Methodenartikel

Isolatie en karakterisering van de Muis Antral Eicellen Gebaseerd op Hergroepering van nucleoli chromatine Organization

DOI:

10.3791/53616

⸱

7 januari 2016

 , 
1Research Center for Regenerative Medicine, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, 2Department of Biology and Biotechnology "L. Spallanzani", University of Pavia

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor de karakterisering van muis antral eicellen gebaseerd op nucleolair organisatie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en snelle methode om muis antrale GV (Germinale Vesikel) eicellen te isoleren en te karakteriseren als in staat (SN, Surrounded Nucleolus) of niet in staat (NSN, Not Surrounded Nucleolus) om zich na in vitro rijping (IVM) en in vitro bevruchting (IVF) tot de blastocyst fase te ontwikkelen. Het maakt gebruik van Hoeschst33342 (of een andere DNA intercalating kleurstof) die zich kan binden aan het heterochromatine van de nucleolus en een ring toont in de SN eicellen of niet, zoals in de NSN eicellen. Dit vertegenwoordigt de gemakkelijkste en snelste manier om zowel antrale eicellen te sorteren die uiteindelijk kunnen worden gebruikt voor IVM of IVF procedures.

Kort samengevat, bestaat het protocol uit de volgende stappen: hormooninjectie om follikelgroei te stimuleren; isolatie van de eicellen in het GV-stadium uit het antrale compartiment door de ovarium te prikken met een steriele naald; voorbereiding van dunne glazen pipetten voor het pijpetten met de mond van de eicellen; sortering van de eicellen met Hoechst33342 bereid op een supravitale concentratie; IVM, IVF of enige andere moleculaire/cellulaire analyse.

Helaas zijn er nog maar weinig bewijzen om SN en NSN eicellen te sorteren met behulp van minder invasieve technieken. Indien en wanneer ze eenmaal worden geïdentificeerd, kunnen ze mogelijk worden toegepast op menselijke geassisteerde reproductieve technologieën, hoewel er verschillende aspecten zouden moeten worden aangepast. Tot op heden heeft deze techniek potentiële implicaties om IVM en IVF succesvolle procedures aanzienlijk te verhogen, zowel bij bedreigde als soorten met economisch belang.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antrale volgroeide eicellen (GV, kiemblaasje) geïsoleerd uit de antrale compartiment van het ovarium worden routinematig gebruikt voor verschillende doeleinden zoals bijvoorbeeld het onderzoek van de moleculaire en cellulaire mechanismen achter in vitro rijping tot metafase II stadium.

Ondanks hun mooie uiterlijk meest antral eicellen, maar niet alle, zijn in staat om de meiose te voltooien en bereiken de blastocyststadium; in feite, vele zoogdiersoorten, waaronder mensen 1,2, ongeveer 30% van hen arrestatie hun ontwikkeling op de 2-cel stadium, wanneer bevruchting plaatsvindt 3-5. Tot op heden zijn enkele parameters die worden gebruikt om onderscheid te maken tussen de eicellen in staat om de embryonale ontwikkeling van die daartoe niet in staat te houden.

Bijvoorbeeld, cresyl blauw kleuring (BCB) is een valide methode om de oöcyten basis van de activiteit van glucose-6-fosfaat-dehydrogenase sorteren, hoewel het nut van deze sorteermethode verband met BCB + of BCB- kleuringnog laboratorium afhankelijk 6-8.

Een andere bekende methode woont in hun chromatine organisatie: als gekleurd met elke DNA intercalerende kleurstoffen (zoals Hoechst33342), 70% van de antrale eicellen laten een dye-positieve ring rond de nucleolus en heten Omringd Nucleolus (SN), terwijl de resterende 30% tonen een gevlekte positieve signalen en heten niet omringd Nucleolus (NSN) 3-5. Recent toonden we aan dat het ontbreken van cytoplasma roosters 9 (CPLS belangrijke opslagplaatsen voor maternale mRNA en ribosomen in zowel zoogdieren eicellen en embryo's) 10 en de down-regulatie van MATER (essentieel voor CPLS vorming 11), samen met de aanwezigheid van vetdruppels in hun cytoplasma 9,12, kunnen andere oorzaken verband met de NSN eicellen onvermogen verder komt dan het 2-cel stadium.

