Een duplex digitale PCR test voor gelijktijdige kwantificering van de Enterococcus spp. En de Human Fecal-geassocieerde HF183 Marker in Waters

Summary

Dit manuscript beschrijft een duplex digitale PCR test die kan worden gebruikt om tegelijkertijd kwantificeren Enterococcus spp. En HF183 genetische merkers als indicatoren van algemene en menselijke-geassocieerde fecale besmetting in recreatiewater.

Abstract

Dit manuscript beschrijft een duplex digitale PCR-test (EntHF183 dPCR) voor gelijktijdige kwantificering van Enterococcus spp. En het menselijk fecal-geassocieerde HF183 marker. De EntHF183 duplex dPCR (aangeduid als EntHF183 dPCR hierop) test gebruikt dezelfde primer en probe sequenties zijn gepubliceerd individuele kwantitatieve PCR (qPCR) tegenhangers. Ook worden dezelfde waterfiltratie en DNA extractie procedures uitgevoerd voorafgaand aan qPCR vóór loopt dPCR gevolgd. De duplex dPCR assay heeft verscheidene voordelen boven de qPCR assays. Het belangrijkste is de dPCR test overbodig uitvoeren van een standaardcurve en dus de bijbehorende voorspanning en variabiliteit, door directe kwantificering van de doelen. Bovendien, terwijl dubbelzijdig (dwz gelijktijdige kwantificering) Enterococcus en HF183 in qPCR vaak leidt tot ernstige onderschatting van de minder overvloedig doelwit in een monster, dPCR consistent kwantificering van beide doelstellingen slijpenhaar afzonderlijk of gelijktijdig gekwantificeerd in hetzelfde reactievat. De dPCR assay kan ook PCR remmerconcentraties die 1:59 orden van grootte hoger dan die getolereerd door qPCR worden geduld. Deze voordelen maken het EntHF183 dPCR assay bijzonder aantrekkelijk omdat het tegelijkertijd zorgt voor een nauwkeurige en reproduceerbare gegevens over algemene en humaan-geassocieerde fecale verontreiniging aard in water zonder de noodzaak om twee afzonderlijke qPCR assays werking. Ondanks de voordelen ten opzichte qPCR, de bovenste grens van de kwantificering dPCR assay met de huidige instrumentatie ongeveer vier orden van grootte lager dan die welke door qPCR. Bijgevolg is verdunning noodzakelijk voor het meten van hoge concentraties doelorganismen zoals typisch waargenomen na rioolwater morsen.

Introduction

Kwantitatieve PCR (qPCR) methoden zijn op grote schaal gebruikt voor recreatieve monitoring van de waterkwaliteit en microbiële bron tracking-toepassingen, omdat ze sneller, flexibeler en specifiek in vergelijking met de traditionele cultuur-gebaseerde methoden. Bijgevolg qPCR wordt aanbevolen voor de verwezenlijking van snelle water monitoringsresultaten voor algemene fecale indicatoren zoals Enterococcus spp. In het herziene USEPA recreatiewater kwaliteitscriteria ^1. Vele qPCR assays zijn ontwikkeld en gevalideerd voor het identificeren van bronnen van fecale verontreiniging aard in water ^2. Een daarvan is de HF183 marker assays zijn ....

Protocol

1. Assay Mengsel Voorbereiding

1. Maak 100 micromol / l voorraad concentraties voor alle primers in moleculair-biologische kwaliteit water en sondes in TE pH 8 buffer [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ ^12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 ^3].
   Opmerking: Probes voor de twee doelen worden fluorescent gelabeld met verschillende fluoroforen ^7, zoals aangegeven in de lijst van materialen / Equipment.
2. Bereid master mix door het mengen, per reactie gepland, 12 pi digitale PCR-mix (2x voorraad, zie lijst van materialen / Equipment), 0,216 ul elke voorwaartse en achterwaartse primer, 0,06 ui elke fluorescente probe, en 5,016 ul....

Results

Een goede EntHF183 duplex dPCR run zou moeten resulteren in een relatief hoog aantal aanvaarde druppels (ca. 10,000-17,000) en de relatief grote verschil (ca. 5000) tussen de fluorescentie waarden voor de negatieve en positieve druppeltjes ^7. Ongebruikelijk lage aantal druppels geeft waarschijnlijk problemen bij de opwekking proces druppel, en een cutoff van 10.000 druppels wordt gesuggereerd op basis van empirische gegevens uit de druppel dPCR systeem dat wo.......

Discussion

Er zijn een paar kritische stappen in het protocol. Ten eerste, het mengen van de proefmengsels kan moeilijk zijn omdat de master mix viskeuzer dan conventionele qPCR mastermengsels. Eenvoudige vortexen kan leiden tot onvoldoende menging, wat leidt tot niet-uniforme verdeling van DNA templates in de proefmengsels en vervolgens in de druppeltjes. Het mengen-by-pipetteertechniek beschreven in het protocol moet worden gevolgd om nauwkeurige dPCR kwantificering te verzekeren. Ten tweede is het belangrijk ervoor te zorgen dr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low Bind Microtubes	Costar	3207	For storage of reagents, samples/production of master mixes
Nuclease Free Water	FisherSci	BP2484-50
TE pH 8 buffer	FisherSci	BP2473-100
Hardshell 96 Well Plate	BioRad	HSP-9601	For initial master mix and sample inoculation
Aluminum Sealing Film	BioRad	359-0133	To seal sample plate
Droplet Generator	BioRad	186-3002
Droplet Generation Oil	BioRad	186-3005
Cartridge	BioRad	186-4008
DG8 Cartridge Holder	BioRad	186-3051
Gasket	BioRad	186-3009
20 μl pipet tips	Rainin	GP-L10F	For tansferring sample/master mix to cartidge
200 μl pipet tips	Rainin	GP-L200F	For transferring droplets to final Twin.Tec Plate
Twin.Tec 96 Well Plate	Eppendorf	951020320	For final droplets thermal cycling and reading
Pierceable Heat Seal Foil	BioRad	181-4040	To seal Twin.Tec plate before thermalcycling
PX1 PCR Plate Sealer	BioRad	181-4000
CFX96 Thermalcycler	BioRad	CFX96 and C1000	Only the thermal cycler is needed, no optics
QX100 Droplet Reader	BioRad	186-3001
Droplet Reader Oil	BioRad	186-3004
Droplet PCR Supermix	BioRad	186-3024	i.e. the digital PCR mix in manuscript
QuantaSoft software (v1.3.2)	Quantasoft	QX100	For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data
Entero Forward Primer (Ent F1A)	Operon	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	Alternative vendor can be used
Entero Reverse Primer (Ent R1)	Operon	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	Alternative vendor can be used
Entero Probe (GPL813TQ)	Operon	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM
HF183 Forward Primer (HF183-1)	Operon	ATCATGAGTTCACATGTCCG	Alternative vendor can be used
HF183 Reverse Primer (BthetR1)	Operon	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	Alternative vendor can be used
HF183 Probe (BthetP1)	Operon	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen.
Positive control			Mixture of E. faecalis genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalis and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA.