Een duplex digitale PCR test voor gelijktijdige kwantificering van de Enterococcus spp. En de Human Fecal-geassocieerde HF183 Marker in Waters

Summary

Dit manuscript beschrijft een duplex digitale PCR test die kan worden gebruikt om tegelijkertijd kwantificeren Enterococcus spp. En HF183 genetische merkers als indicatoren van algemene en menselijke-geassocieerde fecale besmetting in recreatiewater.

Abstract

Dit manuscript beschrijft een duplex digitale PCR-test (EntHF183 dPCR) voor gelijktijdige kwantificering van Enterococcus spp. En het menselijk fecal-geassocieerde HF183 marker. De EntHF183 duplex dPCR (aangeduid als EntHF183 dPCR hierop) test gebruikt dezelfde primer en probe sequenties zijn gepubliceerd individuele kwantitatieve PCR (qPCR) tegenhangers. Ook worden dezelfde waterfiltratie en DNA extractie procedures uitgevoerd voorafgaand aan qPCR vóór loopt dPCR gevolgd. De duplex dPCR assay heeft verscheidene voordelen boven de qPCR assays. Het belangrijkste is de dPCR test overbodig uitvoeren van een standaardcurve en dus de bijbehorende voorspanning en variabiliteit, door directe kwantificering van de doelen. Bovendien, terwijl dubbelzijdig (dwz gelijktijdige kwantificering) Enterococcus en HF183 in qPCR vaak leidt tot ernstige onderschatting van de minder overvloedig doelwit in een monster, dPCR consistent kwantificering van beide doelstellingen slijpenhaar afzonderlijk of gelijktijdig gekwantificeerd in hetzelfde reactievat. De dPCR assay kan ook PCR remmerconcentraties die 1:59 orden van grootte hoger dan die getolereerd door qPCR worden geduld. Deze voordelen maken het EntHF183 dPCR assay bijzonder aantrekkelijk omdat het tegelijkertijd zorgt voor een nauwkeurige en reproduceerbare gegevens over algemene en humaan-geassocieerde fecale verontreiniging aard in water zonder de noodzaak om twee afzonderlijke qPCR assays werking. Ondanks de voordelen ten opzichte qPCR, de bovenste grens van de kwantificering dPCR assay met de huidige instrumentatie ongeveer vier orden van grootte lager dan die welke door qPCR. Bijgevolg is verdunning noodzakelijk voor het meten van hoge concentraties doelorganismen zoals typisch waargenomen na rioolwater morsen.

Introduction

Kwantitatieve PCR (qPCR) methoden zijn op grote schaal gebruikt voor recreatieve monitoring van de waterkwaliteit en microbiële bron tracking-toepassingen, omdat ze sneller, flexibeler en specifiek in vergelijking met de traditionele cultuur-gebaseerde methoden. Bijgevolg qPCR wordt aanbevolen voor de verwezenlijking van snelle water monitoringsresultaten voor algemene fecale indicatoren zoals Enterococcus spp. In het herziene USEPA recreatiewater kwaliteitscriteria ^1. Vele qPCR assays zijn ontwikkeld en gevalideerd voor het identificeren van bronnen van fecale verontreiniging aard in water ^2. Een daarvan is de HF183 marker assays zijn de meest vaak gebruikt voor het identificeren van menselijke fecale verontreiniging geassocieerde ^3.

Toch kan qPCR resultaten vaak een vertekend beeld geven, omdat ze vertrouwen op de standaard curves voor de kwantificering. qPCR kwantificeert onbekende concentraties van het doel in monsters door interpolatie van hun kwantificering cyclus (Cq) uit een standaard curve die een lineair verband tussen Cq en logaritmische hoeveelheid van een reeks serieel verdunde standaarden beschrijft. Gebrek aan betrouwbare en consistente standaard referentiemateriaal kan dus sterk vertekening qPCR resultaten. Studies toonden aan dat qPCR resultaten verschilden ca. ½ log behulp standaarden van verschillende leveranciers ⁴ en 2 maal met verschillende batches van standaarden van dezelfde leverancier ^5.