Helaas kan paar technieken worden toegepast op antrale SN en NSN eicellen en sorteren,Daarom zou de ontwikkeling van een minder invasieve werkwijze (zonder nucleaire kleuring, fixatie of manipulatie met de mond pipetten) zeer belangrijk geworden om de tarieven van menselijke en dierlijke embryo ontwikkeling.

In dit artikel hebben we detail de eenvoudige en snelle protocol dat wordt gebruikt om ad soort SN en NSN antrale eicellen van vrouwelijke muizen te isoleren en het is gericht tot alle wetenschappers geïnteresseerd in de studie van de vrouwelijke gametogenese, eicel maturatie en embryo-ontwikkeling.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol wordt uitgevoerd in overeenstemming met de grondbeginselen van de Europese (EU-63/2010) en Italiaanse (26/2014) wetten ter bescherming van dieren gebruikt voor wetenschappelijk onderzoek. Cervicale dislocatie euthanasie wordt gebruikt voor de eierstokken isolatie en het wordt uitgevoerd door deskundige en getraind in het goedgekeurde protocol met betrekking tot dit onderzoek vermelde personen.

1. Dieren

  1. Onderhouden volwassen 3- tot 6-weken oude vrouwelijke muizen in een kamer met gecontroleerde temperatuur en vochtigheid (met fasen van 12L: 12D en gevoed ad libitum).
  2. Injecteren muizen intraperitoneaal met 2,5 IE Pregnant Mare Serum gonadotropine (PMSG) om folliculaire groei te stimuleren door het nabootsen van het effect van follikel stimulerend hormoon (FSH). Isoleer de eierstokken voor antral eicellen verzameling 48u later. Euthanaseren de vrouwelijke muis die eerder geïnjecteerd met PMSG, volgens uw institutionele richtlijnen.
  3. Snel verwijdert de eierstokken van de lichaamsholte en plaats ze in de petrischaal containing M2 medium voor latere eicellen isolatie (zie paragraaf 3).
    1. Een insnijding op de huid die de buikwand gevolgd door een snede in het peritoneum door steriele dissectie scharen. Open de incisie de buik bloot, zet de darmen enerzijds met steriele pincet en lokaliseren van de eileiders, die een V-vorm vanuit de blaas.
    2. Let op de eierstokken onder de nieren gelegen. Houd elke buis met een steriele pincet en een kleine insnijding op de bodem van de eierstokken om hen vrij. Meng beide eierstokken op de bodem van een petrischaal die vooraf geëquilibreerd medium.

2. Hormoon Voorbereiding

  1. Verdunnen PMSG (verkrijgbaar in verschillende concentraties voorraad) met een steriele isotone zoutoplossing om een ​​werkende concentratie van 2,5 IE hormoon per 0,1 ml te verkrijgen voor een passende injectie volume.
    OPMERKING: Hormoon oplossingen dienen hoeveelheden verdeeld in 0,5 ml buisjes en opgeslagen bij -20 ° C tot de dag van gebruik. Houd niet verdunde hoeveelheden van meer dan drie maanden bij -20 ° C. Eenmaal ontdooid, als seriële injecties worden uitgevoerd, slaan de fracties van hormoon-oplossingen bij 4 ° C en gebruik ze binnen 4 dagen.

3. Antral Eicellen Isolatie

Voor een goede eicellen isolatie:

