Dit manuscript beschrijft een duplex digitale PCR test die kan worden gebruikt om tegelijkertijd kwantificeren Enterococcus spp. En HF183 genetische merkers als indicatoren van algemene en menselijke-geassocieerde fecale besmetting in recreatiewater.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een duplex digitale PCR test voor gelijktijdige kwantificering van de
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dit manuscript beschrijft een duplex digitale PCR-test (EntHF183 dPCR) voor gelijktijdige kwantificering van Enterococcus spp. En het menselijk fecal-geassocieerde HF183 marker. De EntHF183 duplex dPCR (aangeduid als EntHF183 dPCR hierop) test gebruikt dezelfde primer en probe sequenties zijn gepubliceerd individuele kwantitatieve PCR (qPCR) tegenhangers. Ook worden dezelfde waterfiltratie en DNA extractie procedures uitgevoerd voorafgaand aan qPCR vóór loopt dPCR gevolgd. De duplex dPCR assay heeft verscheidene voordelen boven de qPCR assays. Het belangrijkste is de dPCR test overbodig uitvoeren van een standaardcurve en dus de bijbehorende voorspanning en variabiliteit, door directe kwantificering van de doelen. Bovendien, terwijl dubbelzijdig (dwz gelijktijdige kwantificering) Enterococcus en HF183 in qPCR vaak leidt tot ernstige onderschatting van de minder overvloedig doelwit in een monster, dPCR consistent kwantificering van beide doelstellingen slijpenhaar afzonderlijk of gelijktijdig gekwantificeerd in hetzelfde reactievat. De dPCR assay kan ook PCR remmerconcentraties die 1:59 orden van grootte hoger dan die getolereerd door qPCR worden geduld. Deze voordelen maken het EntHF183 dPCR assay bijzonder aantrekkelijk omdat het tegelijkertijd zorgt voor een nauwkeurige en reproduceerbare gegevens over algemene en humaan-geassocieerde fecale verontreiniging aard in water zonder de noodzaak om twee afzonderlijke qPCR assays werking. Ondanks de voordelen ten opzichte qPCR, de bovenste grens van de kwantificering dPCR assay met de huidige instrumentatie ongeveer vier orden van grootte lager dan die welke door qPCR. Bijgevolg is verdunning noodzakelijk voor het meten van hoge concentraties doelorganismen zoals typisch waargenomen na rioolwater morsen.
Inleiding
Kwantitatieve PCR (qPCR) methoden zijn op grote schaal gebruikt voor recreatieve monitoring van de waterkwaliteit en microbiële bron tracking-toepassingen, omdat ze sneller, flexibeler en specifiek in vergelijking met de traditionele cultuur-gebaseerde methoden. Bijgevolg qPCR wordt aanbevolen voor de verwezenlijking van snelle water monitoringsresultaten voor algemene fecale indicatoren zoals Enterococcus spp. In het herziene USEPA recreatiewater kwaliteitscriteria 1. Vele qPCR assays zijn ontwikkeld en gevalideerd voor het identificeren van bronnen van fecale verontreiniging aard in water 2. Een daarvan is de HF183 marker assays zijn ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Assay Mengsel Voorbereiding
- Maak 100 micromol / l voorraad concentraties voor alle primers in moleculair-biologische kwaliteit water en sondes in TE pH 8 buffer [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ 12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 3].