Digitale PCR (dPCR) technologie kwantificeert een onbekend monster door het tellen van de frequentie van treffers bij grote aantallen miniatuur PCRs die worden gegenereerd door het verdelen van een bulk qPCR in duizenden of miljoenen uniform nanoliter of picoliter ⁶ reacties. Het wordt aangeduid als druppel digitale PCR (dwz dit artikel) of kamer digitale PCR, respectievelijk, indien de schotten in water-in-olie druppeltjes (dwz dit artikel) of kleine kamers op een chip. Een hogere concentratie van het monster zal resulteren in aanwezigheid van doel DNA(Vandaar positieve PCR) in een groter deel van de scheidingswanden, een relatie benaderd door Poisson verdeling. Als zodanig worden de binaire resultaten (positieve of negatieve PCR) genoteerd en de frequentie van positieve druppels wordt gebruikt om onbekende monster concentraties berekenen direct via Poisson benadering, waardoor de noodzaak voor een standaardkromme zoals in qPCR.

Dit binaire aard van digitale PCR kwantificering biedt extra voordelen ten opzichte van qPCR ^7. Omdat vertraagde versterking nog steeds een positieve PCR kan opleveren, dPCR kwantificering is robuuster tegen remming die amplificatie-efficiëntie vermindert. Evenzo is dPCR kwantificering niet beïnvloed door variabiliteit in Cq waarden volgens qPCR, leidt tot een hogere nauwkeurigheid van dPCR opzichte qPCR ^8-10.

Bovendien, de partitionering proces zorgt voor een zeer kleine hoeveelheid doel-DNA aanwezig in elke druppel effectief minimaliseren substraatcompetitie (in amplification van verschillende DNA-targets) die gemeenschappelijk belemmeringen voor het bereiken van dubbelzijdig afdrukken (dwz een test meet gelijktijdig twee DNA-doelen) in qPCR zijn. Als zodanig, of run in duplex of simplex (dwz één doelstelling wordt gemeten in een enkele test) dPCR produceert bijna niet te onderscheiden kwantificering van beide doelen ^7,11.

Het doel van de digitale PCR (EntHF183 dPCR) in dit artikel is om gelijktijdige directe kwantificering van de algemene fecal indicator Enterococcus spp verkrijgen. En de menselijke fecale geassocieerd HF183 marker met verbeterde nauwkeurigheid, reproduceerbaarheid en robuustheid tegen remming tov de qPCR tegenhangers. Deze test is met succes gebruikt voor het kwantificeren van fecale besmetting in milieu- zoet water, zeewater, en diverse fecaal materiaal ^7, maar kan ook worden toegepast op andere vormen van water en afvalwater. Deze test houdt grote belofte voor het analyseren van sedimenten en bodems te wijten aan hets hoge tolerantie voor remming, maar verder onderzoek nodig is vanwege de complexiteit van de inhibitor mengt in dit soort monsters.

Protocol

1. Assay Mengsel Voorbereiding

1. Maak 100 micromol / l voorraad concentraties voor alle primers in moleculair-biologische kwaliteit water en sondes in TE pH 8 buffer [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ ^12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 ^3].
   Opmerking: Probes voor de twee doelen worden fluorescent gelabeld met verschillende fluoroforen ^7, zoals aangegeven in de lijst van materialen / Equipment.
2. Bereid master mix door het mengen, per reactie gepland, 12 pi digitale PCR-mix (2x voorraad, zie lijst van materialen / Equipment), 0,216 ul elke voorwaartse en achterwaartse primer, 0,06 ui elke fluorescente probe, en 5,016 ul nuclease vrij water (uiteindelijke concentratie : 900 nM van elke primer, 250 nM elke probe). Pipet op en neer ten minste 10 keer te mengen terwijl het nemen van de nodige voorzichtigheid luchtbellen te introduceren in de oplossing.
3. Pipet 18 ul master mix (uit stap 1.2) in een gewone PCR-buis of plaat, het mengen in 6 pl DNA-template (gewonnen zoals beschreven Previously ¹³⁾ assay mengsel druppel generatie te maken. Als het uitvoeren van monsters in tweevoud, pipet 36 pi master mix en 12 pl DNA-template in elk putje. Laat de overeenkomstige repliceren putten leeg op het bord. Inclusief positieve controles (zie lijst van materialen / Equipment) en geen template controles (NTC) (dwz met moleculair-biologische kwaliteit water gebruikt als de template).
   Let op: de positieve controle is nodig om te zorgen voor de test is goed werkt en de NTC is noodzakelijk om te zorgen dat er geen verontreiniging in de plaat en de tl-basislijn later in data-analyse. Eerste keer dat gebruikers wordt aangeraden om zowel onverdund en verdund DNA-monsters te gebruiken.