  1. Equilibreren M2 medium 13 (M2) bij 5% CO2 en 37 ° C gedurende ten minste 1 uur voordat oöcyten isolatieprocedure. Bereid twee petrischalen (35 mm x 10 mm), een met 1 ml M2 ovarium perforatiepatroon en de tweede met kleine druppels (20 pl) van M2 bedekt met minerale olie (~ 1,5 ml) van oöcyten maakt u na isolatie van de ovarium (zie 3,4-3,6). Houd zowel petrischalen in de incubator bij 5% CO2 en 37 ° C tot klaar om te worden gebruikt.
  2. Gebruik een stereomicroscoop bij oöcyten isolatieprocedures.
  3. Bereid dunne mond glazen pipetten om de eicellen stretchfolie verzamelenhing glazen Pasteur pipetten horizontaal gehouden (die de uiteinden van de pipet met beide handen), over een verticale vlam uit de bunsenbrander (figuur 1).
    1. Zodra het glas begint te smelten, nemen de pipet uit de vlam en het uitvoeren van een snelle trekken beweging om de gewenste pipet te verkrijgen. Stevig knip het overtollige glas aan de smalle punt van de pipet met nagels aan de lengte en de diameter van de inwendige capillair passen. Controleer of de dunne capillaire een inwendige diameter van ~ 100 urn, iets groter dan de diameter van de eicel (~ 80 urn).
    2. Om mond pipet, sluit het ene uiteinde van de aspirator buis naar de getrokken pipet met behulp van een geschikte tip en plaats het andere uiteinde in de mond, het veiligstellen van het met de tanden.
  4. Verzamel de eierstokken met steriele pincet en deponeren op de bodem van een celkweek petrischaal (35 mm x 10 mm). Bedek ze met 1 ml M2 vooraf geëquilibreerd bij 37 ° Cen 5% CO 2 (Figuur 2).
  5. Voorzichtig doorboren het antrale follikels van de eierstokken met een insulinespuit steriele naald antrale eicellen release in M2 (figuur 3).
  6. Voorzichtig mond pipet oöcyten door een nauwe Pasteur pipet follikelcellen en andere mogelijke weefselafval (figuur 4A) verwijderen en regelen ze op de bodem van kleine druppeltjes (20 pl) van M2 bedekt met minerale olie geschikt voor embryokweek (voorheen bereid Figuur 4B).
    Opmerking: Het is belangrijk om alle cumuluscellen bevestigd aan de zona pellucida van de oöcyten door continue pipetteren verwijderen door verscheidene en verschillende druppels M2. Voer deze stap zo snel mogelijk veranderingen in de pH van het medium te voorkomen.

4. Antral Eicellen kleuring met Hoechst33342

OPMERKING: Antral eicellen kunnen worden onderscheiden in SN (Omgeven Nucleolus), NSN (Niet Omringd Nucleolus) ofin andere tussenvorm vanuit hun chromatineorganisatie na kleuren met supravital concentratie Hoechst33342 (of andere merkers voor specifieke basen AT) 14. In feite, de oöcyten SN tonen een Hoechst-positieve ring rond de nucleolus terwijl de NSN niet, vandaar de naam.

Voor een goede eicellen vlekken:

  1. Breng de oöcyten met een mond pipet in druppels Hoechst33342 (20 ui) verdund in M2 bij supravital concentratie van 50 ng / pl gedurende 10 min in het donker.
  2. Na de incubatie met Hoechst33342, overbrengen elke afzonderlijke eicel met een mond pipet op de bodem van kleine druppels (5 pl) van M2 bedekt met minerale olie, voor het sorteren op basis van chromatine organisatie (SN of NSN). Gebruik een fluorescentiemicroscoop uitgerust met Hoechst33342 filter (emissiegolflengte 486 nm) om het chromatine configuratie van de oöcyten te visualiseren.
    Opmerking: Afhankelijk van het type fluorescentiemicroscoop gebruikt, it kan het noodzakelijk om glazen bodem petrischaal te gebruiken voor het verwerven geworden. De confocale microscopie Olympus FluoView Fv10i wanneer uitgerust met een specimen houder voor 35 mm schaal vereist slechts glazen bodem-gerechten voor het verwerven, met een 0,17 mm standaard dikte en een bereik 0,13-0,21 aanvaardbaar mm.
  3. Prikkelen de oöcyten gedurende maximaal 5-10 sec, waarschijnlijk voldoende om de aanwezigheid of afwezigheid van een ring rond de nucleolus (figuur 5) te visualiseren.
  4. Na het sorteren cultuur antrale SN en NSN eicellen in M2 bij 5% CO2 en 37 ° C in vitro rijping induceren of houd ze in geschikte buffers voor moleculaire of cellulaire analyses.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De volgende foto's tonen de methode die wordt gebruikt om antrale eicellen te isoleren van de muis eierstokken, vanaf pipetten voorbereiding tot het sorteren van de eicellen 'door middel van Hoechst33342. Deze methode is heel eenvoudig en kan in een laboratorium met een CO2 incubator, een stereomicroscoop en een fluorescentiemicroscoop uitgerust met de juiste filter voor de waarneming van de Hoechst33342 uitgevoerd Figuur 1 toont de eerste stap pipet p...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de methode die wordt gebruikt om te isoleren en te classificeren muis antral GV eicellen. Er zijn geen specifieke kritische stappen te onderstrepen, met enkele uitzonderingen. Ten eerste: deze procedure moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd om: a) behoud van de vitaliteit van de eicellen en b) voorkomen pH veranderingen in het gebruikte medium. Ten tweede: eicellen moeten kort worden opgewekt (5-10 sec) om Hoechst33342 chromatine schade en daaropvolgende dood van de oöcyten te voorkomen, vooral...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.M. en C.A.R. erkennen de financiële steun van het Ministero della Salute, Ricerca Finalizzata/giovani ricercatori anno 2009 van de Fondazione IRCCS Ospedale San Matteo, Pavia (I). M.M en C.A.R. willen Marianna Longo bedanken voor haar hulp bij het voorbereiden van de afbeeldingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
PMSGSigmaG4527
EmbrioMax M2MilliporeMR-015-PD
Hoechst33342Thermo Scientific62249
Mineral OilSigmaM8410
Cell Culture Dish 35mmx10mmCorning430165
µ-Dish 35mm, high glass bottomIbidi81158
Pipette Pasteur BorosilicateCorning7095D-9
Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettesSigmaA5177

