Inleiding
De meeste biologische processen gebeurt in een cel worden bedacht door verzamelingen van eiwitten in plaats van één eiwit 1 uit te voeren. Bijgevolg, om de specifieke biologische functie van een eiwit subeenheid ontrafelen in een cel is het noodzakelijk om de structurele interacties met andere eiwitten of liganden in complexen 2 begrijpen. Echter, het bestuderen van eiwitten native, met behoud van hun niet-covalente interacties en de activiteit blijft uitdagend. Een tekortkoming van natief eiwit studies is een geschikt natief scheidingstechniek die compatibel is met verschillende stroomafwaartse eiwitanalyse technieken. Daarom heeft de recente i....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Opmerking: Deze video protocol is gebaseerd op een bijbehorende publicatie 9. Specifieke reagentia, materiaal en apparatuur noodzakelijk alle stappen in dit protocol worden beschreven zijn opgesomd in de sectie materialen. De recepten en gegevens bereiding van alle benodigde oplossingen worden gespecificeerd in Tabel 1.
1. Het gieten van Gradient Tube Gels
- Montage van de Casting System
- Met een vlam verwarmd scheermesje of scalpel, snijd een 20 ml serologische pipet langs een orthogonale doorsnede 10 cm van de bovenkant van het afgifte-uiteinde. Zorg ervoor dat het snijvlak glad is. Houd het ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
200 ug van eiwitten geëxtraheerd uit cryogeen gemalen muisharten werden native gefractioneerd in 14 fracties van 150 pl elk, met behulp van de methode CN-GELFrEE in een 1-12% T gel buis. Een hoeveelheid van 10 pl van elke fractie werd op een CN-PAGE plaatgel en zilver gekleurd. Een duidelijke afbeelding van de fractionering en resolutie verkregen met CN-GELFrEE fractionering wordt getoond in figuur 2A. Fracties werden verzameld gedurende twee uur en de gel assay toont ee.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
CN-GELFrEE is afgeleid van het natieve heldere (CN) PAGE buffersysteem dat een mengsel van anionische en neutrale wasmiddelen als dragermoleculen voor 9 molecuulgewicht-eiwitten fractionering gebruikt door een gelmatrix. De toepassing van de GN-GELFrEE om een native muis hart eiwit extract gegenereerd lage complexiteit fracties met discrete bandbreedtes met behoud van niet-covalente interacties van biomoleculaire assemblies. Vergelijking van fracties tussen CN-PAGE en reducerende SDS-PAGE toonde plaatgels m.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De WM Keck Foundation royaal verstrekte financiering voor dit werk. Dit materiaal is gebaseerd op het werk ondersteund door FAPERJ onderzoek subsidie 100,039 / 2014 van de regering van Rio de Janeiro - Brazilië voor RDM, Science without Borders beurs 88.888,075416 / 2013-00 van het Coördinatieorgaan voor de verbetering van het hoger onderwijs personeel, onder de regering van Brazilië, voor HSS, de National Science Foundation Graduate Research Fellowship onder fellowship nummer 2014171659 voor OSS, en door CNPq onderzoek subsidie 202.011 / 2012-7 van de regering van Brazilië voor LHFDVPCH is een ontvanger van een Northwestern University's Chemistry of levenspr....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| 30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | Deze oplossing is neurotoxisch. |
| 6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) | Sigma-Aldrich | A2504 | Deze chemische stof is irriterend. |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | Deze chemische stof is ontvlambaar, giftig en corrosief. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | Deze chemische stof is irriterend. |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | FLUKA | 3777 | Deze chemische stof is giftig. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120 | Deze chemische stof is giftig. |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Liquid nitrogen | Elke leverancier | n/a | Bewaar vloeibare stikstof in containers ontworpen voor laag-temperatuur vloeistoffen |
| Mouse heart | Bioreclamation LLC | MSE-HEART | |
| n-butanol | Fisher Scientific | 71-36-3 | Deze chemische stof is ontvlambaar en giftig. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78430 | Deze chemische stof is giftig. |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | Deze chemische stof is irriterend. |
| Sucrose | JTBaker | 4097 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | Deze chemische stof is ontvlambaar en irriterend. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Equipment | |||
| Gradient mixer | Hoefer | SG15 | |
| Magnetic stir | Elke leverancier | n/a | |
| Magnetic bars | Elke leverancier | n/a | Klein genoeg om in de gradietmixerkamers te passen. |
| Power supply | Bio-Rad | 164-5056 | Voltage tot 1.500 V |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 022622552 | Tot 15.000 x g |
| Materials | |||
| 15 ml conische buis | Elke leverancier | n/a | |
| 30 kDa-MWCO ultra centrifugale filter | Millipore | UFC503096 | |
| Flexibele slang | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | Ongeveer 1 m lengte |
| IJsemmer | Elke leverancier | n/a | |
| Liquid/air metalen of plastic klep. (bijv. aquarium lucht/water stroomsnelheid controle hendelklep) | Elke leverancier | n/a | Aquarium kleppen zijn compatibel. |
| Korstel en stamper | Elke leverancier | n/a | |
| Native PAGE 3-12% T slab gel | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petrischaal | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Protein low bind buis 1,5 ml | Eppendorf | 022431081 | |
| Vleesmesblad | IDL Tools | TE05-091C | |
| Geregenereerde cellulose dialyseslang 3.500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE slab gel voor elke kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| Serologische pipetten (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| Spuit (10 ml) | Elke leverancier | n/a |
Referenties
- Alberts, B. The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. <....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