2. Droplet Generation en PCR Plate Setup

1. Meng de test mengsels door pipetteren neer op ongeveer 15 keer met behulp van een multichannel pipet. Zorg ervoor dat de pipet tip blijft binnen vloeistof te voorkomen dat overtollige luchtbellen in het mengsel.
2. insert patroon 1 (met 8 putten) in een witte patroonhouder en klik op de patroonhouder dicht. Cartridge 1 is nu stevig op zijn plaats en kan niet losraken van de houder tijdens het genereren van druppels. Met behulp van een multichannel pipet voorzichtig overdracht 20 ul van assay mengsel in de middelste stand van de cassette gemarkeerd als 'Sample' zonder dat er luchtbellen.
3. Pipet in 70 pl droplet generation olie aan de linkerkant van de cassette (gemarkeerd "Olie").
4. Cartridgedeksel met een pakking zorg ervoor dat de pakking vlak en gelijkmatig gehouden door de 4 ticks naar de rand van de cartridge. Op de groene verlichte knop op de druppelgenerator te openen en plaats de cartridge. Druk nogmaals op groen verlichte knop om de generator te sluiten.
   Let op: Als de deur sluit, wordt de knop grijs wordt weergegeven, kan de deur niet worden heropend en druppel generatie begint onmiddellijk voortgezet gedurende ongeveer 1 minuut.
5. Als het doen van meer dan 8 reacties, plaats cartridge 2 in een tweedewitte patroonhouder en bereid op dezelfde wijze als cartridge 1 terwijl de druppel generatie huidige totale insteltijd bespaart.
6. Open de druppel generator deur toen de schemerige verlichte toets wordt groen aangeeft voltooiing van druppel generatie. Verwijder de witte patroonhouder met patroon 1, opzij te zetten, en plaats cartridge 2 op de druppel generator.
7. Verwijder de pakking van cartridge 1 en gooi. Voorzichtig de totale (ongeveer 40 pl) van druppels gegenereerd brengen van de derde kolom van de patroon (gemerkt 'druppeltjes) op een uiteindelijke PCR plaat (bij kamertemperatuur gehouden) voor de temperatuurcycli.
   Let op: niet unclick de witte patroonhouder als de actie kan de nieuw gegenereerde druppels breken; alleen de patroonhouder openen nadat de druppeltjes zijn overgedragen aan de uiteindelijke plaat.
8. Herhaal stap 2,1-2,7 voor extra monsters.
9. Wanneer alle druppels zijn in de laatste PCR-plaat, plaats een te doorboren isfolie deksel op de top van het bord en leg deze op een bord sealer. Stel de sealer tot 180 ° C, druk op 'Play' op de sealer en laat afdichting voor 10 sec.