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data). Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).
  2. Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro. Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).
  3. Mattson, B. A., Albertini, D. Oogenesis: Chromatin and microtubule dynamics during meiotic prophase. Mol. Reprod. Dev. 25 (4), 374-383 (1990).
  4. Debey, P., Szollosi, M. S., Szollosi, D., Vautier, D., Girousse, A., Besomber, D. Competent mouse oocytes isolated from antral follicles exhibit different chromatin organization and follow different maturation dynamics. Mol. Reprod. Dev. 36 (1), 59-74 (1993).
  5. Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organisation during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (1-2), 479-485 (1995).
  6. Wu, Y. G., et al. Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining: a study using the mouse model. Cell Res. 17, 722-731 (2007).
  7. Opiela, Y., Kątska-Książkiewicz, L. The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP). Reproductive Biol. 13, 177-183 (2013).
  8. Labrecque, R., Sirard, M. A. The study of mammalian oocyte competence by transcriptome analysis: progress and challenges. Mol. Human Reprod. 20 (2), 103-116 (2014).
  9. Monti, M., Zanoni, M., Calligaro, A., Ko, M. S., Mauri, P. L., Redi, C. A. Developmental arrest and mouse antral Not-Surrouded Nucleolus oocyte. Biol. Reprod. 88 (1), 1-7 (2013).
  10. Yurttas, P., et al. Role for PADI6 and the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes and translational control in the early mouse embryo. Development. 135 (15), 2627-2636 (2008).
  11. Li, L., Baibakov, B., Dean, J. A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis. Dev. Cell. 15 (3), 416-425 (2008).
  12. Ami, D., et al. FT-IR spectra signatures of mouse antral oocytes: molecular markers of oocyte maturation and developmental competence. Biochim. Biophys. Acta. 1813 (6), 1220-1222 (2011).
  13. Fulton, B. P., Whittingam, D. G. Activation of mammalian oocytes by intercellular injection of calcium. Nature. 273 (5658), 149-151 (1978).
  14. Luttmer, S. J., Longo, F. J. Examination of living and fixed gametes and early embryos stained with supravital fluorochromes (Hoechst 33342 and 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide). Gamete Res. 15 (3), 267-283 (1986).
  15. Monti, M., Redi, C. A. The biopolitics of frozen embryos. Int. J. Dev. Biol. 55, 243-247 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Hoechst 33342 kleuringprepareren van mondpipettenisolatie van oocytenin vitro maturatiein vitro fertilisatieomringde nucleolusniet omringde nucleolusfolliculaire punctie

Gerelateerde artikelen