Opmerking: Probes voor de twee doelen worden fluorescent gelabeld met verschillende fluoroforen 7, zoals aangegeven in de lijst van materialen / Equipment. - Bereid master mix door het mengen, per reactie gepland, 12 pi digitale PCR-mix (2x voorraad, zie lijst van materialen / Equipment), 0,216 ul elke voorwaartse en achterwaartse primer, 0,06 ui elke fluorescente probe, en 5,016 ul....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een goede EntHF183 duplex dPCR run zou moeten resulteren in een relatief hoog aantal aanvaarde druppels (ca. 10,000-17,000) en de relatief grote verschil (ca. 5000) tussen de fluorescentie waarden voor de negatieve en positieve druppeltjes 7. Ongebruikelijk lage aantal druppels geeft waarschijnlijk problemen bij de opwekking proces druppel, en een cutoff van 10.000 druppels wordt gesuggereerd op basis van empirische gegevens uit de druppel dPCR systeem dat wo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er zijn een paar kritische stappen in het protocol. Ten eerste, het mengen van de proefmengsels kan moeilijk zijn omdat de master mix viskeuzer dan conventionele qPCR mastermengsels. Eenvoudige vortexen kan leiden tot onvoldoende menging, wat leidt tot niet-uniforme verdeling van DNA templates in de proefmengsels en vervolgens in de druppeltjes. Het mengen-by-pipetteertechniek beschreven in het protocol moet worden gevolgd om nauwkeurige dPCR kwantificering te verzekeren. Ten tweede is het belangrijk ervoor te zorgen dr.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
De auteurs hebben geen erkentelijkheden.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Low Bind Microtubes | Costar | 3207 | Voor opslag van reagentia, monsters/productie van master mixes |
| Nuclease Free Water | FisherSci | BP2484-50 | |
| TE pH 8 buffer | FisherSci | BP2473-100 | |
| Hardshell 96 Well Plate | BioRad | HSP-9601 | Voor initiële master mix en monsterinoculatie |
| Aluminum Sealing Film | BioRad | 359-0133 | Om monstersplaat te verzegelen |
| Droplet Generator | BioRad | 186-3002 | |
| Droplet Generation Oil | BioRad | 186-3005 | |
| Cartridge | BioRad | 186-4008 | |
| DG8 Cartridge Holder | BioRad | 186-3051 | |
| Gasket | BioRad | 186-3009 | |
| 20 μl pipet tips | Rainin | GP-L10F | Voor het overbrengen van monster/master mix naar cartridge |
| 200 μl pipet tips | Rainin | GP-L200F | Voor het overbrengen van druppels naar de uiteindelijke Twin.Tec plaat |
| Twin.Tec 96 Well Plate | Eppendorf | 951020320 | Voor thermisch cycliseren en lezen van de uiteindelijke druppels |
| Pierceable Heat Seal Foil | BioRad | 181-4040 | Om Twin.Tec plaat te verzegelen voor thermische cyclisering |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 181-4000 | |
| CFX96 Thermalcycler | BioRad | CFX96 en C1000 | Alleen de thermische cycliser is nodig, geen optica |
| QX100 Droplet Reader | BioRad | 186-3001 | |
| Droplet Reader Oil | BioRad | 186-3004 | |
| Droplet PCR Supermix | BioRad | 186-3024 | d.w.z. de digitale PCR-mix in manuscript |
| QuantaSoft software (v1.3.2) | Quantasoft | QX100 | Voor het bekijken, analyseren en exporteren van ddPCR-gegevens |
| Entero Forward Primer (Ent F1A) | Operon | GAGAAATTCCAAACGAACTTG | Alternatieve leverancier kan worden gebruikt |
| Entero Reverse Primer (Ent R1) | Operon | CAGTGCTCTACCTCCATCATT | Alternatieve leverancier kan worden gebruikt |
| Entero Probe (GPL813TQ) | Operon | [6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1] | Alternatieve leverancier kan worden gebruikt, maar de florofoor moet FAM zijn |
| HF183 Forward Primer (HF183-1) | Operon | ATCATGAGTTCACATGTCCG | Alternatieve leverancier kan worden gebruikt |
| HF183 Reverse Primer (BthetR1) | Operon | CGTAGGAGTTTGGACCGTGT | Alternatieve leverancier kan worden gebruikt |
| HF183 Probe (BthetP1) | Operon | [6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1] | Alternatieve leverancier kan worden gebruikt, maar de florofoor moet HEX zijn (indien VIC wordt gebruikt, moet de juiste matric-compensatie worden gekozen. |
| Positieve controle | Mengsel van E. faecalis genomisch DNA en HF183 standaardplasmide (besteld bij IDT). Voor gedetailleerde methoden voor het kweken van E. faecalis en sequenties van de bestelde HF183-plasmide, zie Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercieel verkrijgbare Enterococcus DNA-standaarden (ATCC 29212Q-FZ) kunnen ook worden gebruikt in de positieve controle in plaats van laboratorium-bereid E. faecalis genomisch DNA. |
Referenties
- Recreational Water Quality Criteria. EPA. , Office of Water. Washington, DC. 820-F-12-058. Available from: http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/ (2012).
- Boehm, A. B., et al. Performance of forty-one microbial source tracking methods: A twenty-seven lab evaluation study. Water Res.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