3. Thermische Fietsen en Droplet Reading

1. Plaats de verzegelde plaat op de thermische cycler, die verenigbaar is met de uiteindelijke PCR-plaat gebruikt in stap 2,7 en een temperatuur ramping snelheid van 2,0 ° C / sec.
2. Run thermische programma als volgt: 10 min bij 95 ° C, gevolgd door 40 cycli van 30 sec bij 94 ° C en 60 sec bij 60 ° C, gevolgd door een 10 minuten houden op 98 ° C (optioneel: Eindhandhavingstijd bij 4 of 15 ° C).
3. Na voltooiing van de wielersport, de overdracht van de plaat naar een Droplet Reader voor automatische meting van de fluorescentie in elke druppel in elk putje. Alternatief bewaar de plaat bij 4 ° C gedurende maximaal 3 dagen vóór droplet lezen. Zorg ervoor dat de druppels op kamertemperatuur zijn voordat u verder gaat met het lezen.
   1. Open de bijbehorende software te installeren de druppel lezen. Inhet menu default 'Setup' bevat een schematische weergave van een lege plaat met 96 putjes, dubbelklikt u op goed A1 naar het menu met drie secties te openen: 'Sample,' 'Assay 1' en 'Assay 2. "
   2. In de sectie 'Sample' typt u het monster-ID in het vak 'Naam' en druk op enter of vink het vakje rechts gemarkeerd als 'Toepassen.' Klik vervolgens op de drop down menu met het label 'Experiment' en kies 'RED' (zeldzame gebeurtenis detectie) en klik op Enter.
   3. Ga naar de sectie aangeduid 'Assay 1. " In de rubriek 'Name' invullen van de test (bv Enterococcus) en klik op Enter. In het vak onder het label 'Type' klikt u op het drop down menu en kies "Channel 1 Unknown 'en klik op Enter.
   4. Ga naar de sectie aangeduid 'Assay 2. " In de rubriek 'Name' invullen van de test (bijv HF183) en klik op Enter. In het vak onder het label 'Type' klikt u op het drop down menu eend Kies 'Channel 2 Unknown' en klik op Enter. Alle informatie van Stappen 3.3.2 tot en met 3.3.4 is nu aanwezig in goed A1.
   5. Naam alle volgende putjes bevattende druppeltjes. Om de totale setup-tijd te besparen, klikt u op 'Shift' of 'Ctrl' om meerdere bronnen tegelijk te kiezen.
   6. Wanneer de digitale weergave van de plaat weerspiegelt de fysieke plaat, druk op 'OK' in de rechterbenedenhoek van het menu. In het nieuwe menu dat op de top van de plaat schematisch weergegeven, onder de rubriek 'Template' kies 'Opslaan als' en de naam en sla de plaat.
   7. Aan de linkerkant van het scherm klikt u op 'Run' en kies de juiste Dye is gevestigd in het venster pop-out "Run Options". Het verzamelen van gegevens initieert en wordt weergegeven in real-time in de software.

4. Data Analysis and Reporting

1. Wanneer de lezer klaar is en een doos verschijnt onder vermelding van 'Run Complete', klikt u op 'OK'.
   Opmerking: De zachteware geeft de definitieve gegevens bestand onder de rubriek 'Analyze' van de software. In deze visie, de software heeft alle putjes in de plaat geselecteerd en wordt standaard de '2D Amplitude' data plot.
2. Controleer de scheiding tussen de positieve en negatieve druppels. Zorg ervoor dat de fluorescentie in alle druppels in de NTC putten zijn in de buurt van de basislijn.
3. Klik op de knop 'Events'. Aan de rechterkant van de gepresenteerde histogram op het vak met de naam 'Total' en het vak met de naam "single" aan de onderkant van het totale aantal aanvaarde druppels per goed weer te geven. Exclusief eventuele putjes die <10.000 druppeltjes ⁷ door de Ctrl-toets ingedrukt en klik op de put (s) te worden uitgesloten.
4. Klik op de knop aangeduid als "1D amplitude om de fluorescerende grenswaarde van ongeveer één standaardafwijking (500-700 fluorescentie-eenheden) boven de negatieve druppels in NTC putjes beide doelen. Aan de zeer linkerkant van het scherm under de 'Auto Analyze' toont twee drempel knoppen, kiest u het pictogram om de juiste die een stevige roze horizontale lijn die door het heeft.
5. Klik in het vak aan de linkerkant van 'Set Threshold' onder elk van de amplitude grafieken en voer de juiste fluorescentie-drempelwaarden. Het doelwit concentraties in exemplaar per ul reactie worden dan automatisch berekend.
   Opmerking: De drempelwaarden hoeven niet identiek voor de verschillende doelen omvat.
6. Exporteer de resultaten in een CSV-bestand door te klikken op de knop 'Export' in de linker bovenhoek op het scherm 1D Amplitude. In het CSV-bestand, vermenigvuldig de geëxporteerde doelconcentratie met 4 om te zetten van een kopie van het doel (23S-gen van Enterococcus spp. Of de HF183 marker) per ul reactie te kopiëren van target per pl DNA-template.

Results

Een goede EntHF183 duplex dPCR run zou moeten resulteren in een relatief hoog aantal aanvaarde druppels (ca. 10,000-17,000) en de relatief grote verschil (ca. 5000) tussen de fluorescentie waarden voor de negatieve en positieve druppeltjes ^7. Ongebruikelijk lage aantal druppels geeft waarschijnlijk problemen bij de opwekking proces druppel, en een cutoff van 10.000 druppels wordt gesuggereerd op basis van empirische gegevens uit de druppel dPCR systeem dat wo...

Discussion

Er zijn een paar kritische stappen in het protocol. Ten eerste, het mengen van de proefmengsels kan moeilijk zijn omdat de master mix viskeuzer dan conventionele qPCR mastermengsels. Eenvoudige vortexen kan leiden tot onvoldoende menging, wat leidt tot niet-uniforme verdeling van DNA templates in de proefmengsels en vervolgens in de druppeltjes. Het mengen-by-pipetteertechniek beschreven in het protocol moet worden gevolgd om nauwkeurige dPCR kwantificering te verzekeren. Ten tweede is het belangrijk ervoor te zorgen dr...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low Bind Microtubes	Costar	3207	Voor opslag van reagentia, monsters/productie van master mixes
Nuclease Free Water	FisherSci	BP2484-50
TE pH 8 buffer	FisherSci	BP2473-100
Hardshell 96 Well Plate	BioRad	HSP-9601	Voor initiële master mix en monsterinoculatie
Aluminum Sealing Film	BioRad	359-0133	Om monstersplaat te verzegelen
Droplet Generator	BioRad	186-3002
Droplet Generation Oil	BioRad	186-3005
Cartridge	BioRad	186-4008
DG8 Cartridge Holder	BioRad	186-3051
Gasket	BioRad	186-3009
20 μl pipet tips	Rainin	GP-L10F	Voor het overbrengen van monster/master mix naar cartridge
200 μl pipet tips	Rainin	GP-L200F	Voor het overbrengen van druppels naar de uiteindelijke Twin.Tec plaat
Twin.Tec 96 Well Plate	Eppendorf	951020320	Voor thermisch cycliseren en lezen van de uiteindelijke druppels
Pierceable Heat Seal Foil	BioRad	181-4040	Om Twin.Tec plaat te verzegelen voor thermische cyclisering
PX1 PCR Plate Sealer	BioRad	181-4000
CFX96 Thermalcycler	BioRad	CFX96 en C1000	Alleen de thermische cycliser is nodig, geen optica
QX100 Droplet Reader	BioRad	186-3001
Droplet Reader Oil	BioRad	186-3004
Droplet PCR Supermix	BioRad	186-3024	d.w.z. de digitale PCR-mix in manuscript
QuantaSoft software (v1.3.2)	Quantasoft	QX100	Voor het bekijken, analyseren en exporteren van ddPCR-gegevens
Entero Forward Primer (Ent F1A)	Operon	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	Alternatieve leverancier kan worden gebruikt
Entero Reverse Primer (Ent R1)	Operon	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	Alternatieve leverancier kan worden gebruikt
Entero Probe (GPL813TQ)	Operon	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	Alternatieve leverancier kan worden gebruikt, maar de florofoor moet FAM zijn
HF183 Forward Primer (HF183-1)	Operon	ATCATGAGTTCACATGTCCG	Alternatieve leverancier kan worden gebruikt
HF183 Reverse Primer (BthetR1)	Operon	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	Alternatieve leverancier kan worden gebruikt
HF183 Probe (BthetP1)	Operon	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	Alternatieve leverancier kan worden gebruikt, maar de florofoor moet HEX zijn (indien VIC wordt gebruikt, moet de juiste matric-compensatie worden gekozen.
Positieve controle			Mengsel van E. faecalis genomisch DNA en HF183 standaardplasmide (besteld bij IDT). Voor gedetailleerde methoden voor het kweken van E. faecalis en sequenties van de bestelde HF183-plasmide, zie Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercieel verkrijgbare Enterococcus DNA-standaarden (ATCC 29212Q-FZ) kunnen ook worden gebruikt in de positieve controle in plaats van laboratorium-bereid E. faecalis genomisch DNA.